ونحن ممتنون لS. توماس الذي بدأ هذا المشروع، J. هيرمان وU. Burgbacher للمساعدة في بناء الإعداد FIM. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل DFG (SFB 629 B6).

ملاحظة: هنا، ويرد استخدام FIM لمفيد تحليل إنتاجية عالية للتنقل اليرقات لفحص في ظروف خالية من الحركة وتحت تأثير حافز الحرارة. تطبيقات أخرى مثل تحليل المحفزات حاسة الشم تنقل المعالين أو التصوير عالية الدقة من السلوكيات المتداول أو غيرها قد تحتاج بعض التغييرات الطفيفة في البروتوكول، والتي يتم توفيرها عند الطلب. 1. مجموعة المتابعة من التجارب <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حوالي 100 اليرقات في التركيب الوراثي في ​​مجموع (بتوقيت 1 ساعة مطلوب) الحصول على قيم ذات مغزى إحصائيا. ملاحظة: في حالة تحتاج عدة تراكيب وراثية يمكن مقارنتها وسجلت في أيام مختلفة، وتسجيل نفس العدد من اليرقات في التركيب الوراثي في ​​اليوم الواحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة لمعظم التطبيقات، سجل في 10 هرتز لتحليل المعلمة. للتطبيقات عالية التصوير القرار، وتختلف سرعة التصوير إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتتبع يرقات العمر الثالث، وإجراء التجارب حوالي 120 ساعة بعد وضع البيض. جعل سوره أن الثقافات ينتج ما يكفي من اليرقات في الفترة التجريبية (انظر 4.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتطبيقات عدم التحفيز، وإعداد سطح الزحف تحتوي على أجار شفافة (انظر القسم 2). لاحتواء اليرقات في نطاق التحفيز للتطبيق التدرج الحرارة، وتحيط مجال الرؤية مع مكره حاجز أجار الملح (انظر القسم 3). ملاحظة: قد تتطلب تطبيقات أخرى الأسطح المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من استخدام غرفة مع الظروف البيئية المستمرة (درجة الحرارة، والضوء، وتدفق الهواء، والهواء والرطوبة وغيرها). </li></ol> 2. الزحف تحضير السطح (شفاف آجار) ملاحظة: في الإعداد FIM يضاف سطح أجار لتوفير سطح الزحف رطبة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يحسن أيضا خصائص الإضاءة. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي 0.8٪ الغذاء الصف أجار في الماء عالى النقاء منزوع الأيونات. لتطبيق فحص إعداد 400 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب أجار في 50 ° C (اليد الساخنة) على منفصلة 33 سم × 33 سم ميلانلوحة rylic من الزجاج. فإن التوتر السطحي للأجار وبالتالي فإن درجة حرارة تحديد سمك البلاطة أجار. في 50 ° C، ويتم الحصول على ألواح آغار 2 مم. لا تستنهض الهمم بعد الغليان وتصب باستمرار لتجنب الفقاعات. إعداد ألواح آغار جديدة لكل فترة التصوير من حوالي 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أطباق 6 سم بتري القياسية مع 0.8٪ الحل أجار المتبقية لفرز وتنظيف وروض اليرقات قبل التجربة (1 طبق في التركيب الوراثي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة الحاجة حاجز أجار مكره لتطبيق، انتقل إلى القسم 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم قبالة حوالي 2 سم من محيط بلاطة أجار للحصول على سطح الساحة الطائرة للتسجيل. إزالة أجار الزائد. ملاحظة: حجم يعتمد على التطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوح أجار إلى الإعداد FIM مباشرة بعد التبريد عن طريق دفع بلطف أجار مزلق على حافة لوحة زجاج الاكريليك. </li></ol> 3. اختياري: إضافة إلى مكره آجار الجدار إلى الحوصلةلينغ السطحية (سولت آجار) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي 2.5٪ الغذاء الصف أجار مع 3 M كلوريد الصوديوم في الماء عالى النقاء منزوع الأيونات. لفحص في التدرج الحرارة إعداد 200 مل. ملاحظة: إن حجم يعتمد على التطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشق 2 سم واسعة في السابق سكب الزحف سطح المحيط مجال الرؤية (22 × 22 سم). ملاحظة: قد تكون هناك حاجة أشكال حاجز مختلفة ومجالات رأي اعتمادا على التطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء درجة مع أجار الملح 0.1-0.3 سم أعلى من سطح تتبع. </li></ol> 4. يطير المناولة <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفي الذباب في 25 ° C حاضنة مع ضوء 12 ساعة / دورة الظلام تعديل لآخر تجربة على ذبابة الغذاء القياسية عند 65٪ رطوبة الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالصلبان، وتخدير 30 الذباب الإناث البكر و 8 ذكور مع CO 2 وعبر لهم في 130 قارورة ثقافة مل مع 35 مل الغذاء. ملاحظة: واحد 130 مل قارورة الثقافة مع 35 مل الغذاء تسفر عن 20-30 لترأكل يرقات العمر الثالثة ضمن فترة التصوير من 4 ساعات. التصوير وتتبع يعمل من أجل جميع مراحل الطور اليرقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إسقاط القليل من الماء في قوارير الثقافة لدفع أواخر الطور الثالث حركة اليرقات وجمع أكبر اليرقات من الجدران قنينة باستخدام الفرشاة الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2-5 دقيقة قبل تسجيل ونقل اليرقات للفيديو واحد إلى بيتري طبق يحتوي على 0.8٪ الغذاء الصف أجار في الماء النقي جدا منزوع الأيونات إلى روض وتنظيفها. </li></ol> 5. ضبط الإعداد FIM التصوير لتسجيلات (غير المحفز الشروط) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الكاميرا تركيز العدسة وفتحة إذا لزم الأمر. ضبط الوقت التعرض للكاميرا المعنية. ملاحظة: لا تحتاج هذه الإعدادات إلى تغيير خلال التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط شدة الإضاءة للحصول على النقيض جيدة عن طريق التصوير يرقة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الأوضاع البيئية في ثابت غرفة خلال التسجيلات. تلقي بظلالها على غرفة لعدم إزعاج اليرقات مع ضوء الاتجاه. </li></ol> 6. اختياري: ضبط الإعداد FIM التصوير لتسجيلات (درجة الحرارة تدريجيا التحفيز الشروط) ملاحظة: الجهاز التدرج الحرارة هو 42 × 42 × 0.2 سم 3 لوحة الألومنيوم مع طلاء أسود لامع ومواد عزل على الموقع العلوي. وperfused للوحة مع المياه من اثنين من دوائر مختلفة متصلة calorifiers / مبردات ومضخات عند كلا الطرفين (انظر الشكل 1B). درجات الحرارة يمكن ان تنظم من -5 إلى +50 درجة مئوية. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ساعة جهاز التدرج الحراري 1 قبل التجارب ووضعه فوق الإعداد للسماح بإنشاء الملف الشخصى درجة الحرارة المطلوبة ومكونات للتوازن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أجار سطح الزحف بحاجز الملح إلى الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة المبرد على أجار وضبط التباعد بين لوحة وسطح الزحف إلى 2 ملم (~ 1 مم فوق اليرقات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء التدرج الخطي لل0.8 ° ما لا يقل عن C / سم من 34 ° C (حوالي 2 سم من الجدار الفاصل في مجال الرؤية) إلى 18 درجة مئوية (تقريبا 2 سم من حاجز في موقع معاكس في مجال الرؤية) عن طريق تعديل درجة حرارة المياه الدوائر إلى 1 درجة مئوية و 45 درجة مئوية. ملاحظة: خصائص مختلفة التدرج من لوحة معدنية تتطلب درجات حرارة مختلفة التي تحتاج إلى التأكد تجريبيا. لا تحتاج هذه الإعدادات إلى تغيير خلال التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الإعدادات كما هو موضح في القسم 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اترك السطح الزحف للتوازن في الانحدار قبل التجارب لمدة 20 دقيقة. اختبار التدرج في درجة الحرارة مع البيرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في القسم 8. </li></ol> 7. التصوير FIM (غير المحفز الشروط) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرشاة المبللة صغيرة لجمع بلطف 15 اليرقات من أطباق بتري التعود ونقلها إلى مركز من سطح تتبع. لا يزال نقل الطعام أو أكثر من اللازمالمياه (انظر 7.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل 1-50 اليرقات على 22 سم × 22 سم منطقة تتبع. استخدام 15 الحيوانات في الفيديو بالنسبة لمعظم التطبيقات الفرز (لأسباب إحصائية تستخدم 100 شخص على الأقل في التركيب الوراثي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بلطف اليرقات والانتظار لمدة 10-20 ثانية حتى بدأت كل اليرقات للانتقال مباشرة قبل التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل تنقل اليرقات لمدة 2 دقيقة في 10 لقطة في الثانية لشروط عدم التحفيز. استخدام معرض طرابلس الصور غير المضغوطة وتنسيق الإخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء التسجيل، وجمع اليرقات لمقطع الفيديو التالي من قارورة إلى روض لهم الحرجة: لا تخل اليرقات سجلت مع الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من التسجيل، وإزالة اليرقات مع الفرشاة الكبيرة والتخلص منها وفقا للقواعد السلامة والتشريعات المحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة اليرقات، واستخدام الفرشاة لتنظيف وترطيب سطح الزحف مع الماء منزوع الأيونات النقي جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرجة: الحفاظ على سطح رطبة في جميع الأوقات ولكن تجنب مو المفرطisture، والتي يمكن أن ينظر إليه على هالات أو قطرات المحيطة اليرقات في التسجيلات وتخل تتبع. </li></ol> 8. اختياري: التصوير FIM (درجة الحرارة تدريجيا التحفيز الشروط) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تأسيس التدرج في درجة الحرارة (انظر القسم 6)، وإعداد برنامج تسجيل لحظة تسجيل في غضون 20 ثانية بعد وضع اليرقات على سطح الزحف (انظر 8.2) على سبيل المثال، تعيين عدد من لقطة في الفيديو وتحديد مسار الادخار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع لوحة المبرد قليلا ووضع اليرقات في 33 ° C 2 سم من حاجز الملح. الرجوع إلى 6. و7. لمزيد من التعليمات العامة. خفض وحة المبرد مرة أخرى وبدء التسجيل لمدة 3-4 دقائق مباشرة بعد أن بدأت اليرقات للتحرك مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من التسجيل، وإزالة اليرقات مباشرة، نظيفة وترطيب السطح. لا تلمس أجار الملح لتجنب انتشار كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرجة: الحفاظ على سطح رطبة في جميع الأوقات ولكن تجنبالرطوبة الزائدة، والتي يمكن أن ينظر إليه على هالات أو قطرات المحيطة اليرقات في التسجيلات وتخل تتبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للسطح أجار للتوازن مرة أخرى بعد ترطيب لمدة 1-2 دقيقة، مع توفير الصور وجمع حيوانات جديدة قبل إعداد للفيديو المقبل. السيطرة على التدرج في درجة الحرارة باستخدام البيرومتر كل 5 أشرطة الفيديو وضبط درجة حرارة الجهاز عند الحاجة (درجة حرارة الماء، والطول، والتوجه س ص فيما يتعلق السطح تتبع). </li></ol> 9. تتبع من اليرقات تنقل ملاحظة: لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى دليل المرفقة لFIMTrack (ملحق). لمخطط تدفق البرنامج انظر الشكل 2. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المعلمات من أجل التجارب الخاصة باستخدام الخيار معاينة تتبع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط بكسل لكل سم وفقا لالكاميرا ومجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إطارات لكل ثانية بناء على إعدادات الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط عتبات السطوع حتى عشرفي جميع الحيوانات يتم الكشف عنها بشكل صحيح (وتعطى ردود فعل في المعاينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط اليرقات عتبات حجم المنطقة. ملاحظة الخيار ردود الفعل في المعاينة: يتم تسليط الضوء الحيوانات احدة باللون الأصفر، اصطدامها اليرقات مظللة باللون الأحمر ويتم إعطاء مساحة كل حيوان في الزرقاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تتبع باستخدام الزر في أسفل اليمين. ملاحظة: بعد تتبع ناجح، يتم تخزين صورة يقدم المقطوعات اليرقات وملف CSV يحتوي على تنقل والموقف ميزات تحسب في الدليل الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نتائج FIM وحدة المشاهد (تحرير&gt; نتائج عارض ...) لاستعراض ويدويا ضبط تتبع النتائج. إذا لزم الأمر، وتحديد المناطق التحفيز لتقييم البيانات فيما يتعلق للنظام التحفيز على سبيل المثال، والزحف التوجه فيما يتعلق التدرج الحراري أو المسافة إلى مصدر الرائحة. لوصف أكثر تفصيلا يرجى استخدام اليدوي (ملحق). </li></ol> 10. تقييم البيانات <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد ملف CSV إلى Excel، ماتلاب أو أي برنامج آخر لمزيد من التحليل الإحصائي. </li></ol>

<ol>
	<li>Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Vision-Based+Algorithm+for+Decision+Making+in+Flying+Drosophila.">A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila.</a> Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+loop+between+neurobiology+and+flight+behavior+in+Drosophila.">Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).</li><li>Fry, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aerodynamics+of+Free-Flight+Maneuvers+in+Drosophila.">The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila.</a> Science. 300 (5618), 495-498 (2003).</li><li>Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+3D+tracking+paradigms+for+freely+flying+insects.">Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects.</a> EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).</li><li>Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object+tracking:+A+Survey.">Object tracking: A Survey.</a> ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).</li><li>Pistori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+and+larvae+tracking+using+a+particle+filter+with+an+auto-adjustable+observation+model.">Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model.</a> Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PloS one. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+high-resolution+on-chip+optofluidic+microscopes+for+Caenorhabditis+elegans+and+cell+imaging.">Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).</li><li>Heng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+Microscopy+-+a+Method+for+Implementing+a+High+Resolution+Optical+Microscope+on+a+Chip.">Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip.</a> Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).</li><li>Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-electro-fluidic+grids+for+nematodes:+a+lens-less,+image-sensor-less+approach+for+on-chip+tracking+of+nematode+locomotion.">Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion.</a> Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).</li><li>Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EthoVision+video+tracking+system--a+tool+for+behavioral+phenotyping+of+transgenic+mice.">The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice.</a> Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li><li>Yu, C. -. C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PloS one. 8 (7), e69653 (2013).</li><li>Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sampling+and+decision+making+in+Drosophila+chemotaxis.">Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis.</a> Nature communications. 2, 441 (2011).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis.">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li><li>Risse, B., Thomas, S., Otto, N., L&#246;pmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIM,+a+Novel+FTIR-Based+Imaging+Method+for+High+Throughput+Locomotion+Analysis.">FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis.</a> PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).</li><li>Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+subtle+locomotion+phenotypes+of+Drosophila+larvae+using+internal+structures+based+on+FIM+images.">Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images.</a> Comput Biol Med. 14, (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

في علم الأعصاب السلوكي هو إلزامي على فك كميا الصفات السلوكية المعقدة. هناك حاجة إلى إجراءات وبالتالي، يجب مراعاتها أعداد كبيرة من الأفراد بدقة عالية والآلي للتحليل الإحصائي. هنا، يتم وصف التصوير FIM، رواية، بسيطة وقوية الإعداد والتصوير، والتي تنص على وسائل لمراقبة تحرك من مجموعة واسعة من الحيوانات. تم اختبار فعالية الإعداد والتصوير FIM استخدام يرقات ذبابة الفاكهة، الديدان المفلطحة مستورقة وC. الديدان ايليجانس. توفر تكنولوجيا FIM التباين العالي جوهريا للكشف حتى الهياكل الداخلية للحيوانات، مثل الدماغ والقصبة الهوائية والأمعاء أو الغدية. الأهم من ذلك، ويتم تحديد هذه الهياكل الداخلية بقوة حتى يتمكنوا من خدمة إلى التعرف تلقائيا على التوجه للحيوان 19. يمكن أن تتأثر نوعية الأفلام التي كتبها كمية زائدة من المياه على سطح الزحف. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لالتحكم في الرطوبة من أجار. المياه أجار أو أكثر من اللازم قديمة جدا على سطح يمكن أن يسبب التحف. وبالمثل، تأكد من أن يتم تضمين أية فقاعات الهواء في سطح الزحف. بشكل عام، على سطح أجار معدة إعدادا جيدا يسمح تسجيل الأفلام لمدة 4 ساعة. يرجع ذلك إلى المبادئ الفيزيائية الأساسية التصوير FIM يولد الضوضاء تقريبا التسجيلات صورة حرة، مما أدى إلى جودة صورة رائعة. وهذا بدوره يسهل لاحقا تحليل الصور القائم على الحاسوب وتمكن إنتاجية عالية. ومع ذلك، يتم تقييد منهجية لتحليل الحيوانات التي الاتصال مباشرة على سطح أجار. وتحدى البرمجيات تتبع من قبل الحيوانات تشكيل شكل دونات. على الرغم من أن مؤشر ثنائي يعترف شكل دونات، قد تحسب العمود الفقري الخطأ. نتيجة لبناء وحدات من الجدول تتبع المزدوج والثلاثي التصوير اللون هو في متناول اليد. وعلاوة على ذلك، يمكن للمحفزات إضافية (الضوء، عطور، المحفزات الكهربائية أو الميكانيكية) تكون بسهولة ديلivered من فوق. برنامج FIMTrack مصممة لتتناسب مع قوة التصوير FIM يمكن اعتمادها بسهولة لتتبع يرقات ذبابة الفاكهة، C. ايليجانس أو planarians. وهكذا، ونظرا لبنائه واضحة ورخيصة (انظر http://FIM.uni-muenster.de)، والتصوير FIM هو ممكن لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية وعلى وجه الخصوص يسمح حاجة ماسة دراسات إنتاجية عالية.

معظم الحيوانات لديها القدرة على التحرك بطريقة متطورة للغاية والسيطرة عليها. فك أساس الوراثية السيطرة تنقل الأساسية وهي ملزمة لتقييم كمي لأنماط سلوكية مختلفة. وفي هذا الصدد، يمكن أن ذبابة الفاكهة بمثابة نموذج مثالي. تتبع من الطيران بحرية ذبابة الفاكهة ومحيرة 1-4 ولكن الزحف من يرقات ذبابة الفاكهة يحدث في بعدين على سرعة منخفضة نسبيا وبالتالي يمكن رصدها بسهولة. وتستخدم الاجهزة القائمة على الكاميرا جنبا إلى جنب مع الإضاءة المناسبة للحصول على الصور 5. ويعمل كل من الحادث أو الضوء المرسل في التجارب السلوكية 6،7. ولكن نظرا للجسم شبه شفافة من اليرقات وانعكاسات الضوء ممكنة من الزحف سطح التسجيل المؤمنين من الحركات اليرقات يمكن أن يكون تحديا. للتغلب على هذه المشاكل، وقد وضعت بعض الأساليب المعقدة. مؤخرا، تم إدخال الإضاءة الحقل المظلمة لتعزيز الصدارة / تابع الخلفيةراست 8. كبديل للتسجيل القائم على الكاميرا والتصوير الضوئي عدسة أقل وصورة استشعار أقل أدخلت على رقاقة تقنيات اكتساب 9-11. وقد تم إدخال العديد من البرامج تتبع مؤخرا، بما في ذلك البرمجيات المتاحة تجاريا 12 والعرف الحلول. أمثلة لبرامج تتبع الإنتاجية العالية هي دودة متعدد المقتفي (MWT) 13 و Multianimal المشي والمسار (MAGAT) 8. وقد مشتركة، يمكن تتبع كل من أن الحيوانات متعددة في الساحة الحقل المفتوح واحدة بحيث الحيوانات الاصطدام تؤدي إلى هويات متعددة حيوان جديدة. للتغلب على هذا القيد، تم إدخال الإعداد متعددة جيدا فصل 12 الحيوانات في الآبار الفردية 14. لا يمكن أن يتحقق الكمي الدقيق للتنقل الأفراد واحد باستخدام مرحلة تتبع المنقولة في تركيبة مع المجهر 15. ومع ذلك، كل هذه الأساليب هي إما غير فعالة التكلفة، وعدم إعادة كافيةحل أو قتا أطول من اللازم لارتفاع الإنتاجية phenotyping. FIM للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير (الطريقة التصوير مقرها FTIR) على أساس بالاحباط انعكاس إجمالي الداخلية (FTIR) 16 (الشكل 1). ويوفر هذا النهج التصوير الجديد على النقيض من ارتفاع غير مسبوق، وحتى يسمح تسجيل متعددة الألوان من الزحف الحيوانات (16). مبدأ الكامنة وراء هذا الأسلوب مفيد وفعال أمرا سهلا. وأغرقت لوحة زجاج الاكريليك مع الضوء (على سبيل المثال، 875 نانومتر الأشعة تحت الحمراء). بسبب مؤشرات الانكسار مختلفة من الزجاج الاكريليك والهواء، وينعكس الضوء تماما على الحدود الزجاج / الهواء. يلاحظ أي تسخين الزجاج الاكريليك 16. إلا إذا الكائنات مع معامل الانكسار أعلى تلمس الجدول غمرت الخفيف، يمكن أن تضيء إدخال هذه الكائنات. إذا كانت الحيوانات تلمس السطح، وينعكس الضوء ويمكن الاستيلاء عليها من أدناه (الشكل 1). ونتيجة لذلك، فقط الاتصاليبدو مجال الحيوانات باعتبارها نقطة مضيئة، والذي يسمح التصوير مفصل مع خلفية سوداء الشاملة. وهكذا، FIM التصوير يسمح لتسجيل الأفلام مثالية لخوارزميات رؤية الكمبيوتر. استخدام بسيط وقوي من FIM يجلب الآن مفصل تحليل إنتاجية عالية من السلوك الحيواني معقدة في متناول اليد ويمكن استخدامها لدراسة معالجة المعلومات: على سبيل المثال، الشم 8، 16؛ رؤية 17 أو 18 thermosensation. <img alt="الشكل (1)" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> الشكل 1. الإعداد FIM مع التكامل الحرارة التحفيز والمبادئ الفيزيائية الأساسية. (A) الإعداد FIM. يمكن أن ينظم شدة الإضاءة في اللوحة الأمامية. (B) لتقديم التحفيز الحرارة، ورسمت لوحة الألومنيوم الأسود، مع perfused المياه الباردة والساخنة في كلا الجانبين، يتم وضع 2 مم فوق سطح أجار التينفسه هو 2 مم. يتم تأسيس التدرج على لوحة المبرد الحرارة وآغار من الاختلافات في درجة الحرارة (C) والمبدأ المادي للبالإحباط الانعكاس الكلي الداخلي: مضاءة لوحة زجاج الاكريليك بواسطة الأشعة تحت الحمراء. θ 1، 2 θ، وθ 3 تشير إلى زوايا انعكاس الضوء. ن A، ن 1، ن 2 و 3 ن دلالة على مؤشرات الانكسار من الهواء، زجاج الاكريليك، وأجار واليرقة على التوالي وتحقيق المساواة ن A &lt;ن 1 &lt;ن 2 &lt;ن 3. بسبب الانكسار، تتغير زاوية انعكاس أثناء المرحلة الانتقالية. إذا كانت الزاوية أقل من الزاوية الحرجة، لا ينعكس ضوء بعد الآن، يمكن أن تمر عبر طبقات ويمكن التقاط من الأسفل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ليرة سوريةectrum من العمليات التي يمكن تحليلها من قبل FIM واسع. دون أي تعديلات أخرى، والتصوير FIM يمكن استخدامها لمراقبة جميع مراحل اليرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 5B) أو يمكن استخدامها لمتابعة القدم مطبوعات عالية من الكبار ذبابة الفاكهة 19. وبالمثل، مسارات C. ايليجانس أو حركة الديدان المفلطحة مستورقة يمكن تسجيلها بسهولة (الشكل 5C). ويبدو حتى تحليل الفطرية خوط أو الشعر الجذر النمو ممكنا 19. لدينا في الإعداد FIM الحالي، يتم دمج 4 × 16 الثنائيات الخفيفة الأشعة تحت الحمراء (IR- المصابيح) إلى 32 × 32 سم 2 لوحة زجاج الاكريليك، ودعا الجدول تتبع (الشكل 1). يتم ضبط شدة IR-المصابيح تبعا لوزن الأشياء على الطاولة تتبع، والذي يمكن القيام به بسهولة عن طريق التحكم الجزئي متصلا الدوائر عن طريق نبض العرض التحوير (PWM). FIM ينتج النقيض من الصور عالية جدا على طائفة واسعة من شدة الإضاءة. الأهم من ذلك أنها جنرالerates نتائج ممتازة في منخفض بالفعل irridation الأشعة تحت الحمراء بشكل عام. يتم وضع الكاميرا مع فلتر الأشعة تحت الحمراء أسفل الجدول تتبع، والذي يسمح التكامل من المحفزات إضافية في الإعداد. المحفزات الحرارة يمكن تطبيقها بسهولة عن طريق لوحة المبرد الحرارة ويتم تطبيقها المنبهات الخفيفة عن طريق جهاز عرض LCD. كما عطور يمكن احتواؤها في التدرجات التي كتبها أغطية بسيطة 8. للتجارب التدرج الحرارة، وperfused للوحة المبرد الحرارة مع المياه الباردة والساخنة على كلا الجانبين على التوالي ووضعها 2 مم فوق اليرقات (الشكل 1B). توليد التباين العالي، والأفلام عالية الجودة يفتح إمكانية للكمبيوتر يعمل بنظام متطور تحليل الصور، وبالتالي نحن تنفذ البرنامج FIMTrack لاستخراج مجموعة كبيرة من الميزات من الصور (الشكل 2). وقد تم تحديد ستة الميزات الأساسية الأولى من كفاف من الحيوان (الشكل 3A). توفر هذه الميزات خط الأساسلمزيد من حساب ستة ملامح الثانوية التي تصف شكل الحيوانات وموقفها في بعض المحفزات في نقطة زمنية معينة (الشكل 3B). حاليا، يتم احتساب تسعة ميزات التعليم العالي التي يتم دمج الجوانب الزمنية وبالتالي تميز تنقل من الحيوان جنبا إلى جنب مع ميزات الابتدائية والثانوية (الشكل 3C). <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> الشكل 2. نظرة عامة FIMTrack، وسير العمل حسابي والتمثيل اليرقات. (A) كيفية استخدام FIMTrack. يتم تحميل الصور. يجب تعيين عتبة قيمة الرمادية وعتبات حجم اليرقات تحديد اليرقات واحدة. يجب أن تكون منطقة اليرقات في [الحجم دقيقة، كحد أقصى الحجم]. بدء تتبع من قبل على زر تسليط الضوء عليها. (ب) تتبع سير العمل. بعد النقر فوق الزر ابدأ، وصورة الخلفية هي كاليفورنيا<html> lculated (شدة الحد الأدنى مع مرور الوقت). طالما هناك أطر اليسار، تتم تجزئة اليرقات على أساس عتبة الرمادية وmin- وعتبة ماكس الحجم. لجميع الانقسامات وتحسب تمثيل اليرقات (قارن إلى (C)). ويرتبط كل نموذج جديد لمسار معين إذا كان المسار الصحيح هو متاح. إذا تم الوصول إلى الإطار الأخير، ويتم ذلك يتبع الصيغة النهائية مرحلة ما بعد المعالجة من قبل الجيل الانتاج. (C) تمثيل اليرقات. يتكون الحيوان من الرأس والذيل نقطة (ح و ر). بين هذه النقاط عدد فردي تعسفي من النقاط العمود الفقري ق ط يمكن تعيين نصف قطرها ص ط. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حساب مركز كتلة m والجسم الرئيسي الانحناء γ زاوية. ورسمت العديد من المعلمات الحركة المتعلقة بخطوط الأرجواني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> س: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" width="650" /> الشكل 3. ميزات تحسب FIMTrack. (A) ميزات الأولية بناء على كفاف من الحيوانات. (B) ميزات الثانوية، استنادا إلى الميزات الأساسية. (C) ميزات التعليم العالي، على أساس الميزات الرئيسية في إطارات متتالية ومدخلات إضافية <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

تحليل أداء الشبكة العصبية يتطلب قياس موثوق من الصفات السلوكية. منذ سلوك الحيوانات تتحرك بحرية هو متغير إلى درجة معينة، وكثير من الحيوانات لديها ليتم تحليلها، للحصول على بيانات ذات دلالة إحصائية. وهذا بدوره يتطلب بمساعدة الحاسوب الكمي الآلي من أنماط تنقل. للحصول على صور عالية التباين للكائنات شفافة تقريبا وصغيرة تتحرك، وقد تم تطوير تقنية تصوير جديدة على أساس بالاحباط الانعكاس الكلي الداخلي دعا FIM. في هذا الإعداد، هي مضيئة الحيوانات فقط مع ضوء الأشعة تحت الحمراء في موقف محدد جدا من ملامسة سطح الزحف الأساسي. نتائج هذه المنهجية في النقيض من الصور عالية جدا. بعد ذلك، تتم معالجة هذه الصور عالية التباين باستخدام أنشئت كفاف خوارزميات تتبع. وبناء على هذا، قمنا بتطوير البرمجيات FIMTrack، والذي يعمل على استخراج عدد من الميزات المطلوبة لوصف كميا مجموعة كبيرة ومتنوعة للتنقلالخصائص. خلال تطوير مجموعة من البرامج هذه، ركزنا جهودنا على بنية مفتوحة المصدر مما يتيح إضافة سهلة للمزيد من الوحدات. ويعمل البرنامج منصة مستقلة ويترافق مع واجهة المستخدم الرسومية بديهية توجيه المستخدم من خلال تحليل البيانات. يتم إعطاء كل القيم المعلمة تنقل في شكل ملفات CSV السماح يحلل المزيد من البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، عارض نتائج دمجها في تتبع البرنامج يوفر الفرصة لاستعراض تفاعلي وضبط الإخراج، كما قد تكون هناك حاجة خلال التكامل التحفيز. ويتجلى قوة FIM وFIMTrack من خلال دراسة تحرك من يرقات ذبابة الفاكهة.

لتصوير عدة كاميرات مختلفة مع خصائص دقة مختلفة تم اختبار (الشكل 4). جميع الكاميرات حيث مجهزة فلتر الأشعة تحت الحمراء المناسب. وفقا لقرار منخفضة من الكاميرا أدنى سعر في هذا الاختبار، ومجال الرؤية يقتصر على 10 سم × 10 سم. تم الحصول على أفضل النتائج باستخدام 4 ميجا بكسل (MP) وكاميرا. وهذا يؤدي إلى دقة 100 بكسل لكل الثالث الطور طول اليرقات ويسمح لسهولة التعرف الهياكل الداخلية. بالإضافة إلى ذلك، التمعج للحيوان يمكن استخراجها بسهولة (الشكل 4A). ومع ذلك، يمكن للمرء أن لا يزال الحصول على الأفلام عالية التباين باستخدام كاميرات أقل تكلفة، والتي يمكن أيضا أن تكون تحليلها من قبل FIMTrack. باستخدام 1.4 النائب كاميرا مع عمق 8 بت وقرار من 1،392 خ 1،040 بكسل هو حوالي نصف السعر ويسمح قرار من 45 بكسل في الطور الثالث طول اليرقات في مجال الرؤية. رئيس ولكن يمكن الاعتراف بأية الهياكل الداخلية الأخرى (الشكل 4B). تتبع وكشف التمعج هو ممكن ولكن يتم تقليل دقة (الشكل 4B). مع أرخص 0.8 MP الكاميرا مع القرار المكانية مقارنة إلى النائب كاميرا 1.4، لا يمكن الاعتراف بها رئيس اليرقات بأمانة بعد الآن (الشكل 4C). تتبع وتحليل التمعج هو ممكن ولكن بما في ذلك المزيد من غضب على أساس زيادة الضوضاء. والمثير للدهشة، حتى منخفضة قرار USB وكاميرا ويب توفر أفلام ذات جودة كافية لحساب مسارات اليرقات (0.3 MP الكاميرا، وأقل من 20 €، الشكل 4D). ويمكن حساب التمعج من المنطقة ولكن القياسات صاخبة جدا. في الإعداد لدينا نحن نستخدم بشكل روتيني النائب كاميرا 4. للفحص، وهذه الكاميرا يسمح بمراقبة 22 سم × 22 سم الساحة، التي تنص بوضوح على فرصة لتحليل أعداد كبيرة من الحيوانات في وقت واحد بحيث تحليل إنتاجية عالية هو ممكن عمليا. باستخدام هذا الإعداد، طول اليرقات طق يمثلها 40 بكسل والتي لا يزال يسمح تسجيل وتحليل التمعج. وتعطى صورة نموذجية من 15 مسارات اليرقات في الانحدار الحرارة في الشكل 5A. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام عدسة الماكرو يسمح لصورة يرقات مع دقة عالية جدا حيث أصبحت العديد من الأعضاء الداخلية واضحة وزيادة تحسين اعتراف رئيس (الشكل 5B). وعلاوة على ذلك يمكن استخدام هذه لتحليل أكثر تفصيلا مزيد من السلوكيات من مجموعة واسعة 20. نفس الإعداد يمكن استخدامها بسهولة لصورة الزحف C. الديدان ايليجانس (الشكل 5C). <img alt="الشكل (4)" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> الشكل 4. FIM التصوير وتتبع النتائج لكاميرات مختلفة. (A) اليسار: التصوير FIM ثلاثة اليرقات الزحف على مرحلة تتبع 10 سم × 10 سم استولت باستخدام 4 النائب الكاميرا مع 10 إطارا في الثانية. منتصف:لقطة ومركز مسار الشامل لليرقة واحدة. يشار مجال الحيوان. الحق: منطقة من اليرقة تآمر أكثر من 100 الإطارات. السهم الأحمر يشير إلى نقطة زمنية من الصورة يثقب. (ب) أي ما يعادل (A) ولكن استولت باستخدام 1.4 MP الكاميرا. (C) أي ما يعادل (A) ولكن استولت باستخدام 0.8 MP الكاميرا. (D) أي ما يعادل ( A) ولكن القبض باستخدام 0.3 MP الكاميرا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> الشكل 5. التحفيز الحراري، وارتفاع القرار التطبيقات. (A) تطبيق التحفيز الحراري (مقارنة الشكل 1). مسارات تحسب عن طريق FIMTrack. (B) صورة عالية الدقة تطبيق الثلث والثانية والأولى اليرقة الطور باستخدام عدسة الماكرو. ويمثل طول اليرقات الطور الثالث من قبل 400 بكسل في مجال الرؤية من 2.5 × 2.5 سم. (C) وC. اعتقلت ايليجانس دودة باستخدام التصوير FIM. يشار إلى الحانات الحجم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis at JoVE.com

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM هو نظام الرواية، تكلفة التصوير فعالة مصممة لتتبع الأجسام المتحركة الصغيرة مثل C. ايليجانس، المستورقات أو يرقات ذبابة الفاكهة. تم تصميم هذا البرنامج FIMTrack المصاحب لتقديم تحليل البيانات بسرعة وكفاءة. معا، وهذه الأدوات تتيح تحليل الإنتاجية العالية من الصفات السلوكية.

FIM التصوير وFIMtrack: اثنان أدوات جديدة تسمح عالية الإنتاجية والتكلفة تحليل تحرك الفعال

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM هو نظام الرواية، تكلفة التصوير فعالة مصممة لتتبع الأجسام المتحركة الصغيرة مثل C. ايليجانس، المستورقات أو يرقات ذبابة الفاكهة. تم تصميم هذا البرنامج FIMTrack المصاحب لتقديم تحليل البيانات بسرعة وكفاءة. معا، وهذه الأدوات تتيح تحليل الإن?...

Video: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

تصميم وتشييد Headstage فعالة من حيث التكلفة لتحفيز العصبية في وقت واحد والتسجيل في متاهة مائية

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

اثنين من الخوارزميات لإنتاجية عالية ومتعدد حدودي الكمي ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عصبي عضلي مفرق الصرف

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

تحليل الفائق للسلوك الحركي في مقايسة الجزيرة المورفولوجية

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

A عالية الإنتاجية صورة موجهة الخلايا العصبية المجسمة ونظام الموجات فوق الصوتية مركزة لفتح حاجز الدم في الدماغ القوارض

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

عرض شبكات الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية وخلايا العضلات

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم شبكة الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.