These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

הצהרת אתיקה: דגימות רקמה ופלזמה אנושיות זיהו-דה התקבלו מהמרכז הרפואי הנדריק תחת מועצה לביקורת מוסדית אישרה פרוטוקול. 1. תוספת של Biotinylated נוגדן הערה: הניטור של שלב זה הוא אופציונאלי. ראה פרוטוקול חלופי אם לא ניטור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג צלחות נגזרות מצופה avidin זמינות מסחרי (ראה חומרים וציוד טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נאגר מלוח פוספט 50 μl pH (PBS) 7.2 לבארות. הערה: Preincubate PBS על 28 מעלות צלזיוס כדי למזער משמרות תהודה קשורות טמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת סורק המבדק פתוחה ובצעו את אשף ההתקנה כדי להגדיר את ההליך ניסיוני הכולל מבחר של כדורי סרק, סטנדרטים ודגימות בפריסת הצלחת, הגדרת טמפרטורה (28 ° C), מספר הסריקות לדקה (1), ואורכו של הניסוי ( 150 דק &#39;כדי להתאים לשלבי הכנה של). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת assay מוכנה לסורק המבדק ללא תווית ולהתחיל בסריקה הראשונה. כאשר הסריקה הראשונה היא שלמה, בחר &quot;התייחסות עצמית כדי להתחיל&quot;. נקודת ההתחלה היא הקבוצה הראשונית של סריקות שנאספו בתחילת הניסוי. אם זה הקריאה הראשונה בוצעה על הצלחת הספציפית הזה, לאפשר הסורק לרוץ לאזן טמפרטורה ולמנוע סחף בתחילת מחקר. ראה איור 2 לצילום מסך של בסיס ואחריו תוספת מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תחילת המחקר התייצבה, או לפחות 5 סריקות, להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS על ידי הצפת השוק בכיור ולהוסיף נוגדן biotinylated 50 RL21A μl ב[ 10 מיקרוגרם / מיליליטר בpH PBS 7.2] לכל אבל בארות שליטה על הצלחת. הוסף 50 μl PBS לבארות שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה עד שהגיעה לרוויה, כ -1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף<html> צלחת 3 פעמים עם 200 μl / גם מלוח Tween פוספט שנאגרו + 0.05% 20 (PBST) ואחריו 3 שטיפות עם 200 μl / גם PBS pH 7.2. חזור עם PBS. הקש PBS העודף מצלחת על מגבות נייר לפני המעבר לשלב הבא. הערה: ניתן לבצע צעד זה על מכונת כביסה צלחת אוטומטית או לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 200 PBST μl על ידי השלכת נוזל לתוך כיור והחלפת PBST עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl pH 7.2 PBS לכל הבארות הפעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה לפקח תהודת פוסט-לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לקרוא ולהוציא את הצלחת. </li></ol> פרוטוקול חלופי לשלב 1: <ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן biotinylated 50 RL21A μl ב[ 10 מיקרוגרם / מיליליטר PBS] לכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1.5 שעות או הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 200 μl / גם אחרי PBST על ידי 3 שטיפות עם 200 μl / גם PBS כמו בשלב 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. תוספת של חומר אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולהוסיף 50 μl לכל טוב של חיץ assay המתאים. עבור assay זה, סרום אנושי רגיל זמין מסחרי שימש 01:20 מדולל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת סורק המבדק פתוחה ובצע את אשף ההתקנה להגדיר הליך ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחת לתוך סורק המבדק ולהתחיל בנקודת ההתחלה לקרוא. אם זה הקריאה הראשונה בוצעה על הצלחת הספציפית הזה, לאפשר הפעלת הסורק לאזן טמפרטורה ולמנוע סחף בתחילת מחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תחילת המחקר התייצבה, או לפחות 5 סריקות, להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ assay מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות ספייק עם HLA * 02: 01 מונומר נושאים רלוונטי (FLSL) או פפטידים לא רלוונטיים (SLLV, YLEV, או KVL) בריכוזים הנע בין [.625-10 מיקרוגרם / מיליליטר] במאגר assay. הוסף 50 μl של סטנדרטים לבארות שליטה בצלחת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של אנליטי במאגר assay לדוגמאבארות של הצלחת. עבור assay זה, ממוסמר סרום אנושי זמין מסחרי היה בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה עד שהגיעה לרוויה, כ 30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 200 μl / גם אחרי PBST על ידי 3 שטיפות עם 200 μl / גם PBS כמו בשלב 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ assay 50 μl לכל הבארות הפעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה לפקח תהודת פוסט-לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לקרוא ולהוציא את הצלחת. הערה: חיץ assay יכול להיות PBS, תקשורת ותרבות רקמות, או בסרום אנושי בדילול 01:20 בPBS בהתאם למטרה של assay. </li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח באמצעות תוכנת סורק המבדק או לייצא קבצי נתונים גולמיים לתוכנת ניתוח סטטיסטית מועדפת. תוכנת סורק המבדק באופן אוטומטי את העקומה מחייבת המבוססת עלפריסת צלחת סיפקה במהלך התקנה ניסיונית. הערה: אם אינך משתמש בתוכנת סורק המבדק לניתוח, בצע את השלבים 3.2-3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר תחילת המחקר וביקורת שלילית מכל נקודת נתונים שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הממוצע וסטיית התקן לבארות לשכפל בכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור גרף של העקומה מחייבת או נתונים נקודת סיום בחרו לגרפים בר. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

המחברים, דברה Wawro Weidanz ורוברט מגנוסון, הם בהתאמה מנכ&quot;ל ומנהל טכנולוגיה ראשית בIncorporated חיישני התהודה, אשר מייצר את צלחות קורא וassay צלחת המבדק משמשות במאמר זה.

השיטה המתוארת במסמך זה מציגה מערכת הקרנת סמן ביולוגי לאבחון הסרטן שיאפשר איתור מהיר של מתחמי פפטיד / HLA מסיסים בדגימות סרום, פלזמה, שתן או רוק מטופל בתפוקה גבוהה 96 או בפורמט 384 גם. מערכת assay זה ניצול קולט תא T מחקה נוגדנים חד-שבטיים ומערכת זיהוי ללא תווית חותכת את זמן ניתוח לשעה פחות מ 1 לעומת 3.5 שעות על ידי ELISA הקונבנציונלי. גישת תפוקה גבוהה זו מאפשרת ריבוד מהיר של חולים לניסויים קליניים לחיסוני סרטן טיפוליים או תרופות ביולוגיות. שיטות קיימים לגילוי מטרות מחלה אלה דורשים טיהור זיקה וHPLC-MS / MS של דגימות מטופל, תהליך שגוזל זמן ומסורבל. למרות ששיטה זו היא נוחה לטכניקות ELISA קונבנציונליות, קיים חשש כי ריאגנטים זיהוי משניים כגון נוגדני microglobulin אנטי-β2 יכולים לשנות את המבנה של HL המתהווהמולקולה ומעכבות מחייבת זיהוי הגבלת TCRm. זיהוי ללא תווית מקל חששות אלה. הליך זה יכול להיות שונה לשימוש במערכות ללא תווית אחרות כגון מערכת תהודת plasmon פני השטח. עם זאת, זה יפחית באופן משמעותי את יכולות התפוקה גבוהות יותר בהשוואה למערכת המבדק שימשה במחקר זה. פרוטוקול זה יכול להיות שונה באופן יעיל לגילוי של סמנים ביולוגיים שאינו HLA בסרום ופלזמה חולה עם דבקות בכמה שלבים קריטיים. ניטור של תהליך ציפוי נוגדן הראשוני מומלץ לאופטימיזציה של פני השטח, כמו &lt;משמרת 200 בערב צפוי לגרום לאות נמוכה לצעד זיהוי שלאחר מכן. קוראים תחילת המחקר ולאחר שטיפה-שימושיים לניתוח נקודת הסיום כשפע של חלבונים בסרום עלול להסוות מחייב של אנליטי ריכוז נמוך. לבסוף, שינויי הטמפרטורה של דגימות יכולות לגרום גם וריאציה גם ל. מומלץ כי כל הדגימות מראש מודגרותד בקר טמפרטורת יחידת biosassay ללא תווית להיות מוגדר ב2-3 מעלות צלזיוס מעל לטמפרטורת חדר. יש לאפשר דגימות בקירור מספיק זמן כדי להגיע לטמפרטורת ההפעלה. שינויים עתידיים של פרוטוקול זה יכללו ריבוב של TCRm על פני השטח הצלחת. מערכת המבדק היא כיום מקובל תצפית של בארות בצפיפות של לפחות 8-Plex. על ידי החדרת 4-8 TCRm היטב כל אחד, בכל כרכי מדגם בדיקה מופחתים ומאפשר איסוף נתונים מורכבים יותר ויותר למטופל. יכולת זו יכולה עוד ליידע את החולים לגבי אפשרויות טיפוליות.

דגימות הכיתה אנטיגן אני יקוציט האדם (HLA) פפטידים של 8-11 חומצות אמינו באורך נובעות משפלת proteasomal של רפרטואר החלבון תאיים ומציג פפטידים אלה על פני השטח של כל תא גרעיני 1,2. המורכב HLA הוא &quot;הסמן הביולוגי של הטבע&quot;, המציין את בריאותו של כל תא (איור 1) לימפוציטים מסוג T במחזור ציטוטוקסיות (CTL). הכרה בתוצאות פפטידים מחלה קשורה בחיסול של התא הפוגע בCTL. לפיכך, התגובה החיסונית אדפטיבית היא יעילה מאוד במניעת זיהום וגידול ויראלי. עם זאת, המערכת החיסונית מפעילה לחץ אשר לעתים קרובות מקדם בחירה לאיתור וירוסים או גידול מסוגל להתחמק תגובת CTL יעילה. קולט T-cell מחקה (TCRm) נוגדנים חד-שבטיים (מבז) אשר מזהה פפטיד / HLA-ספציפיים * 02: 01 מתחמים כגון אלה נגזרים מחלבונים הקשורים לסרטן השד, גורם מעכב הגירת מקרופאג (MIF19-27) 3 וNY-ESO 157-165-1, לאפשר זיהוי והרס של תאי סרטן השד בהעדר אנטי גידול יעיל CTL תגובת 4,5. עבודת נציג זה מתמקדת בHLA-A * 0201 המולקולה, אשר באה לידי ביטוי בשיעור של עד 30% מהאוכלוסייה. עם זאת, זיהוי של קומפלקסי HLA / פפטיד רלוונטיים אחרים, ואחריו את הייצור של TCRm מאפשר הפיתוח חיסוני ממוקדים ואבחון מחלה נלווית, הרחבת השירות של עבודה זו לאוכלוסייה רחבה בהרבה. חלק ממתחמי פפטיד / HLA מחויבים לתא השטח משתחרר לפלזמה. בשל האופי המורכב ביותר של פפטיד / בריכות HLA, שיטות קיימים לכרייה immunopeptidome לסמנים ביולוגיים HLA נלווים נמצאים זמן רב. תהליך זה דורש טיהור הזיקה של HLA המסיס מפלזמה, הפרדה של פפטידים הקשורים HLA על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה שלב הפוך(RP-HPLC) ורצף הפפטיד על ידי ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) 6,7. למרות שתהליך זה הוא אפשרות מעשית לגילוי מטרות טיפוליות חדשניות, זה תהליך מסורבל ככלי אבחון לוויה למטרות הקשורות HLA כבר בחיסון הטיפולי או הצינור ביולוגי 8-10. TCRm מכוון נגד מטרות אלה מספקות כלים לפיתוח אבחון לוויה מהיר שנועדו stratifying חולים לניסויים קליניים רלוונטיים ולספק אפשרויות טיפוליות מושכלות יותר. בעבודה זו, מערכת הקרנת סמן ביולוגי פריצת דרך לאבחון הסרטן מוצגת אשר מנצלת TCRm ומערכת המבדק ללא תווית העוקבת אחר אינטראקציות ביולוגיות בצעדי עיבוד מינימאליים. מערכת המבדק ללא תווית מבוססת על שיטה, אשר מנצלת את אפקט תהודה המודרך במצב (GMR) שמתרחש בתיל מוליך גל דיאלקטרי 11-14. כאשר אנשי קשר בפס רחב אור דיפרקטיביתצורם בלוחות דרושים למערכת זו, שני אורכי גל מסוימים באים לידי הביטוי. האינטראקציה מחייבת בין קולט משותק ויגנד הוא פיקוח בזמן אמת על ידי מעקב משמרת גל התהודה עם מנתח ספקטרום 12. פסגות תהודה נפרדות להתרחש אירוע TE (וקטור חשמלי רגיל למטוס של שכיחות) וTM (וקטור מגנטי רגיל למטוס של שכיחות) מצבי קיטוב מתן נקודות נתונים מרובים שעלול להגדיל את דיוק זיהוי 11,14. שימוש בצלחות מראש רגישות-נוגדן במערכת assay ללא תווית זו, זמן ריצת assay עם ניתוח הנתונים הוא כ -45 דקות. בנוסף, ניתן נחקרו דגימות חולים מרובות בפורמט 96 או 384 גם, יתרון ברור על פני פורמט המבוסס HPLC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

על פי האגודה האמריקנית לסרטן, יותר מ -200,000 נשים יאובחנו עם סרטן שד פולשני בכל שנה וכ -40,000 ימותו מהמחלה. כיתת אנטיגן לויקוציטים האנושי (HLA) אני דגימות פפטידים הנגזרים משפלת proteasomal של חלבונים תאיים ומציג קטעים אלה על פני התא לחקירה על ידי לימפוציטים במחזור T ציטוטוקסי (CTL). דור של לחקות קולט T-cell (TCRm) נוגדנים חד-שבטיים (מבז) שיכיר בסרטן השד פפטיד / HLA-ספציפי * 02: 01 מתחמים כגון אלה נגזרים מגורם הגירת מקרופאג מעכב (MIF 19-27) וNY-ESO- 1 157-165 מאפשר זיהוי והרס של תאי סרטן השד בהעדר תגובת CTL אנטי גידול יעיל. מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאי סרטן שד ומייצגים סמנים לסרטן שעשוי להיות רלוונטיים. בעבודה זו, מערכת הקרנת סמן ביולוגי פריצת דרך לטיפול בסרטן אבחוןs שילוב קולטן תא T נוגדנים חד-שבטיים לחקות בשילוב עם רומן, biosensor ללא תווית ניצול טכנולוגיית חיישן תהודה מודרכת במצב (GMR) מוצג. איתור של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד&quot;א MB-231, זינקו בסרום אנושי, והפלזמה חולה הפגינה. ההשפעה על עבודה זו יכולה לחולל מהפכה ברפואה מותאמת אישית באמצעות פיתוח של אבחון מחלה נלווה עבור חיסוניים ממוקד.

סט נציג של ניסויים בוצע באמצעות TCRm, RL21A המאופיין היטב, נוגדן חד שבטי IgG2a עכברי שדווקא מכיר בפפטיד (MIF 19-27 או FLSL) בהקשר של HLA-A * 02: 01 מולקולה 3. מונומר מקור פפטיד / HLA, כמו גם מונומר HLA לא רלוונטי 15, שימש כדי להדגים את ההליך המתואר. איור 3 ממחיש את פורמט assay. RL21A הוא ספציפי למונומר FLSL / HLA עם תגובתיות צלב קטנה עם פפטיד האחר / HLA קומפלקסי 3. ייחוד זה סכם שימוש במערכת ללא תווית המבדק (איור 4). הרגישות של מערכת המבדק ללא תווית לצורך הניסוי הזה היא בטווח של ננו-מולר הנמוך כפי שנקבע על ידי טיטרציה של נוגדני RL21A על FLSL המשותק / מונומר HLA (איור 5). למרות שאות הרקע היא גדלה באופן משמעותי בדגימות סרום, זהזיהוי pecific של מונומר FLSL / HLA בסרום אנושי ממוסמר מושגת באיור 6 ומפל ריכוזים הוא בקלות להבחין בדוגמאות אלה. לבסוף, supernatants משורת תאי מד&quot;א MB-231, הראה בעבר להציג את FLSL / HLA-A * 02: 01 המולקולה, מוצגים להכיל מונומר FLSL המסיס משתמש בפלטפורמה זו תווית חופשית assay (איור 7). בנוסף הבא של מונומר FLSL / HLA מגביר את האות בRL21A (איור 7). בשל הרגישות של המערכת, גם לווריאציה גם כוללים משמרות תהודה שליליות יכול להתרחש כתוצאה מתנודות טמפרטורה כפי שניתן לראות כפונקציה של סטיות תקן באיורים 4 ו -5. ניתן להפחית באופן דרמטי על ידי וריאציות אלה מראש דגירה של כל הדגימות וקורא צלחת המבדק בטמפרטורה לחרוג מעט מטמפרטורת חדר (כלומר, 28 ° C). באיור 8, בקצרה, 96&quot;טוב צלחות קלקר היו מצופות [10 מיקרוגרם / מיליליטר] של RL21A לשעה 2 בטמפרטורת חדר, נשטפה עם PBST, חסמה עם 0.5% חלב דל שומן, לשטוף עם PBST, וטופחו במשך 2 שעות בטמפרטורת חדר עם דילולים סדרתי של מונומר FLSL HLA בסרום אנושי רגיל מדולל 1:10 ב PBS כדי ליצור עקומה סטנדרטית או פלזמה מטופל בדילול 1:10 ב PBS. הצלחת נשטפה עם PBST, מודגרות שעה 1 בטמפרטורת חדר עם ארנב אנטי אנושי microglobulin β2 [1: 5,000] כדי לזהות HLA שלם, ורחצתי בPBST. צלחות אז הודגרו למשך 30 דקות עם עז נגד הארנב IgG [1: 10,000] ורחצו עם PBST. זיהוי Colorimetric בוצע באמצעות ABTS (2,2&#39;-Azinobis [חומצה 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic] מלח -diammonium) מצע עם זמן דגירה 15 דקות ונצפו ב 405 ננומטר על קורא microplate. FLSL / HLA זוהה בשלוש דגימות מטופל. באיור 8B, RL.064 פלזמה החולה היה מדולל 01:20 בPBS ולאחר מכן להוסיףed לצלחת ופיקוח על הגלאי ללא תווית עבור 60 דקות. זיהוי ספציפי של מתחם FLSL / HLA בסרום המטופל הושג. מבחן t של הסטודנט בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p &lt;0.05). באיור 8C, קטעי רקמה הוכתמו ב1 מיקרוגרם / מיליליטר עם העכבר אנטי-HLA-A2 (BB7.2) כביקורת חיובית, RL21A, IgG2b וIgG2a בהתאמה בקרות שליליות. הצביעה זוהתה באמצעות ערכה אנטי עכבר זיהוי, DAB (diaminobenzadine), וQS hematoxylin מכתים גרעיני כפי שהורה על ידי היצרן. צביעה של רקמת גידול על ידי RL21A מאשרת מצגת של קומפלקסי FLSL / HLA. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> איור 1:. מצגת אנטיגן סרטנית על ידי אנטיגן ויקוציטים האנושי אני כיתת שינוי סרטני הוא הפרעה תוך-תאית. intracellul מדגם HLAחלבוני ar ולגלות שינויים הקשורים לסרטן על פני התא. CTL וTCRm מסוגל לזהות תאים סרטניים באמצעות מתחמי HLA-פפטיד ברורים לתאים אלה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> איור 2:. צילום מסך של רכישת נתונים בתוכנת סורק המבדק דוגמא של רכישת נתונים המציגה את הבסיס הראשוני סריקה ואחריו תוספת נוגדני RL21A לצלחת מצופה 10 מיקרוגרם / מיליליטר של מורכב FLSL / HLA. ריכוזים של נוגדנים הם ציינו. כל שורה מייצגת בודד פיקוח טוב לאורך זמן. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> איור 3:. פורמט Assay איור של נוגדנים משותק על פני השטח צורמים דיפרקטיבית של rel צלחת assay הלכידהפפטיד evant / מתחמי HLA בפתרון. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> איור 4: ספציפי של RL21A לFLSL / HLA מורכב הפגנה של הספציפיות של TCRm RL21A biotinylated למונומר הרלוונטי HLA (FLSL) בהשוואה למונומר לא רלוונטי HLA (YLEV, SLLV, וKVL).. Biotinylated RL21A TCRm [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על פני השטח צלחת assay avidin מצופים וזיהוי בוצע באמצעות מונומר ללא תווית רלוונטית או לא רלוונטי HLA [10 מיקרוגרם / מיליליטר] בPBS. RL21A היה ספציפי לקומפלקס FLSL / HLA. דו-כיווני ANOVA בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p &lt;0.001). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> איור 5:. כריכת רגישות של RL21A לפפטיד / המורכב HLA המקור שלה איור של detectiעל גבול ומחייב רגישות של RL21A למתחם FLSL / HLA. Biotinylated HLA מונומר FLSL [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על פני השטח צלחת assay וRL21A ללא תווית התווסף לצלחת בדילולים סידוריים בPBS כפי שצוין. זיהוי עבור מערכת זו היה בטווח של ננו-מולר הנמוך. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> איור 6: איתור של מתחמי HLA בממוסמר אדם סרום הפגנה של זיהוי של HLA בסרום אדם.. Biotinylated RL21A TCRm [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על פני השטח צלחת assay avidin המצופים. סרום אדם נורמלי ונקווה ממוסמרים עם רלוונטי (FLSL) או מונומר HLA לא רלוונטי (SLLV) היה מדולל 01:20 בPBS ולאחר מכן הוסיף לצלחת ופיקוח על הגלאי ללא תווית עבור 60 דקות. זיהוי ספציפי של מתחם FLSL / HLA בסרום אנושי הושג. באופן כללי, אות רקע (מונומר SLLV לא רלוונטי) היא גבוהה<html> אה לדגימות סרום מדוללים בהשוואה לanalytes מטוהר בPBS (ראה איור 4). דו-כיווני ANOVA בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p &lt;0.0001). <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> איור 7:. מתחמי HLA מסיסים אותרו בsupernatants תרבית תאי סרטן שד היכולת לזהות HLA בsupernatants שד התא סרטני הוא הוכיח. Biotinylated RL21A TCRm, RL9A TCRm (בקרה שלילית), ושליטת אלוטיפ היו משותקות על פני השטח צלחת assay. ממוסמר [5 מיקרוגרם / מיליליטר] וsupernatants תרבית תאי unspiked מד&quot;א-231 נוספו וכריכה היה במעקב במשך 60 דקות על הגלאי ללא תווית. FLSL ומונומר SLLV HLA ממוסמר דגימות מייצגות בקרות חיוביות לRL9A וRL21A מחייב. כיוון אחד ANOVA בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p &lt;0.0001). ogether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig8highres.jpg" /> איור 8:. זיהוי ספציפי של מתחמי FLSL / HLA בדגימות מטופל () אנזים מסורתי המקושר immunosorbent Assay (ELISA) נוצל כדי לזהות מתחמים ספציפיים FLSL / HLA בפלזמת מטופל. (ב) Biotinylated RL21A TCRm או IgG2a [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על צלחת assay avidin. (ג) רקמת גידול שד מRL.064 החולה הייתה מוכתמת כפי שתוארה לעיל 3 לאמת מצגת גידול של מתחמי FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאים סרטניים, המייצגים את סמן ביולוגי לסרטן רלוונטי פוטנציאלי. ניצול טכנולוגיה ללא תווית חיישן וקולט T-cell מחקה נוגדנים חד-שבטיים, זיהוי של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד&quot;א MB-231, זינקו בסרום אנושי, ופלזמה חולה הפגינה, המאפשרת פיתוח של סרטן רומן פלטפורמת אבחון.

איתור של יקוציט האדם Antigen Biomarkers בסרטן שד ניצול הטכנולוגיה biosensor ללא תווית

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

detection-human-leukocyte-antigen-biomarkers-breast-cancer-utilizing

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  Texas Tech University Health Sciences Center.  מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאים סרטניים, המייצגים את סמן ביולוגי לסרטן רלוונטי פוטנציאלי. ניצול טכנולוגיה ללא תווית חיישן וקולט T-cell מחקה נוגדנים חד-שבטיים, זיהוי של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד"א MB-231, זינקו ב...

Video: Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

זיהוי העדינה של סמנים ביולוגיים באמצעות הטבעה מולקולרית מבוסס ביוסנסור קיבולי

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

העשרה ללא תווית נויטרופילים של הפרשת נגזר המטופל דרכי הנשימה באמצעות לולאה סגורה אינרציאלית מיקרופלואידיקה

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...