אנו אסירי תודה לס תומאס שיזם את הפרויקט, ג &#39;הרמן וU. Burgbacher לעזרה בבניית תוכנית ההתקנה של FIM. עבודה זו מומנה על ידי DFG (B6 SFB 629).

הערה: כאן, השימוש בFIM מוצג לניתוח תפוקה גבוהה שימושי של תנועת זחל להקרנה בתנאים חופשית מרגשים ותחת השפעה של גירוי חום. יישומים אחרים כגון ניתוח של גירויי ריח תנועה תלויה או הדמיה ברזולוציה גבוהה של גלגול או אחרות התנהגויות אולי צריכים שינויים עדינים בפרוטוקול, אשר מסופקים על פי דרישה. 1. סט-אפ של ניסויים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכ -100 זחלים לכל גנוטיפ ב( זמן 1 שעה חובה) הכולל להשגת ערכים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. הערה: במקרה כמה גנוטיפים צריכים להשוות ונרשמו בימים שונים, להקליט אותו המספר של זחלים לכל גנוטיפ ליום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מרבית היישומים, שיא של 10 הרץ לניתוח פרמטר. עבור יישומי הדמיה ברזולוציה גבוהים, להשתנות במהירות הדמיה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעקב של זחלי instar השלישי, ניסויי התנהגות כ -120 שעות לאחר הטלת ביצים. הפוך surדואר שתרבויות להניב מספיק זחלים בתקופת הניסוי (ראה 4.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישומים שאינם גירוי, להכין משטח זחילה המכיל אגר שקוף (ראה סעיף 2). להכיל זחלים בטווח הגירוי ליישום הדרגתי חום, מקיף את שדה הראייה במחסום אגר מלח מרתיע (ראה סעיף 3). הערה: יישומים אחרים עשויים לדרוש משטחים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד להשתמש בחדר עם תנאים קבועים סביבתיים (טמפרטורה, אור, זרימת אוויר, וכו &#39;לחות אוויר). </li></ol> 2. הכנת משטח זחילה (Translucent אגר) הערה: בהתקנת FIM משטח אגר מתווסף לספק משטח זחילה לח. בנוסף, זה גם משפר את תכונות תאורה. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 0.8% אגר מזון כיתה במי ultrapure deionized. ליישום הקרנה להכין 400 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים אגר על 50 מעלות צלזיוס (יד חמה) על 33 סנטימטרים X 33 סנטימטר ac נפרדצלחת rylic-זכוכית. מתח פני השטח של אגר וכך הטמפרטורה יגדיר את העובי של הלוח אגר. על 50 מעלות צלזיוס, לוחות אגר בעובי 2 מ&quot;מ מתקבלים. לא להתסיס לאחר הרתיחה ויוצקים כדי למנוע בועות כל הזמן. הכן לוחות אגר טריים עבור כל תקופת הדמיה של כ -4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צלחות פטרי 6 סנטימטר סטנדרטיים עם הפתרון אגר 0.8% הנותרים למיין, נקי ולהרגיל זחלים לפני הניסוי (המנה 1 לכל גנוטיפ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה יש צורך במחסום אגר מרתיע עבור היישום, המשך לסעיף 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך כ 2 סנטימטר של המערכת של הלוח אגר כדי לקבל משטח רבוע מטוס להקלטה. הסר את אגר העודף. הערה: הגודל תלוי ביישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הלוח אגר להתקנת FIM ישירות לאחר הקירור על ידי דחיפה קלה של אגר הגלישה מעבר לקצה של צלחת זכוכית אקריליק. </li></ol> 3. אופציונליים: הוספה מרתיעה אגר מכשול לחורג מתחומי הגוףSurface ינג (מלח אגר) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 2.5% אגר מזון כיתה עם 3 M NaCl במי ultrapure deionized. לסינון בשיפוע חום להכין 200 מיליליטר. הערה: הנפח תלוי ביישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך רחב 2 סנטימטר חריץ בעבר שפכו משטח זחילה המקיף את שדה הראייה (22 x 22 סנטימטרים). הערה: צורות שונות ובתחומים מחסום מבט ייתכן שיידרשו, בהתאם ליישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את החריץ עם אגר מלח גבוה 0.1-.3 סנטימטר ממשטח המעקב. </li></ol> 4. טיפול בFly <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחורי עף בחממת 25 ° C עם 12 שעות אור / חושך מחזור המותאם לזמן של הניסוי על אוכל לטוס סטנדרטי על 65% לחות באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלבים, להרדים 30 זבובים נשיים בתולה ו -8 גברים עם CO 2 ולחצות אותם ב -130 בקבוקוני תרבות מיליליטר עם 35 מיליליטר מזון. הערה: בקבוקון תרבות 130 מיליליטר אחת עם 35 מיליליטר מזון תניב כ 20-30 lאכלתי זחלי instar שלישיים בתוך טווח ההדמיה של 4 שעות. עבודות הדמיה ומעקב לכל שלבי instar הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק מעט מים בבקבוקוני תרבות לנהוג תנועת זחל instar השלישי מאוחר ולאסוף את הזחלים הגדולים מקירות בקבוקון באמצעות מכחול קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2-5 דקות לפני ההקלטה, זחלי העברה לוידאו אחד לצלחת פטרי המכילה 0.8% אגר מזון כיתה במים אולטרה טהורים deionized להרגיל ולנקות אותם. </li></ol> 5. התאמת התקנת FIM ההדמיה להקלטות (Stimulus ללא תנאים) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את מיקוד עדשת מצלמה וצמצם במידת הצורך. קבע את זמן החשיפה למצלמה בהתאמה. הערה: הגדרות אלה לא צריכים להיות שונה במהלך ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את עוצמת תאורה להשיג ניגודיות טובה על ידי ההדמיה זחל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרו תנאים סביבתיים בחדר הקבוע בהקלטות. להחשיך את החדר שלא להפריע זחלים עם כוונת אור. </li></ol> 6. אופציונאלי: התאמת הגדרת FIM ההדמיה להקלטות (טמפרטורה הדרגתית Stimulus תנאים) הערה: מכשיר שיפוע החום הוא צלחת אלומיניום 3 סנטימטר 42 x 42 x 0.2 עם צבע מט שחור וחומר בידוד באתר העליון. צלחת perfused עם מים משני מעגלים שונים הקשורים לcalorifiers / קירור ומשאבות בשני קצותיו (ראה איור 1). יכולות להיות מוסדרות הטמפרטורות מ -5 עד 50 מעלות צלזיוס. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את hr שיפוע חום מכשיר 1 לפני הניסויים ולמקם אותו מעל להתקנה על מנת לאפשר הקמת הפרופיל הרצוי הטמפרטורה ורכיבים לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אגר משטח הזחילה עם מחסום מלח להתקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על הרדיאטור אגר ולהתאים את המרווח בין הצלחת ומשטח הזחילה עד 2 מ&quot;מ (~ 1 מ&quot;מ מעל זחלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור שיפוע ליניארי שללפחות 0.8 מעלות צלזיוס / סנטימטר מ -34 ° C (כ. 2 סנטימטר מהמכשול בשדה הראייה) עד 18 ° C (כ. 2 סנטימטר מהמחסום באתר ההפוך בשדה הראייה) על ידי התאמה טמפרטורה של מעגלי מים עד 1 ° C ו -45 ° C. הערה: תכונות שיפוע שונה של לוחית המתכת דורשות טמפרטורות שונות אשר צריכים להיות הובררו באופן אמפירי. הגדרות אלה לא צריכים להיות שונה במהלך הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות כאמור בסעיף 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לאפשר למשטח הזחילה לאזן בשיפוע לפני ניסויים במשך 20 דקות. בדוק את שיפוע הטמפרטורה עם pyrometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף 8. </li></ol> 7. הדמיה FIM (ללא Stimulus תנאים) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכחול רטוב קטן כדי לאסוף בעדינות 15 זחלים מצלחות פטרי ההתרגלות ולהעבירם למרכז משטח המעקב. אל תעביר את שרידי מזון או יותר מדימים (ראה 7.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא 1 - 50 זחלים על x אזור מעקב 22 סנטימטר 22 סנטימטר. השתמש 15 חיות לכל וידאו עבור מרבית יישומי ההקרנה (מסיבות סטטיסטיות להשתמש לפחות 100 אנשים לכל גנוטיפ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד זחלים ולהמתין כ-10-20 שניות עד שכל הזחלים החלו לנוע ישר לפני ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט תנועת זחל למשך 2 דקות בשעה 10 מסגרות לשנייה לתנאי גירוי שאינו. השתמש בתמונות tif לא דחוסים כמו הפלט בפורמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הקלטה, לאסוף זחלים לווידאו הבא מבקבוקונים להרגיל אותם קריטיים:. נא לא להפריע זחלים נרשמו עם אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטה, להסיר את הזחלים עם מכחול גדול וזורקים אותן על פי כללי בטיחות וחקיקה מקומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת זחלים, להשתמש במכחול כדי לנקות ולחות משטח הזחילה במים ללא יונים טהורים במיוחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריטי: שמור על המשטח לח בכל העת, אך להימנע מו מוגזםisture, שניתן לראותו כמעקב הילות או טיפות סביב זחלים בהקלטות ולהפריע. </li></ol> 8. אופציונלית: הדמיה FIM (טמפרטורה הדרגתית Stimulus תנאים) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שיפוע הטמפרטורה היא הוקם (ראה סעיף 6), להכין את תוכנת ההקלטה להקלטה מיידית בתוך 20 שניות לאחר הצבת הזחלים על פני השטח הזחילה (ראה 8.2) למשל, להגדיר את מספר הפריימים לוידאו ולהגדיר את נתיב החיסכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את צלחת הרדיאטור מעט ומניח את הזחלים על 33 ° C 2 סנטימטר ממחסום מלח. עיין 6. ו7. להוראות כלליות נוספות. מנמיכים את צלחת הרדיאטור שוב ולהתחיל להקליט במשך 3-4 דקות מייד לאחר הזחלים החלו לנוע ישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטה, להסיר את הזחלים ישירות, נקיות ולחות על פני השטח. אל תיגע באגר מלח כדי למנוע התפרצות של NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריטי: שמור על המשטח לח בכל העת, אך להימנעלחות מוגזמת, שניתן לראותו כמעקב הילות או טיפות סביב זחלים בהקלטות ולהפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לאפשר למשטח אגר לאזן שוב לאחר הלחות במשך 1-2 דקות, תוך שמירת תמונות ואיסוף בעלי חיים חדשים לפני ההכנה לווידאו הבא. לשלוט בשיפוע הטמפרטורה באמצעות pyrometer כל 5 קטעי וידאו ולהתאים מכשיר טמפרטורה במידת צורך (טמפרטורת מים, גובה, וכיוון XY בגין אל פני השטח המעקב). </li></ol> 9. מעקב של הזחל תנועה הערה: לפרטים נוספים עיינו במדריך המצורף לFIMTrack (תוספת). לתרשים זרימת תכנית ראה איור 2. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הפרמטרים למעקב לניסויים בהתאמה באמצעות אפשרות התצוגה המקדימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם פיקסל לסנטימטר על פי מצלמה ושדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מסגרות לשנייה מבוסס על הגדרות המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ספי בהירות כל כך הבכל בעלי החיים מזוהים בצורה נכונה (משוב ניתן בתצוגה המקדימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ספי גודל שטח זחל. שים לב לאפשרות המשוב בתצוגה המקדימה: בעלי חיים יחידים מסומנים בצהוב, מתנגשים זחלים מודגשים באדום והאזור של כל חיה מקבל בכחול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מעקב על ידי שימוש בכפתור בפינה הימנית התחתונה. הערה: לאחר מעקב מוצלח, תמונה המציגה רצועות זחל וקובץ CSV המכיל את תכונות תנועה ותנוחה מחושבות מאוחסנת בספריית התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במודול תוצאות FIM הצופה (Viewer תוצאות Edit&gt; ...) כדי לבחון ולהתאים באופן ידני את תוצאות המעקב. במידת הצורך, להגדיר אזורי גירוי כדי להעריך את הנתונים ביחס ללמשל משטר גירוי, זחילה התמצאות בביחס לשיפוע החום או המרחק למקור odorant. לתיאור מפורט יותר, אנא השתמש במדריך ל( תוספת). </li></ol> 10. הערכה של נתונים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא קובץ CSV לתוך Excel, Matlab או כל תכנית אחרת לניתוח סטטיסטי נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Vision-Based+Algorithm+for+Decision+Making+in+Flying+Drosophila.">A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila.</a> Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+loop+between+neurobiology+and+flight+behavior+in+Drosophila.">Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).</li><li>Fry, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aerodynamics+of+Free-Flight+Maneuvers+in+Drosophila.">The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila.</a> Science. 300 (5618), 495-498 (2003).</li><li>Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+3D+tracking+paradigms+for+freely+flying+insects.">Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects.</a> EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).</li><li>Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object+tracking:+A+Survey.">Object tracking: A Survey.</a> ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).</li><li>Pistori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+and+larvae+tracking+using+a+particle+filter+with+an+auto-adjustable+observation+model.">Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model.</a> Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PloS one. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+high-resolution+on-chip+optofluidic+microscopes+for+Caenorhabditis+elegans+and+cell+imaging.">Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).</li><li>Heng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+Microscopy+-+a+Method+for+Implementing+a+High+Resolution+Optical+Microscope+on+a+Chip.">Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip.</a> Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).</li><li>Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-electro-fluidic+grids+for+nematodes:+a+lens-less,+image-sensor-less+approach+for+on-chip+tracking+of+nematode+locomotion.">Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion.</a> Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).</li><li>Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EthoVision+video+tracking+system--a+tool+for+behavioral+phenotyping+of+transgenic+mice.">The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice.</a> Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li><li>Yu, C. -. C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PloS one. 8 (7), e69653 (2013).</li><li>Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sampling+and+decision+making+in+Drosophila+chemotaxis.">Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis.</a> Nature communications. 2, 441 (2011).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis.">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li><li>Risse, B., Thomas, S., Otto, N., L&#246;pmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIM,+a+Novel+FTIR-Based+Imaging+Method+for+High+Throughput+Locomotion+Analysis.">FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis.</a> PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).</li><li>Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+subtle+locomotion+phenotypes+of+Drosophila+larvae+using+internal+structures+based+on+FIM+images.">Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images.</a> Comput Biol Med. 14, (2014).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף

מדעי המוח ההתנהגותיים שלו הוא חובה לפענח כמותית תכונות התנהגותיות מורכבות. נהלים כך, מספר גדול של אנשים חייב להיות נצפו ברזולוציה גבוהה ואוטומטיים יש צורך לניתוח סטטיסטי. כאן, ההדמיה FIM מתוארת, רומן, התקנת הדמיה פשוטה וחזקה, אשר מספק את האמצעים כדי לפקח על תנועה של מגוון רחב של בעלי חיים. היעילות של התקנת ההדמיה FIM נבדקה באמצעות זחלי דרוזופילה, תולעים שטוחות planarian וג תולעי elegans. טכנולוגית FIM מספקת גבוה באופן מהותי לעומת לזהות אפילו מבנים פנימיים של בעלי החיים, כגון המוח, קנה נשימה, בטן או proventriculus. חשוב לציין, המבנים הפנימיים הללו וחסונה מזוהים, כך שהם יכולים לשמש כדי לזהות את הכיוון של בעלי החיים 19 באופן אוטומטי. האיכות של הסרטים יכולה להיות מושפעת מכמות מוגזמת של מים על פני השטח הזחילה. לכן, זה קריטי ללשלוט על הלחות של אגר. מים אגר או יותר מדי זקנים מדי על פני השטח יכולים לגרום לחפצים. כמו כן, ודא שאין בועות אוויר כלולות במשטח הזחילה. באופן כללי, משטח אגר מוכן היטב מאפשר הקלטת סרטים במשך 4 שעות. בשל העקרונות הפיסיקליים הבסיסיים ההדמיה FIM מייצרת כמעט רעש הקלטות תמונה חופשיות, וכתוצאה מכך איכות תמונה מעולה. זה בתורו מאפשר ניתוח תמונה מבוסס מחשב שלאחר מכן ומאפשר קצב העברת נתונים גבוה. עם זאת, מתודולוגיה מוגבלת לניתוח בעלי חיים באופן ישיר קשר עם המשטח אגר. תוכנת המעקב הוא קרא תיגר על ידי בעלי חיים ויוצרים צורת סופגנייה. למרות שמדד ינארי מכיר את צורת הסופגנייה, עמוד השדרה הלא נכונה עלולה להיות מחושב. בשל הבנייה מודולרית של ההדמיה צבע שולחן מעקב הכפולה ומשולשת הוא בהישג יד. יתר על כן, גירויים נוספים (אור, ניחוחי, גירויים חשמליים או מכאניים) יכולים להיות בקלות delivered מלמעלה. ניתן לאמץ תכנית FIMTrack נועדה להתאים את כוחו של ההדמיה FIM בקלות לעקוב אחר זחלי דרוזופילה, ג elegans או planarians. כך ובשל הבנייה הפשוטה וזולה שלה (ראה http://FIM.uni-muenster.de), ההדמיה FIM היא ריאלי עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים ובפרט מאפשרת נחוצה בדחיפות את לימודי תפוקה גבוהות.

רוב בעלי החיים את היכולת להעביר בצורה מתוחכמת מאוד ומבוקרת. לפענח את שליטת תנועה הגנטית בסיס הבסיסית הוא חובה להעריך כמותית דפוסי התנהגות שונה. במובן זה, תסיסנית יכולה לשמש כמודל אידיאלי. מעקב של טיסה חופשית דרוזופילה הוא מפתה 1-4 אבל זחילה של זחלים תסיסנית מתרחש בשני ממדים במהירות נמוכה יחסית, ולכן יכול להיות במעקב בקלות. הגדרות מבוססות מצלמה בשילוב עם תאורה מתאימה, משמשות לרכישת תמונות 5. שניהם אירוע או אור מועבר מועסק בניסויים התנהגותיים 6,7. עם זאת, בשל הגוף השקוף למחצה של הזחלים והשתקפויות אור אפשריים של ההקלטה נאמן משטח הזחילה של תנועות זחל יכול להיות מאתגר. כדי להתגבר על בעיות כאלה, כמה שיטות מורכבות כבר המציאו. לאחרונה, תאורת שדה כהה הוצגה כדי לשפר את החזית / רקע המשךניגודיות 8. פחות דימוי חיישן טכניקות רכישה הוכנסו כחלופה להקלטה מבוססת מצלמה, הדמיה אופטית עדשה-פחות ועל שבב 9-11. מספר תוכניות מעקב הוכנסו לאחרונה, כוללים פתרונות תוכנה מותאמים אישית 12 וזמינים באופן מסחרי. דוגמאות לתוכניות מעקב תפוקה גבוהה הן Tracker Multi התולעת (MWT) 13 וMultianimal הליכה ומסלול (MAGAT) 8. שניהם במשותף, יכולים להיות במעקב שבעלי חיים רבים בזירת שטח הפתוח יחידה, כך שבעלי חיים מתנגשים להוביל לזהויות בעלי חיים חדשות רבות. כדי להתגבר על מגבלה זו, התקנה רב גם הוצגה הפרדת 12 בעלי חיים לתוך בארות בודדות 14. כימות מדויק של תנועה של אנשים בודדים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בשלב מעקב מטלטלין בשילוב עם מיקרוסקופ 15. עם זאת, כל הגישות אלה הן או עלות יעילות, מחדש מספיק חוסרפתרון או יותר מדי זמן רב עבור phenotyping תפוקה גבוה. FIM כדי להתגבר על המגבלות שצוינו לעיל, פיתחנו (הדמיה שיטה מבוססת FTIR) המבוסס על השתקפות מתוסכלת סה&quot;כ פנימית (FTIR) 16 (איור 1). גישת הדמיה חדשה זה מספקת ניגודיות גבוהה חסרת תקדים ואף מאפשרת הקלטה רב-צבע של זחילה בעלי חיים 16. העיקרון הבסיסי של שיטה נוחה ויעילה זה קל. צלחת זכוכית אקריליק מוצפת באור (לדוגמא, 875 ננומטר אינפרא אדום). בשל מדדי שבירה שונים של זכוכית אקריליק ואוויר, האור משתקף לחלוטין בגבול זכוכית / האוויר. אין חימום של זכוכית אקריליק יצוין 16. רק אם אובייקטים עם מקדם שבירה גבוהה יותר לגעת בשולחן מוצף באור, יכול להדליק להיכנס אובייקטים אלה. אם בעלי החיים לגעת במשטח, אור משתקף ויכול לנפול בפח מלמטה (איור 1). כתוצאה מכך, רק הקשראזור של החיות מופיע כנקודת אור, המאפשרת הדמיה מפורטת עם רקע שחור כולל. לפיכך, FIM הדמיה מאפשרת להקליט סרטים מושלמים לאלגוריתמי ראייה ממוחשבים. שימוש פשוט וחזק של FIM עכשיו מביא ניתוח תפוקה גבוהה מפורט של התנהגות מורכבת של בעלי חיים להישג היד והוא יכול לשמש ללימוד עיבוד מידע: למשל, olfaction 8, 16; חזון 17 או 18 thermosensation. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> איור 1. התקנת FIM עם שילוב חום גירוי ועקרונות פיסיקליים הבסיסיים. התקנת FIM (). עוצמת תאורה יכולה להיות מוסדרת בפנל קדמי. (ב) כדי לספק גירוי חום, שחור צבועה צלחת אלומיניום, perfused עם מים חמים וקרים בשני הצדדים, ממוקמת 2 מ&quot;מ מעל פני השטח אגר שעצמו הוא בעובי 2 מ&quot;מ. השיפוע הוקם על צלחת חום הרדיאטור ואגר על ידי ההבדלים בטמפרטורת העיקרון הפיזי של השתקפות פנימית מוחלטת מתוסכלת (C):. צלחת זכוכית אקריליק הוא מואר על ידי אור אינפרא אדום. θ 1, θ 2, וθ 3 מצביע על זוויות השתקפות אור. n, n 1, n 2 n ולציין את 3 מדדי השבירה של אוויר, זכוכית אקריליק, אגר וזחל בהתאמה ולמלא את חוסר השוויון n &lt;n 1 &lt;n 2 &lt;n 3. בשל שבירה, זווית ההשתקפות משתנה במהלך מעבר. אם הזווית היא מתחת לזווית הקריטית, האור לא בא לידי ביטוי יותר, יכול לעבור דרך השכבות ויכול להיות שנתפס מלמטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Spectrum של תהליכים שיכולים להיות מנותח על ידי FIM הוא רחב. ללא כל התאמות נוספות, הדמיה FIM ניתן להשתמש כדי לפקח על כל שלבי הזחל של דרוזופילה (איור 5) או יכולה לשמש למעקב הרגל-ההדפסים של מבוגר תסיסנית 19. כמו כן, המסלולים של ג elegans או התנועה של תולעים שטוחות planarian ניתן להקליט בקלות (איור 5 ג). גם הניתוח של צמיחת hypha או שיער שורש פטרייה מופיע 19 אפשריים. בהתקנת FIM הנוכחית שלנו, 4 x 16 דיודות פולטות אור אינפרא אדום (IR- LEDs) משולבות 2 סנטימטר צלחת זכוכית אקריליק 32 x 32, נקראים לשולחן המעקב (איור 1). עוצמת IR-הנוריות מותאמת תלוי במשקל של האובייקטים על שולחן המעקב, שבו ניתן לעשות זאת בקלות על ידי בקר מיקרו מחובר למעגל באמצעות אפנון רוחב פולס (PWM). FIM מניב תמונות עם ניגודיות גבוהות מאוד על פני טווח רחב של עוצמות הארה. חשוב לציין, זה generates תוצאות מצוינות בirridation אינפרא אדום הכולל נמוך ממילא. מצלמה עם מסנן אינפרא אדום ממוקמת מתחת לטבלת המעקב, המאפשרת אינטגרציה של גירויים נוספים להתקנה. גירויי חום יכולים להיות מיושמים בקלות על ידי צלחת רדיאטור חום והגירויים אור מיושמים על ידי מקרן LCD. כמו כן יכול להיות כלול odorants במילויים על ידי מכסים פשוטים 8. בניסויים שיפוע חום, צלחת רדיאטור חום perfused עם מים חמים וקרים בשני הצדדים, בהתאמה והניחה 2 מ&quot;מ מעל הזחלים (איור 1). הדור של ניגודיות גבוהה, סרטים באיכות גבוהות פותח את האפשרות לניתוח תמונת מחשב מבוסס מתוחכם, ובכך אנו מיישמים את תוכנת FIMTrack כדי לחלץ קבוצה גדולה של תכונות מתמונות (איור 2). שש תכונות עיקריות הראשונות הוגדרו מקווי המתאר של בעלי החיים (איור 3 א). תכונות אלו מספקות בסיסלחישוב נוסף של שש תכונות המשניות המתארות את צורת חיות ואת עמדתה בגירויים מסוימים בנקודת זמן נתונה (איור 3). נכון לעכשיו, תשע תכונות שיישונים מחושבות שמשלבות היבטים של זמן וכך לאפיין את התנועה של החיה ביחד עם התכונות הראשוניות ומשניים (איור 3 ג). <img alt="איור 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> סקירת איור 2. FIMTrack, עבודה אלגוריתמית וייצוג זחל. (א) כיצד להשתמש FIMTrack. התמונות נטענות. סף ערך אפור וספי גודל זחל זחלי הגדרה אחת חייבים להיות מוגדרים. אזור הזחל חייב להיות ב[ דק &#39;בגודל, מקסימום בגודל]. מעקב נכתב על ידי הכפתור המסומן. עבודה מעקב (B). לאחר הכפתור התחל לוחץ, תמונת הרקע הוא ca<html> (עוצמות מינימליות לאורך זמן) lculated. כל עוד יש מסגרות עזבו, הזחלים מפולחים המבוססים על הסף האפור וmin- וסף המקסימום בגודל. לכל הפילוחים ייצוגי הזחל מחושבים (השווה ל( C)). כל דגם החדש קשור למסלול מסוים, אם מסלול תקף נגיש. אם הגיעה למסגרת האחרונה, שלאחר עיבוד ההשלמה נעשה אחריו דור הפלט. ייצוג הזחל (C). בעלי החיים מורכב של ראש וזנב נקודה (h וt). בין נקודות אלה מספר אי-זוגי של נקודות שרירותיים עמוד השדרה שלי יכול להיות מוגדר עם r רדיוס i. בנוסף, מרכז המסה m והגוף העיקרי כיפוף γ זווית מחושב. פרמטרים הקשורים בתנועה כמה משורטטים בקווים סגולים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> o: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" width="650" /> איור 3. תכונות מחושבות על ידי FIMTrack. (א) תכונות עיקריות המבוסס על קווי המתאר של בעלי החיים. (ב) תכונות משניים, המבוסס על תכונות עיקריות. (ג) תכונות תיכונית, המבוסס על תכונות עיקריות במסגרות רצופות ותשומות נוספות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

הניתוח של פונקצית רשת עצבית דורש מדידה אמינה של תכונות התנהגותיות. מאז ההתנהגות של בעלי חיים לנוע בחופשיות היא משתנה במידה מסוימת, בעלי חיים רבים צריכים להיות מנותחים, כדי לקבל נתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. זה בתורו דורש כימות אוטומטי בעזרת מחשב של דפוסי תנועה. כדי להשיג תמונות עם ניגודיות גבוהות של אובייקטים נעים כמעט שקופים וקטנים, טכניקת הדמיה חדשנית המבוססת על ההשתקפות פנימית מוחלטת מתוסכלת נקראת FIM פותחה. בהגדרה זו, בעלי חיים מוארים רק באור אינפרא אדום במיקום מאוד ספציפי של מגע עם משטח הזחילה הבסיסי. מתודולוגיה זו תוצאה תמונות עם ניגודיות גבוהות מאוד. בהמשך לכך, תמונות עם ניגודיות גבוהות אלה מעובדות באמצעות אלגוריתמי מעקב גובה הוקמו. על בסיס זה, פיתחנו את תוכנת FIMTrack, המשמשת כדי לחלץ מספר התכונות הדרושות כדי לתאר מגוון רחב של תנועת כמותיתמאפיינים. במהלך הפיתוח של חבילת תוכנה זו, אנו מתמקדים המאמצים שלנו על ארכיטקטורת קוד פתוחה המאפשרת בנוסף קל של מודולים נוספים. התכנית פועלת פלטפורמה עצמאית והוא מלווה על ידי ממשק גרפי אינטואיטיבי המנחה את המשתמש באמצעות ניתוח נתונים. מקבלים את כל ערכי פרמטר תנועה בצורה של קבצי csv מאפשרים נתונים נוספים מנתח. בנוסף, מציג תוצאות שולבו בתוכנת המעקב מספק ההזדמנות לבחון באופן אינטראקטיבי ולהתאים את התפוקה, כפי שניתן היה הצורך במהלך האינטגרציה גירוי. כוחו של FIM וFIMTrack בא לידי ביטוי על ידי לימוד התנועה של זחלים תסיסנית.

הדמיה כמה מצלמות שונות עם מאפייני רזולוציה שונים נבדקו (איור 4). כל המצלמות בי מצויד במסנן IR מתאים. לדברי ברזולוציה הנמוכה של המצלמה במחיר הנמוך ביותר במבחן זה, שדה הראייה מוגבל עד 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים. התוצאות הטובות ביותר התקבלו באמצעות מצלמה 4 מגה פיקסל (MP). זה מוביל להחלטת לאורך זחל instar השלישי 100 פיקסלים ואיפשר להכיר מבנים פנימיים בקלות. בנוסף, תנועת המעיים של החיה ניתן לחלץ בקלות (איור 4 א). עם זאת, עדיין אפשר להשיג סרטי ניגודיות גבוהים באמצעות מצלמות יקרות פחות, אשר יכול גם להיות מנותחת על ידי FIMTrack. שימוש במצלמה MP 1.4 עם עומק של 8 ביט ורזולוציה של 1,392 x 1,040 פיקסלים היא כמחצית מהמחיר ומאפשר רזולוציה של 45 פיקסלים לאורך זחל instar השלישי בשדה הראייה. הראש אבל יכולים להיות מוכרים לא מבנים פנימיים אחרים (איור 4). מעקב וזיהוי של תנועה פריסטלטית הוא אפשרי, אבל דיוק הוא מופחת (איור 4). עם מצלמה 0.8 MP אפילו זולה יותר עם ​​רזולוציה מרחבית דומה למצלמת MP 1.4, ראש הזחל לא ניתן להכיר בנאמנות יותר (איור 4C). מעקב וניתוח תנועה פריסטלטית הוא אפשרי אך כוללים להתעצבן יותר הבוסס על הרעש המוגבר. באופן מפתיע, אפילו מצלמת USB ברזולוציה נמוכה מספקת סרטים באיכות מספיקות כדי לחשב מסלולי זחל (0.3 MP מצלמה, מתחת ל -20 €, איור 4D). תנועת המעיים יכולים להיות מחושבות מהאזור אבל מדידות הן מאוד רועשות. בהגדרה שלנו אנו משתמשים באופן שגרתי המצלמה MP 4. להקרנה, המצלמה מאפשרת ניטור 22 סנטימטרים X 22 סנטימטרים זירה, אשר ללא ספק מספקת את ההזדמנות כדי לנתח מספר גדול של בעלי חיים בו זמנית, כך שניתוח תפוקה גבוהה אינו ריאלי. שימוש בהגדרה זו, אני אורך זחלs מיוצג על ידי 40 פיקסלים שעדיין מאפשר הקלטה וניתוח של תנועה פריסטלטית. תמונת מופת של 15 מסלולי זחל בצבע חום ניתנת באיור 5 א. בנוסף, השימוש בעדשת מאקרו מאפשר לזחלי תמונה עם רזולוציה גבוהה מאוד שבו רבים האיברים פנימיים להיות גלויים והכרת הראש הוא השתפרה עוד יותר (איור 5). יתר על כן אלה יכולים לשמש לניתוח נוסף מפורט יותר של התנהגויות של מגוון רחב 20. אותו ההתקנה יכולה לשמש בקלות לתמונת הזחילה ג תולעי elegans (איור 5 ג). <img alt="איור 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> איור 4. תוצאות הדמיה ומעקב FIM למצלמות שונות. (א) משמאל: הדמיה FIM של שלושה זחלים זוחלים על במה מעקב 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר נתפסה באמצעות מצלמה MP 4 עם 10 fps. אמצע:Clipping ומרכז המסלול ההמוני של זחל אחד. האזור של החיה מצויינים. מימין: פינת של הזחל זממה מעל 100 מסגרות. החץ האדום מציין את הנקודה של התמונה מקוטעת הזמן. (ב) שווה ערך ל() אבל נתפס באמצעות מצלמה MP 1.4. (ג) שווה ערך ל() אבל נתפס באמצעות מצלמה MP 0.8. (ד &#39;) שווה ערך ל( ) אך נתפס באמצעות מצלמה MP 0.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> יישומי איור 5. גירוי חום, ורזולוציה גבוהה. (א) בקשת גירוי חום (השווה לאיור 1). מסלולים מחושבים באמצעות FIMTrack. תמונת ברזולוציה גבוהה של יישום זחל instar שלישי, שני והראשון באמצעות עדשת מאקרו (B). אורך זחל instar השלישי מיוצג על ידי 400 פיקסלים בשדה ראייה של 2.5 x 2.5 סנטימטר. (ג) ג תולעת elegans נתפסה באמצעות ההדמיה FIM. ברים בקנה מידה מצוינים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis at JoVE.com

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM הוא מערכת חדשנית, הדמיה חסכונית שנועדה לעקוב אחר אובייקטים נעים קטנים כגון C. elegans, planaria או זחלים תסיסנית. תכנית FIMTrack הנלווית נועדה לספק ניתוח נתונים מהיר ויעיל. יחד, כלים אלה מאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה של תכונות התנהגותיות.

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM הוא מערכת חדשנית, הדמיה חסכונית שנועדה לעקוב אחר אובייקטים נעים קטנים כגון C. elegans, planaria או זחלים תסיסנית. תכנית FIMTrack הנלווית נועדה לספק ניתוח נתונים מהיר ויעיל. יחד, כלים אלה מאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה של תכונות התנהגותיות. 

Video: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

עיצוב ובנייה של Headstage העלות האפקטיבית של גירוי עצבי סימולטני הקלטה של ​​מבוך המים

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

צפייה ברשתות מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה ובתאי שריר

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

מחבר זרקור: הבנת רשת מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים דרוזופילה 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.