These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Déclaration éthique: échantillons tissus dépersonnalisés et de plasma humains ont été obtenus à partir de Hendrick Medical Center en vertu d&#39;un Institutional Review Board protocole approuvé. 1. Ajout d&#39;anticorps biotinylé REMARQUE: surveillance de cette étape est facultative. Voir protocole alternatif si ce ne est suivi. <ol><li> Obtenir dérivés des plaques revêtues d&#39;avidine disponibles dans le commerce (voir tableau Matériaux et équipement). </li><li> Ajouter 50 ul solution saline tamponnée de phosphate (PBS) pH 7,2 à puits. REMARQUE: préincuber PBS à 28 ° C pour minimiser les changements de température de résonance liés. </li><li> Ouvrez le logiciel du scanner d&#39;essai biologique et suivez l&#39;assistant de configuration pour définir la procédure expérimentale qui comprend la sélection d&#39;ébauches, des normes et des échantillons dans le plan de plaque, réglage de la température (28 ° C), le nombre de pages par minutes (1), et la durée de l&#39;expérience ( 150 min pour accueillir des étapes de préparation). </li&gt; <li> Insérez la plaque d&#39;essai préparé dans l&#39;étiquette bio-essai gratuite scanner et démarrer le premier balayage. Lorsque la première analyse est terminée, sélectionnez «auto-référence pour commencer&quot;. La ligne de base est la première série d&#39;analyses recueillies au début de l&#39;expérience. Si ce est la première lecture effectuée sur cette plaque spécifique, permettre au scanner de fonctionner pour équilibrer la température et éliminer la dérive dans la ligne de base. Voir Figure 2 pour une capture d&#39;écran d&#39;une ligne de base suivi par l&#39;addition de l&#39;échantillon. </li><li> Après la ligne de base est stabilisé, ou au moins cinq analyses, mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Retirer PBS par le dumping dans l&#39;évier et ajouter 50 ul RL21A anticorps biotinylé au [10 pg / ml dans du PBS pH 7,2] à tous, mais les puits de contrôle sur la plaque. Ajouter 50 ul de PBS dans les puits de contrôle. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture jusqu&#39;à saturation, environ 1,5 h. </li><li> Mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Laver le<html> plaque 3 fois avec 200 pl / puits de solution saline tamponnée au phosphate + 0,05% de Tween 20 (PBST), suivi par trois rinçages avec 200 pl / puits de PBS pH 7,2. Répéter l&#39;opération avec PBS. Tapez excès de PBS de la plaque sur du papier absorbant avant de passer à l&#39;étape suivante. NOTE: Cette étape peut être effectuée sur un laveur de plaques automatique ou laver la plaque trois fois avec PBST 200 pi par le dumping liquide dans un évier et le remplacement PBST avec une pipette. </li><li> Ajouter 50 ul de PBS pH 7,2 à tous les puits actifs. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture à surveiller résonance post-lavage. </li><li> Arrêtez la lecture et éjecter la plaque. </li></ol> Alternative protocole pour Étape 1: <ol start="13"><li> Ajouter 50 ul RL21A anticorps biotinylé à [10 ug / ml de PBS] pour tous les puits. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1,5 heures ou pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver la plaque 3 fois avec 200 pl / puits de PBST, suivi par trois rinçages avec 200 pl / puits de PBS que dans l&#39;étape 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Addition d&#39;analyte <ol><li> Retirez le PBS et ajouter 50 ul par puits de tampon de dosage approprié. Pour ce dosage, disponible dans le commerce du sérum humain normal dilué a été utilisé 1:20 dans du PBS. </li><li> Ouvrez le logiciel du scanner d&#39;essai biologique et suivez l&#39;assistant de configuration pour définir procédure expérimentale. </li><li> Insérez la plaque dans le scanner d&#39;analyse biologique et de commencer une base de référence lu. Si ce est la première lecture effectuée sur cette plaque spécifique, laisser le scanneur terme pour équilibrer la température et éliminer la dérive dans la ligne de base. </li><li> Après la ligne de base est stabilisé, ou au moins cinq analyses, mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Retirer le tampon d&#39;essai de puits. </li><li> contrôles Spike avec HLA A * 02: 01 monomère portant pertinentes (FLSL) ou non pertinentes (SLLV, YLEV ou KVL) peptides à des concentrations allant de [0,625 à 10 pg / ml] dans un tampon de dosage. Ajouter 50 ul de standards pour les puits de contrôle de la plaque </li><li> Ajouter 50 ul de substance à analyser dans un tampon de dosage de l&#39;échantillonpuits de la plaque. Pour ce dosage, enrichi de sérum humain disponible dans le commerce a été utilisé. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture jusqu&#39;à saturation, environ 30-60 min. </li><li> Mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Laver la plaque 3 fois avec 200 pl / puits de PBST, suivi par trois rinçages avec 200 pl / puits de PBS que dans l&#39;étape 1.9. </li><li> Ajouter du tampon d&#39;essai de 50 ul à chaque puits actifs. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture à surveiller résonance post-lavage. </li><li> Arrêtez la lecture et éjecter la plaque. NOTE: Le tampon d&#39;analyse peut être PBS, les milieux de culture tissulaire, ou de sérum humain dilué 1:20 dans du PBS en fonction de l&#39;objectif du test. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Analyser en utilisant le logiciel de numérisation d&#39;essai biologique ou des fichiers de données brutes à un logiciel d&#39;analyse statistique préféré exportation. Le logiciel de numérisation d&#39;essai biologique génère automatiquement la courbe de liaison sur la base dudisposition de la plaque fourni lors de l&#39;installation expérimentale. NOTE: Si vous ne utilisez pas le logiciel du scanner d&#39;essai biologique pour l&#39;analyse, suivez les étapes 3.2 à 3.4. </li><li> Soustraire la ligne de base et du contrôle négatif de chaque point de données suivant. </li><li> Calculer la moyenne et l&#39;écart type pour les puits répétés à chaque point de temps. </li><li> Générer un graphique de la courbe de liaison ou sélectionnez les données de point final pour les graphiques à barres. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Les auteurs, Debra Wawro Weidanz et Robert Magnusson, sont respectivement chef de la direction et chef de la technologie chez Resonant Capteurs Incorporated, qui produit le lecteur et analyse les plaques de la plaque d&#39;essai biologique utilisées dans cet article.

Le procédé décrit ici introduit un système de dépistage des biomarqueurs pour le diagnostic de cancer qui permettraient la détection rapide des complexes peptide / HLA solubles dans des échantillons de sérum, plasma, l&#39;urine ou la salive des patients dans un haut débit à 96 ou au format 384 puits. Ce système de dosage utilisant récepteur des cellules T imitant des anticorps monoclonaux et un système de détection sans marquage réduit le temps d&#39;analyse à moins de 1 h par rapport à 3,5 h par ELISA classique. Cette approche à haut débit permet la stratification rapide des patients aux essais cliniques pour des vaccins thérapeutiques contre le cancer ou les produits biopharmaceutiques. Les méthodes actuelles pour la détection de ces cibles pathologiques exigent la purification d&#39;affinité et HPLC-MS / MS des échantillons de patients individuels, un processus qui prend du lourd et du temps. Bien que cette méthode se prête à des techniques ELISA classiques, il est à craindre que les réactifs de détection secondaires tels que l&#39;anticorps anti-β2 microglobuline pourraient modifier la structure de la HL naissanteUne molécule et inhiber la liaison à la détection limitant TCRM. Détection sans étiquette atténue ces préoccupations. Cette procédure pourrait être modifié pour être utilisé sur d&#39;autres systèmes sans marquage tel qu&#39;un système de résonance de plasmon de surface. Cependant, cela réduirait considérablement les capacités de débit élevées par rapport au système d&#39;essai biologique utilisée dans cette étude. Ce protocole peut être modifié de manière efficace pour la détection de biomarqueurs non-HLA dans le sérum du patient et du plasma avec le respect de quelques pas critiques. Le suivi du processus de revêtement d&#39;anticorps initial est recommandé pour l&#39;optimisation de la surface, en tant que &lt;200 pm décalage entraînera probablement faible signal pour l&#39;étape de détection ultérieure. La ligne de base et post-lavage lit sont utiles pour l&#39;analyse de point de terminaison que l&#39;abondance de protéines sériques peut masquer liaison de faible analyte de concentration. Enfin, la variation de température des échantillons peut se traduire par une variation bien également. Il est recommandé que tous les échantillons sont incubés une préd le contrôleur de température de l&#39;unité de biosassay libre de l&#39;étiquette est fixée à 2-3 ° C au-dessus de la température ambiante. Les échantillons réfrigérés doivent être autorisés suffisamment de temps pour atteindre la température de fonctionnement. Modifications futures de ce protocole incluront le multiplexage de TCRM sur la surface de la plaque. Le système d&#39;essai biologique est actuellement prête à repérer des puits à une densité d&#39;au moins 8-plex. En introduisant 8.4 TCRM à chaque puits, pour des volumes d&#39;échantillon de test sont réduites et permettre la collecte de données de plus en plus complexes par patient. Cette capacité pourrait encore informer les patients en ce qui concerne les options thérapeutiques.

La classe antigène I leucocytes humains (HLA) échantillons peptides de 8-11 acides aminés provenant de la dégradation par le protéasome du répertoire de la protéine intracellulaire et présente ces peptides sur la surface de chaque cellule nucléée 1,2. Le complexe de HLA est le «biomarqueur de la nature&quot;, indiquant l&#39;état de chaque cellule (figure 1) qui circulent à lymphocytes T cytotoxiques (CTL). La reconnaissance de maladie associé peptides résultats dans l&#39;élimination de la cellule incriminée par CTL. Ainsi, la réponse immunitaire adaptative est très efficace pour éliminer l&#39;infection virale et de la tumeur. Toutefois, le système immunitaire exerce une pression de sélection qui favorise souvent des virus ou une tumeur capables de soustraire une réponse CTL efficace. Récepteur des cellules T (mimant TCRM) des anticorps monoclonaux (mAbs) qui reconnaissent spécifique de peptide / HLA-A * 02: 01 complexes tels que ceux dérivés de protéines associées au cancer du sein, le facteur inhibiteur de migration des macrophages (MIF19-27) 3 et NY-ESO-1 157-165, permettre la détection et la destruction des cellules du cancer du sein en l&#39;absence d&#39;un anti-tumorale efficace réponse CTL 4,5. Ce produit représentatif est centrée sur le HLA-A * 0201, qui est exprimé par jusqu&#39;à 30% de la population. Toutefois, l&#39;identification d&#39;autres complexes HLA / peptide pertinentes, suivie par la production de TCRM permet le développement d&#39;immunothérapies ciblées et le diagnostic des maladies compagnon, l&#39;expansion de l&#39;utilité de ce travail à une population beaucoup plus large. Une partie des complexes de peptide / HLA à destination de la surface de la cellule est libérée dans le plasma. En raison de la nature très complexe de peptide / HLA piscines, les méthodes actuelles de l&#39;exploitation minière du immunopeptidome de biomarqueurs associés sont HLA temps. Ce procédé nécessite la purification par affinité de l&#39;antigène HLA soluble du plasma, la séparation des peptides HLA associés par chromatographie liquide haute pression en phase inverse(RP-HPLC) et le séquençage de peptides par spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) 6,7. Bien que ce processus est une option viable pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques, ce est un processus lourd comme un outil de diagnostic compagnon pour les cibles associées HLA déjà dans le vaccin thérapeutique ou d&#39;un pipeline biopharmaceutique 8-10. TCRM dirigée contre ces objectifs fournissent les outils pour le développement de diagnostic compagnon rapide visant à stratifier les patients dans les essais cliniques pertinents et fournir des options thérapeutiques plus éclairées. Dans ce travail, un système de criblage percée de biomarqueur pour le diagnostic du cancer est présenté TCRM et qui utilise un système d&#39;essai biologique sans étiquette qui surveille les interactions biologiques avec des étapes de traitement minimum. Le système d&#39;essai biologique sans marquage est basé sur un procédé qui utilise l&#39;effet de résonance à mode guidé (GMR) qui se produit dans des réseaux de guides d&#39;ondes diélectriques 14/11. Lorsque les contacts de lumière à large bande de la diffractiongrille dans les plaques nécessaires pour ce système, deux longueurs d&#39;onde spécifiques sont reflétés. L&#39;interaction de liaison entre un récepteur et son ligand immobilisé est suivie en temps réel en surveillant le décalage de longueur d&#39;onde de résonance avec un analyseur de spectre 12. Séparer les pics de résonance se produisent pour incidente TE (vecteur électrique perpendiculaire au plan d&#39;incidence) et TM (magnétique vecteur normal au plan d&#39;incidence) des états de polarisation fournissant de multiples points de données qui peuvent potentiellement augmenter la précision de détection 11,14. En utilisant des plaques pré-sensibilisées anticorps dans ce système d&#39;essai sans étiquette, le temps d&#39;exécution de test d&#39;analyse de données est d&#39;environ 45 min. En outre, plusieurs échantillons de patients peuvent être interrogés dans un format à 96 ou 384 puits, un net avantage sur un format basé sur HPLC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Selon l&#39;American Cancer Society, plus de 200 000 femmes recevront un diagnostic de cancer du sein invasif chaque année et environ 40 000 mourront de la maladie. Échantillons I La classe antigène leucocytaire humain (HLA) de peptides dérivés de la dégradation par le protéasome des protéines cellulaires et présente ces fragments sur la surface de la cellule pour un interrogatoire par circulant lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Génération d&#39;synoptique du récepteur des cellules T (TCRM) des anticorps monoclonaux (mAbs) qui reconnaissent le cancer du sein spécifique peptide / HLA-A * 02: 01 complexes tels que ceux dérivés de MIF MIF (19-27) et NY-ESO- 1 157-165 permettre la détection et la destruction des cellules du cancer du sein en l&#39;absence d&#39;une réponse efficace de CTL anti-tumeur. Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses du sein et du cancer représentent biomarqueurs potentiellement pertinents. Dans ce travail, un système de dépistage percée biomarqueur du cancer de diagnostics intégrant récepteur des cellules T anticorps monoclonaux imiter combinés avec un roman, biocapteur sans étiquette utilisant résonance mode guidé (GMR) la technologie des capteurs est présenté. Détection de remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, additionné de sérum humain, et le plasma du patient est mise en évidence. L&#39;impact de ce travail pourrait révolutionner la médecine personnalisée à travers le développement du diagnostic de la maladie de compagnie pour les immunothérapies ciblées.

Une série représentative d&#39;expériences a été effectuée en utilisant le TCRM bien caractérisé, RL21A, un anticorps IgG2a monoclonal murin qui reconnaît spécifiquement un peptide (ou MIF FLSL 19-27) dans le contexte de la molécule HLA-A * 02: 3 01 molécule. Le monomère apparenté peptide / HLA, ainsi que HLA monomère non pertinent 15, a été utilisé pour démontrer le procédé décrit. La figure 3 illustre le format d&#39;essai. RL21A est spécifique pour le monomère FLSL / HLA avec peu de réactivité croisée avec d&#39;autres complexes peptide / HLA 3. Cette spécificité est récapitulé en utilisant le système d&#39;essai biologique sans marqueur (Figure 4). La sensibilité du système d&#39;essai biologique étiquette libre pour cette expérience est dans la plage nanomolaire basse comme déterminé par titrage de l&#39;anticorps immobilisé RL21A sur FLSL / HLA monomère (Figure 5). Bien que le signal de fond est significativement augmentée dans les échantillons de sérum, spécifique de détection de FLSL / HLA monomère dans le sérum humain est obtenu à pointes sur la figure 6 et un gradient de concentration est facilement discernable dans ces échantillons. Enfin, les surnageants de la lignée cellulaire MDA-MB-231, précédemment présentés pour présenter le FLSL / HLA-A * 02: 01 molécule, sont indiqués pour contenir monomère FLSL soluble en utilisant ce marqueur libre plate-forme de test (Figure 7). L&#39;addition ultérieure de monomère FLSL / HLA augmente le signal sur RL21A (figure 7). En raison de la sensibilité du système, et ainsi de variation de résonance, y compris les changements négatifs peuvent se produire à la suite de variations de température comme on le voit en fonction des écarts-types sur les figures 4 et 5. Ces variations peuvent être réduits considérablement par pré-incubation de tous les échantillons et le lecteur de plaques de dosage biologique à une température en léger excès de la température ambiante (c.-à-28 ° C). Sur la figure 8, brièvement, 96-Bien plaques de polystyrène ont été enduites avec [10 pg / ml] de RL21A pendant 2 heures à la température ambiante, on l&#39;a lavé avec du PBST, bloquées avec 0,5% de lait à faible teneur en matière grasse, on l&#39;a lavé avec du PBST et incubés pendant 2 heures à température ambiante avec des dilutions en série de FLSL HLA monomère dans du sérum humain normal dilué à 1:10 dans du PBS afin de générer une courbe d&#39;étalonnage ou de plasma de patient dilué au 1/10 dans du PBS. La plaque a été lavée avec du PBST, on incube 1 heure à température ambiante avec de lapin anti-microglobuline β2 humain [1: 5000] pour détecter HLA intact, et lavé dans PBST. Les plaques ont été ensuite incubées pendant 30 min avec de chèvre anti-IgG de lapin [1: 10 000] et lavées avec du PBST. Détection colorimétrique est réalisée en utilisant ABTS (2,2&#39;-azinobis [acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique] -diammonium sel) substrat avec un temps d&#39;incubation de 15 min et observé à 405 nm sur un lecteur de microplaques. FLSL / HLA a été détectée dans trois échantillons de patients. Sur la figure 8B, RL.064 de plasma du patient a été dilué 1:20 dans du PBS, puis ajoutered à la plaque et surveillés sur le détecteur sans étiquette pendant 60 min. Détection spécifique de complexe FLSL / HLA dans le sérum du patient a été réalisé. Le test t de Student a été effectuée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,05). Sur la figure 8C, les coupes de tissu ont été colorées à 1 ug / ml de souris anti-HLA-A2 (BB7.2) comme témoin positif, RL21A, IgG2a IgG2b et respectivement de témoins négatifs. La coloration a été détectée en utilisant un kit anti-souris détection, DAB (diaminobenzadine) et QS hématoxyline pour la coloration nucléaire comme indiqué par le fabricant. La coloration du tissu tumoral par RL21A confirme présentation de complexes FLSL / HLA. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Tumeur présentation de l&#39;antigène par l&#39;antigène de classe I de leucocyte humain transformation cancéreuse est un trouble intracellulaire. HLA échantillon intracellular protéines et révéler des changements liés au cancer à la surface cellulaire. TCRM CTL et sont capables de reconnaître les cellules cancéreuses par le biais des complexes HLA-peptide distinctes pour ces cellules. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Capture d&#39;écran de l&#39;acquisition de données dans le logiciel de numérisation d&#39;essai biologique Exemple d&#39;acquisition de données montrant la base initiale de scrutation, suivie par plus de RL21A anticorps à une plaque revêtue de 10 pg / ml de complexe FLSL / HLA. Les concentrations d&#39;anticorps sont telles qu&#39;indiquées. Chaque ligne représente un individu bien suivi dans le temps. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figure 3:. Format Assay Illustration d&#39;anticorps immobilisé sur la surface du réseau de diffraction de la rel plaque d&#39;essai de captureperti- complexes peptide / HLA en solution. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figure 4: Spécificité de RL21A pour FLSL / HLA complexe en évidence de la spécificité des biotinylé RL21A TCRM pour son monomère (FLSL) de HLA pertinent par rapport à HLA monomère non pertinent (YLEV, SLLV, et KVL).. RL21A TCRM biotinylé [10 pg / ml] a été immobilisé sur la surface de la plaque d&#39;essai revêtue d&#39;avidine et la détection a été effectuée en utilisant non marqué monomère HLA pertinent ou non [10 pg / ml] dans du PBS. RL21A était spécifique pour le complexe FLSL / HLA. Two-Way ANOVA a été réalisée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,001). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figure 5:. Reliure sensibilité de RL21A à son / complexe HLA de peptide apparenté Illustration de la detectisur la limite et la sensibilité de RL21A liaison au complexe FLSL / HLA. Biotinylés de HLA monomère FLSL [10 pg / ml] a été immobilisé sur la surface de la plaque de dosage et RL21A non marqué a été ajouté à la plaque dans des dilutions en série dans du PBS comme indiqué. Détection de ce système était de l&#39;ordre de quelques nanomoles. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figure 6: Détection de HLA Complexes dans le sérum humain à pointes en évidence de la détection de l&#39;antigène HLA dans le sérum humain.. RL21A TCRM biotinylé [10 pg / ml] a été immobilisé sur la surface de la plaque d&#39;essai revêtue d&#39;avidine. Pooled sérum humain normal additionné de cause (FLSL) ou non pertinent (SLLV) HLA monomère a été dilué 1:20 dans du PBS et ensuite ajouté à la plaque et surveillée sur le détecteur sans marquage pendant 60 min. Détection spécifique de complexe FLSL / HLA dans le sérum humain a été accompli. En général, le signal d&#39;arrière-plan (monomère SLLV sans objet) est élevéeer pour les échantillons de sérum dilués par rapport à analytes purifiés dans du PBS (voir Figure 4). Two-Way ANOVA a été réalisée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,0001). <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figure 7:. Complexes HLA solubles ont été détectés dans le cancer du sein surnageants de culture de cellules La capacité à détecter HLA mammaires dans des surnageants de cellules de cancer est démontrée. Biotinylé RL21A TCRM, RL9A TCRM (contrôle négatif), et une commande de isotype ont été immobilisés sur la surface de la plaque d&#39;essai. Spiked [5 pg / ml] et non enrichis MDA-231 de surnageants de culture cellulaire ont été ajoutés et la liaison a été suivie pendant 60 min sur le détecteur sans étiquette. FLSL et de monomère SLLV HLA échantillons enrichis représentent contrôles positifs pour RL9A et RL21A contraignant. L&#39;analyse de variance a été effectuée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,0001). Figure 8:. Détection spécifique des complexes FLSL / HLA dans les échantillons de patient (A) de A Enzyme Linked Immunosorbent Assay traditionnel (ELISA) a été utilisé pour détecter FLSL / HLA spécifiques des complexes dans le plasma du patient. (B) biotinylé RL21A TCRM ou IgG2a [10 pg / ml] a été immobilisé sur la plaque d&#39;essai de l&#39;avidine. (C) le tissu tumoral mammaire de RL.064 patient a été souillé comme décrit précédemment 3 pour vérifier la présentation de la tumeur des complexes FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses, ce qui représente un biomarqueur potentiel de cancer concerné. En utilisant la technologie des capteurs sans étiquette et récepteur des cellules T imitant les anticorps monoclonaux, la détection de la remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, dopés sérum humain, et le plasma du patient est démontrée, ce qui permet le développement de un nouveau cancer de la plateforme de diagnostic.

Détection de l&#39;antigène leucocytaire humain biomarqueurs du cancer du sein Utilisant la technologie des biocapteurs Sans étiquette

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K vues.  Texas Tech University Health Sciences Center.  Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses, ce qui représente un biomarqueur potentiel de cancer concerné. En utilisant la technologie des capteurs sans étiquette et récepteur des cellules T imitant les anticorps monoclonaux, la détection de la remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, dopés sérum humain, et le plasma du patient est démontrée, ce qui permet le développ...

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Recherche

Immunologie et infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Détection de l&#39;aspergillose pulmonaire invasive chez les patients hémopathie maligne en utilisant la technologie de flux latéral-

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d&#39;approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Base de détection ultrasensible des biomarqueurs à l’aide d’une empreinte moléculaire biocapteur capacitif

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à Clostridium difficile anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Label-free Neutrophil enrichissement de sécrétion Patient provenant des voies respiratoires à l’aide de la boucle fermée Microfluidics inertiel

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...