Name: measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לג&#39;פרי פארל, ג&#39;יימס גניון, וג&#39;ניפר ברגמן להערות על כתב היד. KWR נתמכה על ידי קרן מדע בוגר תכנית עמיתי המחקר הלאומית במהלך הפיתוח של assay FDAP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מ- NIH לAFS ועל ידי מענקים מקרן המחקר הגרמנית (Emmy תכנית נטר), מקס פלאנק החברה, והתכנית לאדם Frontier המדע (פיתוח קריירה פרס) לראש הממשלה.

אי לנו קונפליקטים לחשוף.

ההצלחה של ניסוי FDAP מסתמכת על הדור של חלבון היתוך photoconvertible פונקציונלי. תיוג חלבון יכול להשפיע על פעילותה הביולוגית ו / או נכסי biophysical, כוללים הלוקליזציה שלה, מסיסות, ויציבות 36-41. להיות מוכן לבחון את הפעילות של כמה מבני היתוך שונים כדי למצוא אחד שהוא פעיל. מצאנו כי ש...

הרמות של חלבונים בתאים ואורגניזמים נקבעות על ידי תעריפי ייצור שלהם ואישור. זמן מחצית חיים של חלבון יכולים לנוע בין דקות לימים 1-4. בהרבה מערכות ביולוגיות, יש הייצוב או אישור של חלבוני מפתח השפעות חשובות על פעילות הסלולר. אפנון של יציבות חלבון תאית נדרש להתקדמות מחזור התא 5,6, איתות התפתחותית 7-9, אפופטוזיס 10, ותפקוד תקין ותחזוקה של נוירונים 11,12. יציבות חלבון תאית משפיעה על ההתפלגות וזמינות של חלבונים מופרשים, כגון morphogens 13,14, בתוך רקמה. במהלך העשורים האחרונים, יציבות חלבון בעיקר הוערכה בתרבית תאים באמצעות דופק תיוג הרדיואקטיבי או ניסויי מרדף cycloheximide 15. בניסויי דופק מרדף כזה, תאים או זמניים נחשפו ל&quot; דופק &quot;של אמין רדיואקטיבייםמבשרי חומצה שמשולבים בחלבונים מסונתזים חדש, או שהם נחשפים לcycloheximide, אשר מעכב את סינתזת חלבון. תאים בתרבית ולאחר מכן נאספו בנקודות זמן שונות, וגם immunoprecipitation אחרי autoradiography (בניסויי דופק מרדף רדיואקטיבי) או מערבית סופג (בניסויי cycloheximide) משמשת לכמת את האישור של חלבון לאורך זמן. יש מבחני יציבות חלבון קונבנציונליים כמה חסרונות. ראשית, חלבונים במבחנים אלה הם בדרך כלל לא באו לידי ביטוי בסביבות אנדוגני, אלא בתרבית רקמה ולעתים בתאים ממינים שונים. לחלבוני יציבותה תלוי קשר, גישה זו היא בעייתית. שנית, לא ניתן לעקוב אחרי שחרור מחלבון בתאים או אורגניזמים בודדים לאורך זמן, והנתונים ממבחנים אלה משקפים ממוצע של אוכלוסיות שונות של תאים בנקודות זמן שונים. מאחר ותאים בודדים אולי התחילועם כמויות שונות של חלבון, אולי לקח את התווית או cycloheximide רדיואקטיביים בזמנים שונים, או שיש לי קינטיקה אישור שונה, נתונים מצרפיים כזה יכולים להיות מטעים. לבסוף, במקרה של ניסויי מרדף cycloheximide, תוספת של מעכב הסינתזה של החלבונים עלולה להיות השפעות פיסיולוגיות בטעות שיכולות לשנות באופן מלאכותי יציבות חלבון 16-18. ניתן להימנע מחסרונות אלה באמצעות הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), טכניקה שמשתמשת בחלבוני photoconvertible למדוד אישור חלבון באופן דינמי באורגניזמים החיים 19-25 (ראה דיון למגבלות של טכניקת FDAP). חלבוני photoconvertible הם חלבוני ניאון עירור פליטה שהתכונות ולשנות לאחר חשיפה לאורכי גל מסוים של אור 26. גרסה הנפוצה אחת היא Dendra2, חלבון &quot;ירוק-עד-אדום&quot; photoconvertible שתחילה יש לשעברמאפייני ציטוט ופליטה דומים לחלבוני ניאון ירוקים, אבל אחרי חשיפה ל&quot; photoconversion &quot;בהיר UV -its עירור / מאפייני פליטה להיות דומים לאלה של חלבוני ניאון אדומים 23,27. חשוב לציין, החלבון חדש שיוצר לאחר photoconversion לא יהיה לי מאפייני עירור / פליטה זהות לחלבון photoconverted, המאפשר ניתוק של ייצור ואישור על photoconversion והתבוננות רק בריכה של חלבון photoconverted. תיוג חלבוני עניין עם חלבוני photoconvertible כך מספק דרך נוחה לדופק תווית חלבונים באורגניזמים שלמים, אופטי נגישים חיים. במבחני FDAP (איור 1 א), חלבון של העניין מתויג עם חלבון photoconvertible ובא לידי ביטוי באורגניזם חי (איור 1). חלבון ההיתוך הוא photoconverted, והירידה באות photoconverted לאורך הזמן מנוטרת על ידי fluorescenמיקרוסקופיה ce (איור 1 ג). הנתונים אז מצויד במודל מתאים כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבון ההיתוך (1D איור). Assay FDAP המתואר כאן נועד לקבוע את זמן מחצית החיים תאיים של חלבוני איתות מופרשים בעוברי דג הזברה בעובר מוקדם 19. עם זאת, גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל אורגניזם מודל שקוף שסובל הדמיה לחיות, ויכול לשמש כדי לפקח על הפינוי של כל חלבון תאיים או תאי taggable. וריאציות של הטכניקה המתוארת כאן בוצעו בתאים בתרבית 20,23 ותסיסנית 22 ועכבר 21 עוברים.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td></tr><tr><td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td></tr><tr><td>6-well plastic dish</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1&amp;nbsp;mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Protease from &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1&amp;nbsp;mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td></tr><tr><td>5 cm diameter glass Petri dish</td><td></td><td></td><td>For embryo dechorionation</td></tr><tr><td>200 ml glass beaker</td><td></td><td></td><td>For embryo dechorionation</td></tr><tr><td>Microinjection apparatus</td><td></td><td></td><td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>For injecting and mounting embryos</td></tr><tr><td>1x Danieau&#039;s medium</td><td></td><td></td><td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.3 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5&amp;nbsp;mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#039;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#039;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1&amp;nbsp;ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &amp;deg;C, re-melted at 70&amp;nbsp;&amp;deg;C, and cooled to 40&amp;#8211;42 &amp;deg;C when ready to use</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td></tr><tr><td>Metal probe</td><td></td><td></td><td>For positioning embryos during mounting</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td></tr><tr><td>15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td></td><td></td><td>A mercury arc lamp, 488&amp;nbsp;nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td></tr><tr><td>Heated stage</td><td></td><td></td><td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &amp;deg;C during the experiment</td></tr><tr><td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td><td></td><td></td><td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25X or 40X water objective</td><td></td><td></td><td>Objective for imaging</td></tr><tr><td>10X air objective</td><td></td><td></td><td>Objective for photoconversion</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td></td><td></td><td>Immersion oil with the same refractive index as water</td></tr></tbody></table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

יציבות חלבון משפיעה על היבטים רבים של ביולוגיה, ומדידת קינטיקה השחרור של חלבונים יכולה לספק תובנות חשובות במערכות ביולוגיות. בניסויי FDAP, האישור של חלבונים בתוך אורגניזמים חיים ניתן למדוד. חלבון של העניין מתויג עם חלבון פלואורסצנטי photoconvertible, בא לידי ביטוי בvivo וphotoconverted, והירידה באות photoconverted לאורך הזמן היא פיקוח. הנתונים אז מצויד במודל פינוי מתאים כדי לקבוע את חלבון מחצית החיים. חשוב לציין, קינטיקה פינוי אוכלוסיות חלבון בתאים שונים של האורגניזם יכולה להיבחן בנפרד על ידי יישום מסכות compartmental. גישה זו נעשתה שימוש כדי לקבוע את זמן מחצית החיים התוך וחוץ-תאיים של חלבוני איתות מופרשים במהלך פיתוח דג הזברה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניסויי FDAP בעוברי דג הזברה. זה צריך להיות אפשרי להשתמש FDAP לקבוע קינטיקה סליקתכל חלבון taggable בכל אורגניזם אופטי נגיש.

FDAP נעשה שימוש כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבוני איתות תאיים בעוברי דג הזברה 19. אחד מחלבונים אלו, פזילה, גורמת ביטוי של גני mesendodermal במהלך embryogenesis 34. לפזול-Dendra2 מפעיל ביטוי של גני mesendodermal ברמות דומות לפזילה לא מתויגת, כפי שהודגם על ידי qRT-PCR ובמבחני הכל?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.2K Views.  Harvard University.  רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo. 

Video: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג זברה באמצעות CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genetics

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biology

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence