אנו מודים ברנרד Kulemaka וחברי המעבדה סמית שלהם הערות מועילות והדרכה ריאגנט, סאם קונל, ברנט רדפורד של 3עכשיו עבור פילדינג הדמיה שאלות, דבורה באנג, קארן הקשבה, קיי סטיוארט לטיפול דג זברה. עבודה זו נתמך על ידי את אוניברסיטת נוטרה דאם, האליזבת, מייקל משפחה, אלפרד פ סלואן קרן, מרכז מחקר דג זברה אוניברסיטת נוטרה, מרכז של תאי גזע, רפואה רגנרטיבית-אוניברסיטת נוטרה דאם. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל נעשו בהתאם אוניברסיטת נוטרה דאם IACUC ד ר קודי סמית.

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת Notre Dame אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. הכנת דג זברה הדגימה
<ol><li>מקום אחד גבר בוגר אחד למבוגרים נקבה Tg (חלבון להמרה) לתא ההזדווגות לפי נהלי13. כתב יד זה, להשתמש Tg(sox10:eos) דגים9 בגלל גישה אבל קווים הטרנסגניים אחרים עם חלבון photoconvertible יכול לשמש באותה מידה. הגדרת תא אחד או יותר למקרה דגים אל תרים. לאפשר את הדג להישאר בבית הבליעה למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת בבוקר, לאסוף את הביצים בתוך צלחות פטרי 100 מ מ. לאפשר ביצים להבשיל עד 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) לפני ההקרנה.</li>
	<li>אם חיות לעיל היו heterozygotes על transgene מסך 24 מנות hpf עבור Tg(sox10:eos) + העוברים עם 488 ננומטר מקור אור ואביזרים GFP לסנן סטים על מיקרוסקופ ויבתר. לבודד Tg(sox10:eos) + עוברי ולאפשר להבשיל ל-48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate עוברי ידנית עם מחט או פינצטה.</li>
	<li>הכנה של מיקרוגל 5 מ של 0.8% פתרון agarose נקודת התכה נמוכה.<ol>
<li>לאחר agarose קרירות למגע, מקום 3-4 Tg anesthetized (sox10:eos) + 48 hpf דגים במרכז זכוכית 10 מ מ- coverslip בתחתית צלחת פטרי.</li>
		<li>הוסף agarose מספיק כדי לכסות את פני השטח של coverslip, כ 1 מ"ל. שימוש במחט בדיקה לסדר את הדג על הצדדים שלהם. לאפשר agarose לגבש כדי להבטיח הרכבה של בעלי חיים. יתכן צורך ללא הרף לארגן את דג זברה מחדש עד אגר עפור14. התמצקות לוקח כ 2 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר agarose התחזק למשך 2 דקות, להוסיף לאט העובר בינוני המכיל 0.02% חומצה aminobenzoic אסתר (Tricaine) לדרוש עד מהמשטח התחתון של אגר, מאכל שקוע. זה צריך להיות כ 3 מ.</li>
</ol>2. מיקרוסקופ הרכבה והדמיה מראש המרה
<ol><li>פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דגים הדמיה."</li>
	<li>במקום הדגימה על היקף קונאפוקלית ולהביא להתמקד באמצעות קורס וידיות התאמת משובח.</li>
	<li>פתח את החלון המוקד ואתר האזור הרצוי של הריבית (כלומר השורש העזוב הגרעינים).</li>
	<li>בחר את הלייזר c488 תחת תפריט להגדיר מסנן. הגדר את החשיפה 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].</li>
	<li>סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. הטווח שניתן עלה או ירד כדי לאכלס העומק של אזור ההדמיה. עבור חוט השדרה ערך בטווח בין 35-40 ערימות היא בדרך כלל מספיק [איור 5].</li>
	<li>בחר במיקום הנוכחי [איור 5].</li>
	<li>לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.</li>
</ol>3. תא בודד Photoconversion
<ol><li>פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דג ablate שבב מלא".</li>
	<li>בחר הלייזר c488 ו- c541 תחת תפריט להגדיר מסנן. אם אינך משתמש בתוכנה מיקרוסקופ זהה, למצוא תפריט כדי לבחור לייזרים שונים, בחר 488 ננומטר, לייזרים nm 541. הגדר את חשיפות 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2]. הגדרות אלה לייזר נבחרו על סמך הפקת מספיק אותות פלואורסצנט מבלי לגרום photobleaching או רעילות. אם רעילות או photobleaching הוא מדמיין, להפחית את עוצמת הלייזר או חשיפה.</li>
	<li>פתח את החלון המוקד ולחץ על הכרטיסיה photomanipulation בחלון המוקד. להתאים את הפרמטרים לייזר בהתאם. לשנות את עוצמת הלייזר מחסנית ל- 2 ולאחר מכן לחץ על ללכת. לשנות את גודל הבלוק רסטר 1 ולחץ על הגדר. לשנות את גודל פעמיים ל- 4. לשנות את קו לייזר v405 [איור 3].</li>
	<li>פתח את קביעות הלכידה מתקדמות בחלון הלכידה. בחר את הכרטיסיה photomanipulation ולשנות את מספר החזרות פעמיים 2. לחץ על אישור [איור 4].</li>
	<li>בחר את הכרטיסיה XY בחלון המוקד. בדוק את הפרמטרים לייזר משלב 2 בכרטיסיה ' photomanipulation ' [איור 3, איור 4]. קבע את הגדרות לייזר כדי photoconvert התא של הריבית בלי photoconversion של התאים שמסביב.<ol>
<li>אם photoconversion של תאים סמוכים, להפחית את עוצמת הלייזר. אם photoconversion של תאים לא התרחשה, כוחות לייזר יכול להיות מוגברת. בצורה אופטימלית, הגדר עוצמת הלייזר photoconvert רק האזור של עניין לא ובסביבותיו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סמן את התיבה timelapse תחת ללכוד את סוג. לאחר מכן, לחץ על התחל [איור 6A].</li>
	<li>לאחר פתיחת החלון timelapse בשידור חי, בחר בכלי עיגול בסרגל הכלים העליון [איור 7]</li>
	<li>לצייר עיגול באזור centermost של התא. קליק ימני המעגל מצוירות, בחר אזור FRAPוהמתן 3 שניות. האזור שנבחר צריך להיות דימר [איור 8]. לחץ על עצור לכידה.</li>
	<li>אם הדמיה חיה יותר מפעם אחת, לחזור אל הכרטיסיה XY המוקד תפריט, בחר במיקום 2. . אז, חזור על השלבים 4.1-4.6.</li>
	<li>כדי להמיר אוכלוסיה של תאים, בצע את הפרמטרים פרוטוקול ו לייזר עבור שלבים 4.1-4.4 למעט במקום לצייר עיגול FRAP האזור של הריבית, השתמש בכלי שורת. צייר קו על האזור של הריבית, FRAP האזור באמצעות אותם פרמטרים המפורטים לעיל.</li>
</ol>4. פוסט-photoconversion הדמיה
<ol><li>לאחר כל נקודות photoconverted. בחר הערימה תמונה רגילה מעבדה ספציפי הגדרת שמתואר precoversion הדמיה שלב 3. זה נמצא תחת התפיסה הגדרת הנפתחת tab בחלון לכידת [איור 5].</li>
	<li>בחר את הלייזר c488, להגדיר את החשיפה 300ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].</li>
	<li>בחר את הלייזר c541 נמצא תחת התפריט כמו הלייזר c488. הגדר את החשיפה 500 ms, לייזר כוח 10, ולהגדיל ל 75 [איור 9].</li>
	<li>סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. המספר טווח עשויה להגדיל או להקטין כדי להתאים את עומק ההדמיה הרצויה [איור 5].</li>
	<li>אם ישנן נקודות מרובות בכרטיסיה המוקד XY, בחר באפשרות רשימת רב-נקודתי בחלון הלכידה. אם לא, בחר במיקום הנוכחי.</li>
	<li>לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling.">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li><li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Fluorescent+timer&amp;#34;:+protein+that+changes+color+with+time.">&amp;#34;Fluorescent timer&amp;#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li><li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ברקמות מורכבות, סוגי תאים נפרדים לארגן לתחומים ספציפיים. לאחרונה כבר מנוצל טכניקות תווית בתאים בודדים בתוך אלה רקמות גדולות מבנים1,2,3. כאן נדגים שתי טכניקות באופן דומה יכול להיות מנוצל כדי להמחיש תא בודד אינטראקציות והן תא אינטראקציות הא?...

תאים נפרדים מרובים אינטראקציה לבנות ולתחזק מורכבים רקמות. תאים אלה הם לעתים קרובות intercalated, שקשה להבדיל בין שכנים ברמה תא בודד ללא מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הדורשים קיבוע של רקמות. עם זאת, כדי להבין כיצד אלה הטופס רקמות, מתוחזק, ולהיות חולה, זה היה חיוני לחקור איך חד תאים בתוך הרקמה אינטראקציה לאורך זמן. באופן אידיאלי, ניסויים אלה דורשים תיוג של תאים בודדים בתוך רקמה בצורה לא פולשנית ללא הדרישה של קיבעון. כעת, מדענים פיתחו טכניקות רבות כדי להשלים את המשימות1,2,3,4.
לצורך גילוי והיישום של החלבון הניאון מדוזה ירוק (GFP) היה אחד גישה מרגש המותר עבור תיוג של תאים נפרדים ב- הסביבה הרקמה1. באמצעות תאים ספציפיים היזמים, זה אפשרי לבחירת גנטית בתאים המסומנות1. לחלופין, ביטוי מושרה ויראלי של GFP יכול להיות מנוצל עבור המשתמש שנבחר ביטוי של GFP3,4. למרות שימושי למדי, הגנטי בתיווך של GFP אינה מאפשרת המשתמש שנבחר הביטוי בתוך קבוצת משנה של תאים בתוך הרקמה; וניתן ביטוי נגיפי ה-GFP, למרות יתרון, פולשני. עם כניסתו של GFP נגזרים וטכניקות חכם כמו Brainbow לבטא חלבונים פלורסנט ברורים יותר בדלילות בתוך רקמות, זה הפך אפשר לדמיין תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם רקמות מורכבות2, 5. עם זאת, גישות אלה תווית תאים באופן אקראי. אם הניסוי הרצוי דורש ויזואליזציה של תא בודד או אוכלוסיית תאים אשר מוגדרת על ידי הנסיין, הם לכן מוגבל. עם ניסויים כאלה, זה יהיה יתרון יש חלבון פלואורסצנטי ביטוי גנטית אפשר לגרום להם להבחין, באופן תא בודד, זה של תאים אחרים פלורסנט, הלא-פלורסנט.
כדי להשיג מטרה זו, ולהמחיש את ביולוגיה של התא של תאים בודדים בתוך רקמת החיים מורכבים, הקהילה המדעית משתמש photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט ברורים-6,-7,-8. באמצעות גנטית מבוקר הביטוי של photoconvertible חלבון (קרי, eos, קאךה, וכו ') זה המעברים מ ירוקה למצב ניאון אדום כאשר הם נחשפים UV (488 ננומטר) אור, אנחנו. יכולים להבחין תא בודד מן שלה שכותרתו fluorescently השכנים6,7,8. גישה זו מנצל מכשירים המחוברים שלנו מיקרוסקופ קונפוקלי אשר יכולים לכוון את האור מאוסף לייזר לאזור מוגבל עקיפה של עניין. בטכניקה זו, אנו יכולים גם תווית תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות צורה על-ידי המשתמש9,10,11. הטכניקה היא פולשנית בהשוואה לתא בודד זריקות של נגיפי ה-GFP. מהווה הוכחה של המושג, אנחנו מראים שאנחנו יכולים photoconvert תאים בודדים בתוך גנגליון מערכת העצבים ההיקפית, photoconvert אוכלוסיות גדולות יותר כמו תאים ממוקם על הצד הבטני של חוט השדרה9,10, 11,12. אנחנו מכן יכול לדמיין photoconverted תא אוכלוסיות אלה 24 שעות מאוחר יותר כדי לזכות בתובנה שלהם התנועה ובידול במהלך הפיתוח.

<table><tbody><tr><td>&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;Tg(&lt;em&gt;sox10:eos&lt;/em&gt;)&lt;/font&gt;&lt;font class=&quot;font0&quot;&gt; zebrafish animals&lt;/font&gt;</td><td></td><td></td><td>Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td></tr><tr><td>0.8% Low Melting Point Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Needle dissecting probe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td><td>Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td><td>3i spinning disk confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light source (laser) for photoconversion</td><td>405 nm laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

רקמה חיה and הצומח מורכב של אוכלוסיות שונות של תאים. תאים אלה אינטראקציה לאורך זמן לבנות ולתחזק את הרקמה והוא יכול לגרום לטטנוס כאשר משובשות. מדענים פיתחו טכניקות חכם כדי לחקור את המאפיינים ואת הדינמיקה הטבעית של תאים אלה בתוך רקמת ללא פגע על ידי הבעת פלורסנט חלבונים בתוך קבוצות משנה של תאים. עם זאת, לעתים, ניסויים דורשים יותר שנבחר ויזואליזציה של תאים בתוך הרקמה, לפעמים על האופן תא בודד או אוכלוסייה-של-תאים. כדי להשיג זאת דמיינו תאים בודדים בתוך אוכלוסייה של תאים, נעזרו מדענים photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט. להפגין טכניקה זו, אנו מציגים כאן כיצד לכוון אור UV לתא Eos-הבעת התעניינות שלם, חי דג זברה. אנחנו מכן תמונה באותם תאים Eos+ photoconverted 24 שעות מאוחר יותר כדי לקבוע איך הם שינו ברקמה. אנו מתארים שתי שיטות: יחיד תא photoconversion ו- photoconversions של אוכלוסיות של התא. שיטות אלה ניתן להמחיש אינטראקציות תא-תא, תא-גורל בידול, ואת נדידת תאים, הפיכתה טכניקה הרלוונטיים בשאלות ביולוגיות רבות.

Photoconversion של חלבונים פלורסנט ניתן לסמן תאים נפרדים בתוך רקמת6. כדי להדגים את זה, Tg(sox10:eos) דגים9 שימשו כדי להביע את החלבון photoconvertible Eos תחת רצפי רגולטוריות sox10. החיות Tg(sox10:eos) של 48 hpf היה רכוב קודם ולאחר מכן עם תמונה כדי לזהות כל photoconversion שא?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish at JoVE.com

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K Views.  University of Notre Dame. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Video: Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biology

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural circuitry facilitate the use of optogenetic techniques in cellular analyses of behavior. Fluorescent indicators of in vivo neural activity, such as GCaMP6s, have been widely used to study the neural activity associated with simple behaviors in larval zebrafish. Here, we present a protocol for detecting sensory-induced activity in semi-restrained zebrafish larvae using the transgenic line Tg(elav3:GCaMP6s). In particular, we use the chemical agent allyl isothiocyanate to induce a robust, reproducible fluorescent response in a brain region at the border of the hindbrain and spinal cord. We discuss the potential uses of GCaMP6s for optical monitoring of neural activity during a range of behavioral paradigms and the limitations of this technique. Our protocol outlines an accessible approach for monitoring dynamic, behavior-related in vivo neural activity in the larval zebrafish brain.

Here, we present a detailed protocol to examine neural activity in brain regions of transgenic zebrafish that express GCaMP calcium indicators using confocal microscopy.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural ...