Wir sind für die Hilfe beim Bau des FIM-Setup dankbar, S. Thomas, die dieses Projekt ins Leben gerufen hat, J. Hermann und U. Burgbacher. Diese Arbeit wurde von der DFG (SFB 629 B6) finanziert.

Anmerkung: Hier wird die Verwendung von FIM für handliche Hochdurchsatzanalyse von Larven Lokomotion zum Screening in freibeweglichen Bedingungen und unter dem Einfluß eines Wärmereiz dargestellt. Andere Anwendungen wie Analyse der Geruchsreize angewiesen Fortbewegung oder hochauflösende Bildgebung von Walzen oder ein anderes Verhalten könnte subtile Änderungen des Protokolls, die auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden müssen. 1. Set-up of Experiments <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwenden Sie etwa 100 Larven pro Genotyp insgesamt (1 Std erforderliche Zeit), um statistisch aussagekräftige Werte zu erhalten. HINWEIS: Bei verglichen und an verschiedenen Tagen aufgezeichnet werden müssen mehrere Genotypen, erfassen die gleiche Anzahl von Larven pro Genotyp pro Tag. </li><li> Für die meisten Anwendungen Rekord bei 10 Hz für Parameteranalyse. Für hochauflösende bildgebende Anwendungen, variieren Bildgebungsgeschwindigkeit, wenn nötig. </li><li> Zur Verfolgung des dritten Larvenstadium, experimentieren etwa 120 Stunden nach der Eiablage. Stellen sure, die Kulturen zu erhalten genug Larven im Versuchszeitraum (siehe 4.3). </li><li> Für nicht-Stimulus-Anwendungen, bereiten Sie einen kriechenden Oberfläche, durchscheinend-Agar (siehe Abschnitt 2). Um Larven im Konjunkturbereich für Wärmegefälle Anwendung enthalten, umgeben das Sichtfeld mit einem aversiven Salz-Agar-Schranke (siehe Abschnitt 3). HINWEIS: Andere Anwendungen können unterschiedliche Oberflächen erfordern. </li><li> Achten Sie darauf, ein Zimmer mit konstanten Umgebungsbedingungen (Temperatur, Licht, Luftströmung, Luftfeuchte etc.) zu verwenden. </li></ol> 2. Crawling Oberflächenvorbereitung (transluzent Agar) HINWEIS: In der FIM ein Setup Agaroberfläche wird zugegeben, um eine feuchte Crawling Oberfläche bereitzustellen. Zusätzlich verbessert auch Beleuchtungseigenschaften. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kochen Sie 0,8% Lebensmittelqualität Agar in deionisiertem Reinstwasser. Für Screening-Anwendung vorbereiten 400 ml. </li><li> Gießen Agar bei 50 ° C (handwarm) auf einem separaten 33 cm x 33 cm acrylic-Glasplatte. Die Oberflächenspannung des Agars und damit die Temperatur wird die Dicke der Agar Platte definieren. Bei 50 ° C, sind 2 mm dicke Platten-Agar erhalten. Nach dem Kochen rühren Sie nicht und gießen ständig um Blasen zu vermeiden. Bereiten Sie frischen Agar-Platten für alle bildgebenden Zeitraum von etwa 4 Stunden. </li><li> Füllen Standard 6 cm Petrischalen mit den restlichen 0,8% Agar-Lösung zu sortieren, reinigen und zu gewöhnen Larven vor dem Experiment (1 Teller pro Genotyp). </li><li> Für den Fall, wird für die Anwendung der aversiven Agar Barriere erforderlich, Abschnitt 3 fortfahren. </li><li> Schneiden Sie ungefähr 2 cm von dem Umfang der Agar-Platte, um eine ebene quadratische Fläche zur Aufzeichnung zu erhalten. Entfernen Sie das überschüssige Agar. HINWEIS: Die Größe ist abhängig von der Applikation. </li><li> Übertragen Sie die Agar-Platte mit dem FIM-Setup direkt nach dem Abkühlen durch leichtes Drücken des Fliegen Agar über den Rand der Acrylglasplatte. </li></ol> 3. Optional: Hinzufügen eines Aversive Agar Barrier auf die Crawling Oberfläche (Kochsalz-Agar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kochen Sie 2,5% Lebensmittelqualität Agar mit 3 M NaCl in entionisiertem ultrareinem Wasser. Für das Screening in einem Wärmegefälle vorbereiten 200 ml. Hinweis: Die Lautstärke hängt von der Anwendung. </li><li> Schneiden eine 2 cm breite Kerbe in der zuvor gegossen kriechen umgebenden Fläche das Sichtfeld (22 x 22 cm). HINWEIS: Je nach Anwendung können verschiedene Barriere Formen und Sichtfelder erforderlich. </li><li> Füllen Sie die Kerbe mit Salz-Agar 0,1 bis 0,3 cm über dem Tracking Oberfläche. </li></ol> 4. Fly Handhabung <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rück fliegt in 25 ° C-Inkubator mit 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus, um Zeit des Experiments auf Standard-fly Nahrung bei 65% Luftfeuchtigkeit eingestellt. </li><li> Für Kreuze, betäuben 30 jungfräulichen weiblichen Fliegen und 8 Männern mit CO 2 und überqueren sie in 130 ml Kulturfläschchen mit 35 ml Essen. HINWEIS: Eine 130 ml Kultur Fläschchen mit 35 ml Essen wird etwa 20-30 l ergebenaß dritten Larvenstadium innerhalb des Bildgebungs Spannweite von 4 Std. Imaging and Tracking Werke für alle Larvenstadium Stadien. </li><li> Lassen Sie ein wenig Wasser im Kulturfläschchen bis zum späten dritten Larvenstadium Larven Bewegung fahren und sammeln die größte Larven aus Fläschchen Wände mit einem kleinen Pinsel. </li><li> 2-5 min vor der Aufnahme, Übertragung Larven für ein Video in einer Petrischale, die 0,8% Lebensmittelqualität Agar in deionisiertem Reinstwasser zu gewöhnen und reinigen. </li></ol> 5. Einstellen der FIM Imaging-Setup für Recordings (Non Stimulus-Bedingungen) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Passen Sie Kameraobjektiv Fokus- und Blenden, wenn nötig. Stellen Sie die Belichtungszeit für die jeweilige Kamera. HINWEIS: Diese Einstellungen müssen nicht während eines Experiments geändert werden. </li><li> Passen Beleuchtungsstärke um einen guten Kontrast durch Abbilden einer Larve zu erhalten. </li><li> Halten Sie die Umgebungsbedingungen im Raum konstant während der Aufnahmen. Verdunkeln Sie den Raum nicht zu stören Larven mit gerichtetem Licht. </li></ol> 6. Optional: Einstellung der FIM Imaging-Setup für Recordings (stufenweise Temperatur Stimulus-Bedingungen) HINWEIS: Der Wärmegefälle Gerät ist ein 42 x 42 x 0,2 cm 3 Aluminiumplatte mit einem matten schwarzen Anstrich und isolierendem Material auf der oberen Seite. Die Platte wird mit Wasser aus zwei verschiedenen Schaltungen zu Heizschlangen / Kühler und Pumpen an beiden Enden verbunden perfundiert (siehe Abbildung 1B). Die Temperaturen können von -5 bis +50 ° C geregelt werden. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Schalten Sie die Wärmegefälle Gerät 1 Stunde vor den Experimenten und legen Sie es über das Setup, damit die Gründung der gewünschte Temperaturprofil und Komponenten ins Gleichgewicht. </li><li> Übertragen Sie die Crawling Oberfläche Agar mit einem Salz Hindernis für die Einrichtung. </li><li> Legen Sie die Kühlplatte über dem Agar und stellen Sie den Abstand zwischen der Platte und der kriechenden Oberfläche bis 2 mm (~ 1 mm über Larven). </li><li> Einrichtung eines linearen Gradienten vonmindestens 0,8 ° C / cm über 34 ° C (ca. 2 cm von der Barriere in dem Blickfeld) bis 18 ° C (ca. 2 cm von der Barriere an der gegenüberliegenden Seite auf dem Sichtfeld) durch Einstellen der Temperatur der Wasserkreisläufe zu 1 ° C und 45 ° C. HINWEIS: Unterschiedliche Gradienten Eigenschaften der Metallplatte erfordern unterschiedliche Temperaturen, die empirisch ermittelt werden müssen. Diese Einstellungen müssen nicht während der Experimente geändert werden. </li><li> Passen Sie die Einstellungen wie in Kapitel 5 beschrieben. </li><li> Lassen Sie die Oberfläche kriechen, um in der Steigung für 20 Minuten ins Gleichgewicht kommen, bevor Experimente. Testen Sie das Temperaturgefälle mit einem Pyrometer. </li><li> Fahren Sie mit Punkt 8. </li></ol> 7. FIM Imaging (Non Stimulus-Bedingungen) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwenden Sie einen kleinen nassen Pinsel, um vorsichtig zu sammeln 15 Larven aus den Gewöhnungspetrischalen und sie auf die Mitte des Tracking-Oberfläche. Übertragen Sie keine Speisereste oder zu vielWasser (siehe 7.8). </li><li> Nehmen Sie 1 bis 50 Larven auf einem 22 cm x 22 cm Tracking-Bereich. Verwenden Sie 15 Tiere pro Video für die meisten Screening-Anwendungen (zu statistischen Zwecken zu verwenden mindestens 100 Individuen pro Genotyp). </li><li> Trennen Sie vorsichtig Larven und warten Sie etwa 10 bis 20 Sekunden, bis alle Larven begannen gerade zu bewegen, bevor die Aufnahme. </li><li> Nehmen Larven Lokomotion für 2 min bei 10 Bildern pro Sekunde für die Nichtreizbedingungen. Verwenden unkomprimierten TIF-Bilder als Ausgabeformat. </li><li> Während der Aufnahme sammeln Larven für die nächste Video von Fläschchen, um sie zu gewöhnen Kritisch:. Aufgezeichnet Larven mit Licht nicht stören. </li><li> Nach der Aufnahme zu entfernen Larven mit einem großen Pinsel und werfen Sie sie in Übereinstimmung mit den Sicherheitsregeln und Vorschriften. </li><li> Nach dem Entfernen Larven, verwenden Sie den Pinsel zu reinigen und zu befeuchten die Crawling Oberfläche mit ultrareinem deionisiertem Wasser. </li><li> Kritisch: Halten Sie die Oberfläche feucht zu allen Zeiten, aber vermeiden Sie moisture, die als Halos oder Tropfen umgebenden Larven in Aufnahmen und stören Tracking gesehen werden kann. </li></ol> 8. Optional: FIM Imaging (Allmähliche Temperatur Stimulus-Bedingungen) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Nach der Temperaturgradient aufgebaut (siehe Abschnitt 6), bereiten Sie die Aufnahme-Software für den sofortigen Aufnahme innerhalb von 20 Sekunden nach dem Platzieren des Larven auf der Krabbeloberfläche (siehe 8.2) zum Beispiel, setzen Sie die Anzahl der Bilder pro Video und definieren Sie den Speicherpfad. </li><li> Heben Sie die Kühlplatte leicht und legen Sie die Larven bei 33 ° C 2 cm von der Salzbarriere. Siehe 6. und 7. für weitere allgemeine Hinweise. Senken Sie die Kühlplatte erneut und starten Sie die Aufnahme für 3-4 min direkt nach Larven begannen gerade zu bewegen. </li><li> Nach der Aufnahme zu entfernen Larven direkt, sauberen und befeuchten die Oberfläche. Das Salz-Agar nicht berühren, um zu vermeiden, Verbreitung von NaCl. </li><li> Kritisch: Halten Sie die Oberfläche feucht zu allen Zeiten aber vermeidenFeuchtigkeit, die als Halos oder Tropfen umgebenden Larven in Aufnahmen und stören Tracking gesehen werden kann. </li><li> Lassen Sie die Agar-Oberfläche nach der Befeuchtung für 1-2 min wieder ins Gleichgewicht, beim Speichern von Bildern und vor der Vorbereitung für die nächste Video-Sammlung neue Tiere. Steuern Sie die Temperaturgradienten mit Pyrometer alle 5 Videos und stellen Sie Temperatur-Gerät bei Bedarf (Wassertemperatur, Höhe und xy Ausrichtung in Bezug auf den Tracking-Oberfläche). </li></ol> 9. Verfolgung von Larven Locomotion HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der beigefügten Anleitung FIMTrack (Ergänzung). Für einen Programmablaufplan siehe Abbildung 2. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Stellen Sie Tracking-Parameter für die jeweiligen Experimente unter Verwendung der Vorschauoption. <ol><li> Passen Sie die Pixel pro cm nach Kamera und Gesichtsfeld. </li><li> Stellen Sie Frames pro Sekunde auf Basis der Kameraeinstellungen. </li><li> Stellen Sie die Helligkeit so Schwellen thbei allen Tieren richtig erkannt (Rückmeldung wird in der Vorschau angegeben). </li><li> Passen Larvenflächengröße Schwellen. Beachten Sie die Feedback-Möglichkeit in der Vorschau: Einzeltiere sind gelb markiert, kollidieren Larven sind rot markiert und die Fläche der einzelnen Tiere ist in blau angegeben. </li></ol></li><li> Start tracking über die Schaltfläche in der rechten unteren Ecke. HINWEIS: Nach der erfolgreichen Verfolgung wird ein Bild mit Larven Tracks und eine CSV-Datei mit den berechneten Fortbewegung und Haltung Merkmale im Bild gespeichert. </li><li> Verwenden Sie die FIM Ergebnisse Viewer-Modul (Bearbeiten&gt; Ergebnisse Anzeige ...) zu überprüfen und manuell anpassen, die Tracking-Ergebnisse. Bei Bedarf definieren Reiz Regionen auf Daten in Bezug auf den Stimulus-Regime zB auswerten, kriechen Orientierung in Bezug auf die Wärmegefälle oder die Entfernung von einem Duftstoff-Quelle. Für ausführlichere Beschreibung nutzen Sie bitte die Bedienungsanleitung (Ergänzung). </li></ol> 10. Bewertung der Daten <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importieren Sie die CSV-Datei in Excel, Matlab oder ein anderes Programm für die weitere statistische Analyse. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren

In Behavioral Neuroscience ist es zwingend erforderlich, um quantitativ zu entziffern komplexe Verhaltensmerkmale. So muss eine große Zahl von Personen mit hoher Auflösung beobachtet und automatisiert werden Verfahren für die statistische Analyse erforderlich. Hier wird FIM Bildgebung beschrieben, eine neuartige, einfache und robuste Bildaufbau, die die Mittel zur Fortbewegung von einer Vielzahl von Tieren Überwachung bietet. Die Wirksamkeit der FIM Imaging-Setup wurde mit Drosophila-Larven, Planarien Plattwürmer und C getestet elegans Würmer. Die FIM-Technologie bietet eigen hohen Kontrast, auch die internen Strukturen der Tiere, wie das Gehirn, Luftröhre, des Darms oder der Drüsen erkennen. Wichtig ist, dass diese inneren Strukturen robust identifiziert, so dass sie dazu dienen können, um die Ausrichtung des Tieres 19 automatisch zu identifizieren. Die Qualität der Filme können durch zu viel Wasser auf der Oberfläche kriechen beeinflusst werden. So wichtig, ist esKontrolle der Feuchtigkeit des Agar. Zu alt Agar oder zu viel Wasser auf der Oberfläche kann Artefakte verursachen. Ebenso ist sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Krabbeloberfläche enthalten. Im Allgemeinen ist eine gut vorbereitete Agar-Oberfläche ermöglicht die Aufnahme von Filmen 4 Stunden. Aufgrund der zugrunde liegenden physikalischen Prinzipien FIM-Bildgebung erzeugt nahezu rauschfreie Bildaufnahmen, was eine hervorragende Bildqualität. Dies wiederum erleichtert das nachfolgende computerbasierte Bildanalyse und ermöglicht einen hohen Durchsatz. Jedoch ist die Methode der Analyse Tiere, die direkt an die Agaroberfläche beschränkt. Die Tracking-Software wird von Tieren Bildung einer Ringform in Frage gestellt. Obwohl eine binäre Anzeige erkennt die Donut-Form, kann eine falsche Wirbelsäule berechnet werden. Durch den modularen Aufbau der Verfolgungstabelle Dual- und Triple-Farbabbildung ist in Reichweite. Darüber hinaus können zusätzliche Reize (Licht, Geruchsstoffe, elektrische oder mechanische Reize) leicht delvon oben ivered. Die FIMTrack Programm entwickelt, um die Macht der FIM Bild passen einfach angenommen, um Drosophila-Larven, C. verfolgen elegans oder Planarien. Daher und aufgrund seiner einfachen und billigen Aufbau (siehe http://FIM.uni-muenster.de), FIM-Bildgebung möglich für eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen und insbesondere ermöglicht dringend benötigten hohen Durchsatzstudien.

Die meisten Tiere besitzen die Fähigkeit, in einem hochentwickelten und kontrollierte Weise zu bewegen. Um die genetischen Grundlagen zugrunde liegenden Bewegungssteuerung zu entschlüsseln ist es zwingend notwendig die quantitative Erfassung unterschiedlicher Verhaltensmuster. In dieser Hinsicht kann Drosophila als ideales Vorbild dienen. Tracking der frei fliegenden Drosophila tantalizing 1-4 aber kriecht von Drosophila-Larven erfolgt in zwei Dimensionen bei relativ niedriger Geschwindigkeit und kann somit leicht kontrolliert werden. Kamerabasierte Setups in Kombination mit geeigneten Beleuchtung verwendet werden, um Bilder zu 5 zu erwerben. Sowohl Auf- oder Durchlicht wird in Verhaltensexperimenten 6,7 eingesetzt. Allerdings kann aufgrund der semi-transluzente Körper der Larven und mögliche Lichtreflexionen des kriechenden Oberfläche treue Aufzeichnung von Larven Bewegungen schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, haben einige komplexe Methoden entwickelt worden. Vor kurzem wurde der Dunkelfeldbeleuchtung eingeführt, um die Vorder- / Hintergrund cont verbessernrast 8. Als Alternative zum kamerabasierten Aufzeichnungslinsen weniger optischen Bildgebung und bildsensorlosen chipAkquisitionsTechniken eingeführt worden 9-11. Mehrere Tracking-Programme haben vor kurzem eingeführt, darunter handelsübliche Software 12 und kundenspezifische Lösungen. Beispiele für die Hochdurchsatz-Tracking-Programme sind die Multi Worm Tracker (MWT) 13 und Multianimal Gang und Track (Magát) 8. Beide haben gemeinsam, dass mehrere Tiere in einem einzigen Freiflächen-Arena verfolgt werden, so dass kollidierende Tieren führen, mehrere neue Tier Identitäten. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine Multi-Well-Aufbau eingeführt Trenn 12 Tiere in einzelne Vertiefungen 14. Präzise Quantifizierung der Fortbewegung von einzelnen Personen können durch die Verwendung eines beweglichen Verfolgungsstufe in Kombination mit einem Mikroskop 15 erreicht werden. Jedoch sind alle diese Ansätze entweder Kosten ineffizient, keine ausreichende WiederLösung oder zu zeitaufwendig für die Hochdurchsatz-Phänotypisierung. Um die oben genannten Beschränkungen zu überwinden, die wir entwickelt haben FIM (FTIR-basierten Imaging-Verfahren), basierend auf frustrierte Totalreflexion (FTIR) 16 (Abbildung 1). Diese neuen bildgebenden Ansatz bietet einen beispiellosen hohen Kontrast und erlaubt sogar Mehrfarbaufzeichnung der kriechenden Tiere 16. Das zugrunde liegende Prinzip dieses handliche und effektive Methode ist einfach. Eine Acrylglasplatte ist lichtdurchflutet (zB 875 nm Infrarot). Wegen der unterschiedlichen Brechungsindices von Acrylglas und Luft, wird das Licht vollständig an der Glas / Luft-Grenze reflektiert wird. Keine Erwärmung der Acrylglas wird bemerkt 16. Nur dann, wenn Objekte mit einem höheren Brechungsindex berühren Sie die lichtdurchfluteten Tabelle können leuchten geben diese Objekte. Wenn die Tiere die Oberfläche berühren, wird das Licht reflektiert und von unten (Figur 1) erfasst werden. Folglich wird nur der KontaktBereich der Tiere erscheint als heller Fleck, der detaillierte Bildgebung mit einer Gesamt schwarzem Hintergrund ermöglicht. So erlaubt FIM-Bildgebung, um perfekte filme für Computer Vision Algorithmen erfassen. Die einfache und robuste Anwendung von FIM bringt nun detaillierte Hochdurchsatzanalyse von komplexen Verhalten der Tiere in Reichweite und kann für das Studium der Informationsverarbeitung eingesetzt werden: zB Geruchssinn 8, 16; Vision 17 oder thermosensation 18. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> Abbildung 1. FIM-Setup mit Hitzereiz Integration und die zugrunde liegenden physikalischen Prinzipien. (A) Die FIM-Setup. Beleuchtungsstärke können am vorderen Bedienfeld geregelt werden. (B) Um einen Hitzereiz liefern, malte eine schwarze Aluminium-Platte, mit heißem und kaltem Wasser durchströmt auf beiden Seiten wird 2 mm über der Agar-Oberfläche platziert dieselbst ist 2 mm dick. Die Steigung ist auf dem Wärmestrahler Platte und der Agar durch die Temperaturunterschiede festgestellt (C) Das physikalische Prinzip der gestörten Totalreflexion:. Eine Acrylglasplatte wird mit Infrarotlicht beleuchtet. θ 1, θ 2 und θ 3 die Lichtreflexionswinkel. n A, n 1, n 2 und n 3 bezeichnen die Brechungsindizes von Luft, Acrylglas, Agar und Larven jeweils und erfüllen die Ungleichung n A &lt;n 1 &lt;n 2 &lt;n 3. Aufgrund der Brechung ändert beim Übergang der Reflexionswinkel. Wenn der Winkel unterhalb des kritischen Winkels ist, wird das Licht nicht mehr reflektiert, können durch die Schichten hindurchtreten und von unten erfasst werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Die spectrum von Prozessen, die von der FIM analysiert werden können, ist breit. Ohne weitere Einstellungen können FIM Bildgebung verwendet werden, um alle Larvenstadien von Drosophila (5B) zu überwachen oder kann verwendet werden, um die Fußspuren der Erwachsenen folgen Drosophila 19. Ebenso sind die Trajektorien C. elegans oder die Bewegung der Planarie Plattwürmer leicht aufgenommen werden (5C). Auch die Analyse der Pilzhyphen oder Wurzelhaarwachstum möglich erscheint 19. In unserem aktuellen FIM Setup werden 4 x 16 Infrarot-Leuchtdioden (IR-LEDs) in eine 32 x 32 cm 2 Acrylglasplatte integriert, die so genannte Tracking-Tabelle (Abbildung 1). Die Intensität der IR-LEDs wird abhängig von dem Gewicht der Gegenstände auf dem Verfolgungstabelle, die leicht von einem Mikroregler mit der Schaltung über eine Pulsweitenmodulation (PWM) verbunden erfolgen kann eingestellt. FIM ergibt sehr kontrastreiche Bilder über einen weiten Bereich von Beleuchtungsstärken. Wichtiger ist, es genriert hervorragende Ergebnisse bei insgesamt bereits niedrigen Infrarot irridation. Eine Kamera mit einem Infrarot-Filter ist unterhalb der Verfolgungstabelle, die die Integration von zusätzlichen Impulse in das Setup ermöglicht platziert. Wärmereize kann durch einen Wärmestrahlerplatte aufgebracht werden und Lichtreize werden durch ein LCD-Projektor verwendet. Auch Duftstoffe können in Gradienten mit einfachen Deckeln 8 enthalten sein. Für Wärmegradienten Experimenten wurde die Wärmestrahlerplatte wird mit warmem und kaltem Wasser auf beiden Seiten jeweils perfundiert und platziert 2 mm oberhalb der Larven (1B). Die Erzeugung von hochauflösenden, qualitativ hochwertige Filme eröffnet die Möglichkeit für anspruchsvolle computergestützte Bildanalyse, damit wir die FIMTrack Software implementiert, um eine große Palette an Funktionen aus Bildern zu extrahieren (Abbildung 2). Ersten sechs Primärmerkmale wurden aus der Kontur des Tieres (3A) definiert ist. Diese Funktionen bieten die Grundliniezur weiteren Berechnung der sechs Sekundärmerkmale, die die Tiere Form und seine Position auf bestimmte Reize zu einem gegebenen Zeitpunkt (Figur 3B), beschreiben. Derzeit sind neun tertiären Merkmale berechnet, die Integration sind zeitliche Aspekte und so prägen die Fortbewegung der Tiere zusammen mit den primären und sekundären Funktionen (3C). <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> Abbildung 2. FIMTrack Übersicht, algorithmische Workflow und Larven Darstellung. (A) Wie FIMTrack verwenden. Die Bilder werden geladen. Grauwertschwelle und Larvengrößenschwellen zu definieren einzelne Larven müssen eingestellt werden. Die Larvenbereich muss in [min-Größe, max-size] sein. Tracking wird durch die hervorgehobene Schaltfläche (B) Tracking-Workflow gestartet.. Nachdem der Start-Taste angeklickt wird, wird das Hintergrundbild calculated (minimale Intensität über die Zeit). Solange gibt es Rahmen links werden die Larven auf der Grundlage der Grauschwelle und die Min- und Max-Größenschwelle segmentiert. Für alle Segmentierungen die Larvendarstellungen berechnet werden (im Vergleich zu (C)). Jedes neue Modell ist mit einer gegebenen Flugbahn verbunden, wenn eine gültige Strecke verfügbar ist. Wenn das letzte Bild erreicht ist, wird in Kürze Nachbearbeitung fertig durch die Ausgabe Generation gefolgt. (C) Larven Darstellung. Das Tier aus einem Kopf und einem Schwanz Punkt (h und t). Zwischen diesen Punkten eine beliebige ungerade Anzahl an Rückgrat Punkte s kann ich mit einem Radius r i eingestellt werden. Darüber hinaus ist die Mitte der Masse m und der Hauptkörper Biegewinkel γ berechnet. Mehrere Bewegung relevante Parameter sind durch violette Linien skizziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Abbildung 3. Merkmale von FIMTrack berechnet. (A) Die wichtigsten Merkmale auf der Grundlage der Kontur der Tiere. (B) Sekundäre Funktionen, basierend auf dem primären Funktionen. (C) Tertiäre Funktionen, basierend auf dem primären Funktionen in aufeinanderfolgenden Rahmen und zusätzliche Eingänge <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

Die Analyse der neuronalen Netzwerkfunktion erfordert eine zuverlässige Messung der Verhaltensmerkmale. Da das Verhalten von frei umherlaufenden Tieren variabel ist, um einem gewissen Grad haben viele Tiere analysiert, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Dies wiederum erfordert eine computergestützte automatische Quantifizierung von Bewegungsmustern. Um Bilder mit hohem Kontrast von fast durchsichtig und kleine bewegte Objekte zu erhalten, wurde ein neuartiges bildgebendes Verfahren auf Basis von frustrierten Totalreflexion genannt FIM entwickelt. In dieser Konfiguration werden die Tiere nur mit Infrarotlicht an der sehr spezifischen Lage der Kontakt mit der darunter kriechen Fläche beleuchtet. Diese Methode führt zu einem sehr kontrastreiche Bilder. Anschließend werden diese Bilder mit hohem Kontrast mit etablierten Konturverfolgungsalgorithmen verarbeitet. Die FIMTrack Software, die eine Anzahl von Merkmalen benötigt extrahieren quantitativ zu beschreiben eine große Vielzahl von Bewegungs dient auf dieser Basis haben wirEigenschaften. Bei der Entwicklung dieser Software-Paket, konzentrieren wir unsere Bemühungen auf einem Open Source-Architektur ermöglicht die einfache Zugabe von weiteren Modulen. Das Programm arbeitet plattformunabhängig und wird durch eine intuitive Benutzeroberfläche, die den Benutzer über die Datenanalyse begleitet. Alle Bewegungsparameterwerte werden in Form von csv-Dateien die eine weitere Datenanalysen gegeben. Darüber hinaus bietet ein Ergebnisviewer in die Tracking-Software integriert die Möglichkeit, interaktiv überprüfen und stellen Sie den Ausgangs, wie man während der Stimulus-Integration erforderlich sein. Die Macht der FIM und FIMTrack wird durch das Studium der Fortbewegung von Drosophila-Larven zeigte.

Zum Abbilden verschiedenen Kameras mit unterschiedlichen Auflösungseigenschaften wurden (Abbildung 4) getestet. Alle Kameras, wo mit einem geeigneten IR-Filter ausgestattet. Gemäß der niedrigen Auflösung der günstigste Kamera in diesem Test wird das Sichtfeld 10 cm x 10 cm begrenzt. Die besten Ergebnisse wurden mit einem 4 Megapixel (MP) Kamera erhalten. Dies führt zu einer Auflösung von 100 Pixeln pro dritten Larvenstadium Larvenlänge und man ließ sie leicht erkennen internen Strukturen. Zusätzlich kann die Peristaltik des Tieres leicht extrahiert werden (4A). Allerdings kann man noch erhalten kontrastreiche Filme mit weniger teuren Kameras, die auch von FIMTrack analysiert werden kann. Mit einem 1,4-Megapixel-Kamera mit einer Tiefe von 8 Bit und einer Auflösung von 1392 x 1040 Bildpunkten ist etwa die Hälfte des Preises und ermöglicht eine Auflösung von 45 Pixeln pro dritten Larvenstadium Larvenlänge im Sehfeld. Der Kopf aber keine anderen internen Strukturen zu erkennen (4B). Verfolgung und Erfassung der Peristaltik ist möglich, aber die Genauigkeit reduziert wird (4B). Mit einem noch günstiger 0,8-Megapixel-Kamera mit einer Auflösung vergleichbar mit der 1,4-Megapixel-Kamera, die Larvenkopf nicht mehr originalgetreu (4C) erkannt werden. Verfolgen und Peristaltik Analyse ist möglich, aber mit mehr Jitter auf der Grundlage der erhöhten Lärm. Überraschenderweise bietet sogar eine niedrige Auflösung USB-Webcam ausreichender Qualität Filme zu Larven Trajektorien berechnen (0,3 MP-Kamera, unter 20 €, 4D). Die Peristaltik kann aus dem Bereich berechnet werden, aber Messungen sind sehr laut. In unserem Setup routinemäßig verwenden wir die 4-Megapixel-Kamera. Für das Screening, ermöglicht diese Kamera die Überwachung eines 22 cm x 22 cm-Arena, die offensichtlich bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Tieren gleichzeitig zu analysieren, so dass Hochdurchsatzanalyse möglich ist. Mit dieser Einstellung Larvenlänge is um 40 Pixel, die noch erlaubt die Aufzeichnung und Analyse der Peristaltik vertreten. Ein beispielhaftes Bild von 15 Larven Trajektorien in einem Wärmegefälle ist in 5A angegeben. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Makro-Objektiv zur Bild Larven mit sehr hoher Auflösung, wo viele der inneren Organe sichtbar und Kopferkennung weiter verbessert wird (5B). Außerdem können diese für weitere detaillierte Analyse des Verhaltens eines weiten Bereichs 20 verwendet werden. Die gleiche Einstellung kann leicht zu Bild kriechen C eingesetzt werden elegans-Würmer (5C). <img alt="4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> Abbildung 4. FIM Bildgebung und Tracking-Ergebnisse für verschiedene Kameras. (A) Links: FIM Abbildung von drei Larven kriechen auf einem 10 cm x 10 cm Verfolgungsstufe eingefangen mit einer 4-Megapixel-Kamera mit 10 fps. Mid:Clipping und Schwerpunktsbahn eines einzelnen Larve. Die Fläche des Tieres angezeigt wird. Rechts: Die Umgebung der Larve aufgetragen über 100 Bilder. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt des ausgeschnittenen Bild. (B) Entspricht (A), sondern erfasst mit einem 1,4-Megapixel-Kamera. (C) Entspricht (A), sondern erfasst mit einem 0,8-Megapixel-Kamera. (D) Entspricht ( A), sondern erfasst mit einem 0,3-Megapixel-Kamera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> Abbildung 5. Wärmereiz, und Anwendungen mit hoher Auflösung. (A) Wärmereizapplikation (vergleiche Abbildung 1). Trajektorien über FI berechnetMtrack. (B) mit hoher Auflösung Anwendung Bild eines dritten, zweiten und ersten Larvenstadium mit einem Makro-Objektiv. Das dritte Larvenstadium Larvenlänge wird durch 400 Bildpunkte in einem Sichtfeld von 2,5 x 2,5 cm dargestellt. (C) A C elegans Wurm eingefangen mit FIM-Bildgebung. Maßstabsbalken angezeigt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM ist ein neuartiger, kostengünstiger Imaging-System entwickelt, um kleine, bewegliche Objekte, wie C. verfolgen elegans, Planarien oder Drosophila-Larven. Die begleitende FIMTrack Programm wurde entwickelt, um eine schnelle und effiziente Datenanalyse zu liefern. Zusammen bieten diese Tools ermöglichen Hochdurchsatz-Analyse von Verhaltensmerkmalen.

FIM Imaging und FIMtrack: Zwei neuer Instrumente, die Hochdurchsatz und Kosteneffektiv Locomotion Analyse

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Aufrufe.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM ist ein neuartiger, kostengünstiger Imaging-System entwickelt, um kleine, bewegliche Objekte, wie C. verfolgen elegans, Planarien oder Drosophila-Larven. Die begleitende FIMTrack Programm wurde entwickelt, um eine schnelle und effiziente Datenanalyse zu liefern. Zusammen bieten diese Tools ermöglichen Hochdurchsatz-Analyse von Verhaltensmerkmalen. 

Serie: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

Planung und Bau eines kostengünstigen Headstage für Simultaneous Neural Stimulation und Aufnahme in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Ein hochdurchsatzgesteuertes, stereotaktisches Neuronavigations- und fokussiertes Ultraschallsystem für die Öffnung der Blut-Hirn-Barriere bei Nagetieren

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.