שיטה זו יכולה לעזור לענות על מספר שאלות מרכזיות המעורבות בייצור אוליגוסכרידים חלב אנושי. ראשית, כמה מהמוצר יש לי? ושנית, מהי ההקשר הספציפי לפחמימות?
המטרה כאן היא לפשט ולהאיץ את תהליך הכימות והאפיון של אוליגוסכרידים חלב אנושיים אלה. לשיטה זו יש שני יתרונות על פני המצב הנוכחי של האמנות. ראשית, זה נוח להקרנת תפוקה גבוהה.
אז, אתה יכול לדמיין בדיקת אלפי תנאים שונים או אולי אפילו ספרייה של אנזימי סינתזה ביום אחד באמצעות טכניקה זו. כמו כן, הוא משתמש בספות המצע הייחודית שהטבע התפתח באנזימים כדי לתת לנו מידע על הקשר הפחמימות של אותם אוליגוסכרידים. אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה לשפר את הייצור של אוליגוסכרידים חלב אנושי, אשר בתורו יכול להוביל נוסחת תינוקות באיכות טובה יותר המחקה באופן הדוק יותר חלב אם אנושי ולעזור לסגור את הפער בין תינוקות יונקים מוזנים נוסחה.
שיקול דעת המשתמש מומלץ בעת ההחלטה באיזו שיטה להשתמש להסרת לקטוז בהתבסס על עלות, תפוקה וזמינות ציוד. יש לנקוט בזהירות כדי להבטיח הסרת לקטוז אופטימלית. יום לפני הניסוי, זרעים 5 מיליליטר של מדיום LB בתוספת קנמיצין ו קרבניצילין מושבה חיידקית טרייה באמצעות טכניקות סטריליות.
דגירה כל התרבויות לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה. למחרת, להעביר 50 microliters של תרבות לילה לחמישה מיליליטר של מדיה LB M9 טרי עם קנמיצין ו קרבניצילין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמשכות עד התרבות הגיעה OD600 בין נקודת אפס חמש ואפס נקודה שבע.
ראשית, להעביר את תרבויות הלילה לנקודה אחת חמש צינורות מיליליטר וצנטריפוגה ב 12, 500 פעמים g לדקה אחת. להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 500 microliters של 1x PBS להכין השעיה תא יחיד. העבר את ההשעיה של תא יחיד לצינורות פקס.
השתמש בציטומטר זרימה כדי לרגש GFP ולאסוף רמות פלואורסצנטיות FITC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי ליצור עקומת כיול, בצע 8 עד 10 דילולים של ה- 2'FL הסטנדרטי בטווח שבין אפס ל- 2500 מיליגרם לליטר. תרבות תאי חישה ביולוגית 2'FL ולהשרות אותם עם דילול סטנדרטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
התחל תרבות של זן ייצור 2'FL בחמישה מיליליטר של מדיה LB ולהגדיל אותו בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, תת תרבות ב 1%in 250 מיליליטר של מדיה מינימלית מוכנה ולהוסיף גליצרול לריכוז סופי של 10 גרם לליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד התרבות מגיעה ו OD600 בין נקודת האפס חמש ונקודת אפס שבע.
לאחר מכן מוסיפים IPTG לריכוז סופי של נקודת אפס חמש מילימולר ולקטוז לריכוז סופי של שני גרם לליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות רצופות במשך 24 שעות. למחרת, להעביר את תרבות הלילה סטרילי 50 צינורות מיליליטר צנטריפוגה ב 900 פעמים g במשך 15 דקות.
השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור במים דה-מיוניים. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים כדי להסיר כל שאריות לקטוז. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מים deionized.
מניחים את התאים על קרח ולהשתמש sonicator ב 30% כוח ב 30 פולסים השני כדי lyse ההשעיה התא. צנטריפוגה התאים lysed ב 2, 000 פעמים גרם במשך 25 דקות. הסר את העל-טבעי והעביר אותו דרך מסנן סטרילי.
אחסן את העל-טבעי המסונן בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לניתוח. לאחר מכן, לחסן תרבות של 2'FL ביו חישה תאים. בשלב אמצע הרישום, לגרום לתאים עם lysate התא בריכוזים שוות ערך לזה של אלה 2'FL המשמש כדי להפוך את עקומת הכיול.
בצע את הכיול כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הפעל את הדגימות על ציטומטר זרימה. צור עקומת תגובה מינון על ידי התוויית פלט פלואורסצנטיות נגד ריכוז oligosaccharide ולהשוות את התגובה של הסטנדרטים ללייט התא.
ראשית, להמיס FL אלפאליזה בטא galactosidase ל 1, 000 יחידות למיליליטר במגנזיום כלוריד מילימולר אחד. כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של האנזים הדרוש, לגדל inoculum של 2'FL ביו חישה תאים בשלב באמצע הרישום, לגרום עם לקטוז ו 2'FL. ל-100 תרבויות מיקרוליטר, הוסיפו כמויות משתנות של בטא גלקטוזידאז עד 12 יחידות.
תן לתרבויות לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמשכות. למדוד את הפלואורסצנטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולחשב את היחידות האופטימליות של האנזים הדרוש על ידי קביעת ריכוז האנזים המינימלי כדי להשיג את ההטמה הרצויה של אות. כדי 2'FL ייצור תאים גדל במשך 24 שעות להוסיף את היחידות האופטימליות של בטא galactosidase ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לקבוע את 2'FL titre כפי שתואר קודם לכן.
ראשית, להתחיל תרבות 25 מיליליטר של זן ייצור 2'FL. ברגע שהזן מושרה בשלב אמצע הרישום, הדגירה את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, לחסן תרבות E.coli BL21 במדיה LB.
הגדל אותו לשלב אמצע הרישום ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 15 מיליליטר של תרבות זו לתרבות 24 שעות ביממה 2'FL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר מכן, קבע את הטיטר 2'FL כפי שתואר קודם לכן.
כדי להתחיל, להתחיל תרבות 25 מיליליטר של זן ייצור 2'FL. לאחר שהזן מושרה בשלב אמצע הרישום, הדגירה את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. הוסף שני כרכים של 100% אתנול לתרבות ולנער היטב.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה ב 900 פעמים g במשך 15 דקות. לאסוף את על טבעי דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרז את לקטוז.
להעביר את הפתרון באמצעות נייר סינון כדי להסיר את לקטוז זירז. לאסוף את הסינון המכיל את התא lysate ולקבוע את titre 2'FL כפי שתואר קודם לכן. במחקר זה, אסטרטגיה תפוקה גבוהה משמשת לגילוי ספציפי קישור של אוליגוסכרידים חלב אנושי fucosylated.
זה מושג על ידי בניית חיישנים ביולוגיים של תא שלם על ידי הנדסה גנטית E.Coli אשר, עם אינדוקציה עם גליקנים ספציפיים, להגיב עם אות פלואורסצנטי. אות הפלואורסצנט בתנאים שונים של אינדוקציה כפי שנותחו על ציטומטר זרימה, מראה מעל 100 פי עלייה פלואורסצנטיות עם 2'FL ביו חיישן לעומת וקטור רק שליטה או ביו-חיישן עבור 3'FL. זה מראה את הספציפיות הגבוהה של הקישור של הביו-חיישן.
הרגישות של ההתב"ע יכולה להיקבע על ידי יצירת עקומת תגובה מינון עם רמות פחמימות משתנות. הטווח ליניארי דינמי של זיהוי 2'FL, הוא ראה להיות בין 40 ל 400 מיליגרם לליטר ואת מגבלת הגילוי הוא ארבעה מיליגרם לליטר. חקירה זו יכולה להתבצע במהלך יום עבודה כפי שניתן לראות במדידות הצמד ירה של הדינמיקה של ביטוי הכתב.
ניתן להשתמש בתאי הביו-חישה כדי לזהות ולכימת 2'FL מזן מפיק 2'FL מהונדס באמצעות מספר אסטרטגיות להפחתת האות מלקטוז אקסוגני כך שהאות המוקרא יתאים ישירות לריכוז 2'FL. אסטרטגיה אחת היא להשפיל אנזימטית לקטוז באמצעות בטא גלקטוזידאז שאינו פועל על לקטוז שונה. אסטרטגיה נוספת מנוצלת אתנול אשר לא רק מזרז לקטוז באופן סלקטיבי, אלא גם lyses תאי המפיק מאז תות תאים הוא צעד הכרחי במורד הזרם.
לבסוף, השיטה היעילה ביותר אך זמן רב היא גלולה ולשטוף את התאים לפני תוד התא לשחרר את תאי 2'FL. ברגע שאנו קובעים שיטה זו, הצלחנו להרחיב את הרפרטואר של מטרות אוליגוסכריד באמצעות אנזימים שונים. נכון לעכשיו, אנחנו יכולים לזהות תשעה אוליגוסכרידים שונים ואנחנו עובדים על יותר.
תוך כדי אופטימיזציה של ההתגוננות הזו, שמנו לב החוסן של האנזימים שלנו אפשר לנו לבוא עם טכניקה שנותנת קישור ספציפי לקרוא בעוד כחמש דקות. למרות שאף אחד מהריגטים המשמשים כאן אינם מסוכנים במיוחד, אלה המשתמשים בשיטה זו צריכים לעקוב אחר הליכים ביו-האזרד וביו-בידור סטנדרטיים, כולל לבישת PPE תקין.
