This paper is dedicated to my beloved wife Maren and our little Karl.

1. הכנת עיני שור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עיני שור ישירות לאחר החיה שנשחטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את העיניים מוגנות ב&quot; Sickel-פתרון &quot;בינוני מיוחד המכיל 120 mM NaCl, KCl 2 מ&quot;מ, 0.1 מ&quot;מ MgCl 2, 0.15 מ&quot;מ CaCl 2, 1.5 מ&quot;מ לאא 2 גלוקוז מ&quot;מ 4 PO, 13.5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 ו -5 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את ההכנה של הרשתית בתנאים מותאמים כהים עם אור אדום עמום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק הקדמי של העין. בצע בערך חתך משווני אחורי 4 מ&quot;מ לימבוס. לאחר מכן להסיר את הקרנית, קשתית, גוף הריסים ועדשה בחתיכה אחת. שמור את הרשתיות בSickel-פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לשחרר קבצים מצורפים זגוגית אל פני השטח הרשתית והזגוגית להסיר מכוס עין הפתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן מחלק את העין לארבעה רבעים ואגרוף החוצה עגול אזורים של CA. 7 מ&quot;מ קוטר באמצעות מקדחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את הרשתיתמאפיתל הפיגמנט ולמקם אותו על מכשיר הקלטה בתוך קופסא המוגנת מפני אור. מכשיר ההקלטה מורכב ממתחזק פלסטיק עם רשת באמצע; למקם את הרשתית ברשת ולאחר מכן לתקן עם טבעת פלסטיק ישירות על האלקטרודות. הערה: יש מתחזק הפלסטיק שני ערוצים כדי לאפשר זרימה מתמדת של המדיום. </li></ol> 2. הקלטה electroretinogram (ERG) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לרשום electroretinogram, להשתמש בשתי אלקטרודות כסף / כסף-כלוריד בכל צד של הרשתית וינקב הרשתית במהירות זלוף קבועה של CA. 1 מיליליטר / דקה וטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. השתמש ב&quot; Sickel-הפתרון &quot;רווי בחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל את המדידה, כהה להתאים את הרשתית (להגן עליו מפני אור במהלך כל המדידות) ולהשתמש במרווחים של חמש דקות גירוי. השתמש בבזק 1 הרץ יחיד לבן קסנון לגירוי בעוצמה מוגדרת 6.3 MLX על פני השטח הרשתית. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מכויל מסנני צפיפות ניטראליים וגירוי אור של 10 μsec נשלט על ידי שעון עצר כדי שתהיה לי תגובות אופטימליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד ולעבד את הנתונים, לסנן ERG ומגביר אותו (מסנן high pass 100 הרץ, 50 מסנן חריץ הרץ, 100,000 x הגברה) באמצעות דשא RPS312RM מגבר. נסה לסנן תדרים מטרידים אפשריים שעלולים להפריע לאות. כדי לעבד את הנתונים, השתמש רכישת לוח אנלוגי לדיגיטלי נתונים במחשב שולחני (PC תואם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת ההסתגלות הכהה מנות קבועות, למדוד את אמפליטודות של האות החשמלי עד אמפליטודות ב-גל יציב נרשמת. הערה: אמפליטודות נחשבת יציבה אם חמש מדידות יחידים להגיע לערך ממוצע ולסטות פחות מ -10%. דוגמא טובה למדידות בודדות ניתנת באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את הבדיקה, להחליף חמצן טהור או על ידי חנקן טהור (מספר הניסויים בודדים, n = 5) לבדיקת היפוקסיהאו גלוטמט מיקרומטר 250 (n = 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התגובות חשמליות כל 5 דקות במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הבדיקה, תנקב את הרשתיות עם מדיום סטנדרטי רווי בחמצן במשך 75 דקות ומסתכלים על השינויים של משרעת ב-הגל. זהו שלב השטיפה. מדוד את משרעת ב-גל מהשפל של הגל לשיא של ב-הגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחקור את ההשפעה של היפוקסיה או גלוטמט על פוטנציאל קולטי האור בתנאי scotopic, לדכא ב-הגל על ​​ידי הוספת 1 מ&quot;מ לפתרון התזונתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטת פוטנציאל קולטי אור יציב למשך 30 דקות, לבצע את ההליך כמו קודם, חושף את הרשתיות 45 דקות לפתרונות השקיה השונות עם 1 מ&quot;מ aspartate. השתמש באותה תקופה מתנה (שלב 2.8) כאמור. </li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעריך סטטיסטית את הנתונים, להבטיח התפלגות נורמלית לכל הנתונים, למשל באמצעות קולמוגורוב-סמירנובבדיקה 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הפחתת עוצמות a- וb-גל באחוזים לאחר שלב החשיפה בהשוואה למדידה האחרונה לפני התערוכה. השווה את ההפחתה של ERG-אמפליטודות לאחר 45 דק &#39;- בסוף תקופת התערוכה - לERG נמדדה לפני היישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את גל a- וb- בסוף שלב השטיפה למשרעת המקבילה לפני התערוכה לבחון התאוששות אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח סטטיסטי, להשתמש בתוכנת תוכנת JMP הסטטיסטית או תוכנת SPSS. לחשב נתונים לאורך כממוצע ± סטיית תקן. להעריך את משמעות על-פי המבחן הסטטיסטי המתאים. הערה: בדיקות אלה עשויות להיות שונות, בהתאם להיקף ניסיוני. בהגדרה זו, להשתמש במבחן t המזווג של הסטודנט. </li></ol>

<ol>
	<li>Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+central+retinal+artery+occlusion:+clinical+presentation+and+management.">A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management.</a> Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).</li><li>Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertension-related+eye+disorders).">Hypertension-related eye disorders).</a> Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).</li><li>Feltgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+of+the+European+Assessment+Group+for+Lysis+in+the+Eye+(EAGLE)+for+the+treatment+of+central+retinal+artery+occlusion:+design+issues+and+implications.+EAGLE+Study+report+no.+1+:+EAGLE+Study+report+no.+1.">Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).</li><li>Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+glutamate+levels+in+the+vitreous+body+of+humans+and+monkeys+with+glaucoma.">Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma.</a> Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).</li><li>Bertram, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+levels+in+subretinal+and+vitreous+fluid+of+patients+with+retinal+detachment.">Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment.</a> Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).</li><li>Diederen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamate+levels+in+the+vitreous+of+patients+with+retinal+detachment).">Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment).</a> Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).</li><li>Ientile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+necrosis+occurring+in+excitotoxic+cell+death+in+isolated+chick+embryo+retina.">Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina.</a> J Neurochem. 79, 71-78 (2001).</li><li>Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activators+promote+excitotoxicity-induced+retinal+damage.">Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage.</a> FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).</li><li>Ambati, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+gamma-aminobutyric+acid,+glutamate,+and+vascular+endothelial+growth+factor+levels+in+the+vitreous+of+patients+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy.</a> Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).</li><li>Vorwerk, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depression+of+retinal+glutamate+transporter+function+leads+to+elevated+intravitreal+glutamate+levels+and+ganglion+cell+death.">Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).</li><li>Schultheiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dulbecco's+Modified+Eagle+Medium+is+neuroprotective+when+compared+to+standard+vitrectomy+irrigation+solution.">Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effects+of+two+different+irrigation+solutions+on+an+isolated+perfused+vertebrate+retina.">Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina.</a> Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).</li><li>Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+and+Electrical+Responses+to+Light+Simulation+in+the+Retina+of+the+Frog.">Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog.</a> Science. 148, 648-651 (1965).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.+Brain+research.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research.</a> Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).</li><li>Henderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+experimental+data+for+univariate+normality.">Testing experimental data for univariate normality.</a> Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).</li><li>Alt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroprotective+potential+of+Rho-kinase+inhibition+in+promoting+cell+survival+and+reducing+reactive+gliosis+in+response+to+hypoxia+in+isolated+bovine+retina.">The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina.</a> Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision research. 39, 2165-2177 (1999).</li><li>Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+standardization:+cure+or+cause+of+poor+reproducibility+in+animal+experiments.">Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments.</a> Nat Methods. 6, 257-261 (2009).</li><li>Dutescu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifocal+ERG+recordings+under+visual+control+of+the+stimulated+fundus+in+mice.">Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 2582-2589 (2013).</li><li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+retinal+toxicity+of+drugs+in+animal+models+using+electrophysiological+and+morphological+techniques.">Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques.</a> Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).</li><li>Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Did+myocilin+evolve+from+two+different+primordial+proteins.">Did myocilin evolve from two different primordial proteins.</a> Mol Vis. 8, 271-279 (2002).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+retinal+toxicity+of+a+new+heavy+intraocular+dye,+using+a+model+of+perfused+and+isolated+retinal+cultures+of+bovine+and+human+origin.">Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במחקר זה, יש השפעה משמעותית על משרעת ב-הגל לאחר 45 דקות של חוסר חמצן נמצאה. הפחתה זו עדיין הייתה משמעותית לאחר שלב השטיפה. השפעה דומה על פוטנציאל קולטי האור יכולה להיות שנצפתה. התוצאות נתמכות על ידי נתונים אחרים שפורסמו 16 ולתת...

Neuroprotection היה שדה חזק של חקירה במחקר רפואת עיניים בעשורים האחרונים. הרשתית היא רשת עצבית רגישה מאוד שתלוי באופן משמעותי בחמצון ומושפע במידה רבה על ידי חילוף החומרים של תאים המקיפים אותה. פתולוגיות עיניות עיקריות הקשורות לנזק לתאי עצב הן חסימות כלי דם ברשתית, גלאוקומה, והיפרדות רשתית. חסימת עורק רשתית, כדוגמא לחסימה של כלי דם ברשתית, מובילה לאובדן פתאומי של ראייה בשל חוסר חמצן של הרשתית הפנימית 1. היא קשורה לעתים קרובות עם פתולוגיות כלליות של כלי דם 2 ומובילים לאובדן ראייה מתמשך 1, עם רק 8% מהחולים מתאוששים חדות ראייה באופן משמעותי 1. למרות הפירוק פיברין עורקים הוצע כאפשרות טיפול, התועלת לא ניתן לראות בניסוי קליני אקראי 3. גלאוקומה והיפרדות רשתיתלשניהם יש עלייה בריכוז הגלוטמט 4-6. גלוטמט בתנאים פיסיולוגיים הוא נתקל כמשדר מעורר בכל מערכת העצבים המרכזית וכל 7,8 הרשתית הפנימית. רמות גבוהות גלוטמט נמצאו לא רק בגלאוקומה והיפרדות רשתית 5,6 אלא גם ברטינופתיה סוכרתית שגשוג 9. עלייה בגלוטמט אולי מובילה להפעלת יתר רעילה, ולכן, תאי עצב נזק 10. ברוב המקרים של היפרדות רשתית ובמקרים מסוימים של ניתוח שגשוג רטינופתיה סוכרתי ברשתית (vitrectomy Plana pars) הם הכרחיים. במהלך המניפולציה מכאנית vitrectomy Plana סעיפים, אור הבהיר של הסיבים האופטיים או מאמץ גזירה המופעל על ידי ספיקות גבוהות של פתרונות השקיה במהלך פעילות ארוכה להפעיל לחץ נוסף על 11,12 הרשתית. כל המחלות שהוזכרו במשותף שפתולוגיה היא מקומית לרטיןלבד ומהווים קהילת ophthalmologic עם האתגר למצוא דרכים להגן על הרשתית כמערכת נוירו. Electroretinogram (ERG) הוא השיטה סטנדרטית להערכת in vivo פונקצית קולטי אור (גל) והפונקציה של הרשתית הפנימית (ב-גל). ERG נמדד בכסף-אלקטרודות הציגו לתוך הקרנית והעיניים נמצאות מגורה על ידי רמה הולך וגדל של אור כדי לזהות פגמים במוטות או קונוסים או ברשתית הפנימית. פגמים שונים ברשתית יכולים להיות מזוהים על ידי שינויים במשרעת (עוצמת התגובה) או חביון (תגובה-מרווח זמן ל) של ERG. שיטות פרוטוקול ומדידת ERG שונות (דפוס-ERG, multifocal-ERG או שדה בהיר ERG) מאפשרים בידול נוסף של פגמים. הטכניקה של הרשתית המבודדת כבר הציגה לאחרונה, כך שניתן לבדוק את ההשפעות על הרשתית ללא הפרעות מלמשל בעלי חיים מחקר שלתגובות כלליות 13,14. זה היה מטרת מחקר זה להעריך ולהציג את מודל מתח מוגדר ואחיד להיפוקסיה ומתח גלוטמט על הרשתית המבודדת superfused. לפיכך, אנו מקווים להניח את היסודות למחקרים עתידיים על השפעות נוירו של סוכנים מסוימים או פתרונות השקיה התוך עיני.

<table><tbody><tr><td>120 mM NaCl&amp;nbsp;</td><td>Merck Pharma, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>2 mM KCl,&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Merck Pharma, Germany</td><td>1,050,010,250</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM MgCl2,&amp;nbsp;</td><td>Merck Pharma, Germany</td><td>58,330,250</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mM CaCl2</td><td>Merck Pharma, Germany</td><td>111 TA106282</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Merck Pharma, Germany</td><td>1,065,860,500</td><td></td></tr><tr><td>5 mM glucose</td><td>Merck Pharma, Germany</td><td>40,741,000</td><td></td></tr></tbody></table>

glutamate and hypoxia as a stress model for the isolated perfused vertebrate retina

Neuroprotection היה שדה חזק של חקירה במחקר רפואת עיניים בעשורים האחרונים ומשפיע מחלות כגון גלאוקומה, חסימת כלי דם ברשתית, היפרדות רשתית, ורטינופתיה סוכרתית. זה היה מושא מחקר זו כדי להציג מודל מתח סטנדרטי לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד. רשתיות שור הוכנו וperfused עם פתרון סטנדרטי חמצן רווי, וERG נרשם. לאחר ההקלטה ב-גלים יציבים, היפוקסיה (N הטהור 2) או מתח גלוטמט (250 מיקרומטר גלוטמט) שהופעל במשך 45 דקות. כדי לחקור את ההשפעות על תפקוד קולטי אור לבד, 1 aspartate מ&quot;מ נוסף לקבלת-גלים. ERG-התאוששות הייתה פיקוח על 75 דקות. להיפוקסיה, ירידה בגל משרעת של 87.0% נרשמה (p &lt;0.01) לאחר זמן אקספוזיציה של 45 דקות (ירידה בשיעור של 36.5% לאחר תום p כישלון = 0.03). בנוסף, decr ראשונילהקל באמפליטודות ב-גל של 87.23% נרשמו, שהגיעה למובהקות סטטיסטיות (p &lt;0.01, ירידה בשיעור של 25.5% בסוף השטיפה, p = 0.03). עבור 250 מיקרומטר גלוטמט, ירידה של 7.8% ראשוני של אמפליטודות-גל (p&gt; 0.05) ואחריו ירידה של 1.9% (p&gt; 0.05). ירידה של 83.7% מאמפליטודות ב-גל (p &lt;0.01) צוין; לאחר כישלון של 75 דקות הירידה הייתה 2.3% (p = 0.62). במחקר זה, מודל מתח סטנדרטי מוצג שעשוי להיות שימושי כדי לזהות השפעות נוירו אפשריות בעתיד.

אחרי שעה 1 של זלוף של הכנות רשתית עם פתרון רווי חמצן סטנדרטי (איור 1 א &#39;וב&#39;) ERG-אמפליטודות הראתה התייצבות ופחות וריאציה של אמפליטודות בין מדידות בודדות. pH, לחץ האוסמוטי, טמפרטורה, וPO 2 (פרט לבדיקות היפוקסיה) נשמרו קבועים לכל הבדיקות. <p class="jove_content" style=";text-align:...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina at JoVE.com

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

עם מחקר זה, אנו מציגים מודל מתח סטנדרטי לרשתית שור superfused המבודדת לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד. ההשפעה או היפוקסיה (N הטהור 2) או מתח גלוטמט (250 גלוטמט מיקרומטר) על תפקוד רשתית מיוצג על ידי a- ואמפליטודות ב-גל הוערכה.

גלוטמט והיפוקסיה כמודל מתח לperfused חוליות הרשתית מבודדת

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

glutamate-hypoxia-as-stress-model-for-isolated-perfused-vertebrate

Research

JoVE Journal

Medicine

7.8K Views.  University Eye Hospital Tübingen.  עם מחקר זה, אנו מציגים מודל מתח סטנדרטי לרשתית שור superfused המבודדת לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד. ההשפעה או היפוקסיה (N הטהור 2) או מתח גלוטמט (250 גלוטמט מיקרומטר) על תפקוד רשתית מיוצג על ידי a- ואמפליטודות ב-גל הוערכה. 

Video: Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Neuroscience

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Bioengineering

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע&quot;י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. To investigate pathological mechanisms of retinal ischemia, relevant experimental models need to be developed. Anatomically, a main retinal blood supplying vessel is the ophthalmic artery (OpA) and OpA originates from the internal carotid artery of the common carotid artery (CCA). Thus, disruption of CCA could effectively cause retinal ischemia. Here, we established a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion (tBCCAO) to tie the right CCA with 6-0 silk sutures and to occlude the left CCA transiently for 2 seconds via a clamp, and showed that tBCCAO could induce acute retinal ischemia leading to retinal dysfunction. The current method reduces reliance on surgical instruments by only using surgical needles and a clamp, shortens occlusion time to minimize unexpected animal death, which is often seen in mouse models of middle cerebral artery occlusion, and maintains reproducibility of common retinal ischemic findings. The model can be utilized to investigate the pathophysiology of ischemic retinopathies in mice and further can be used for in vivo drug screening.

Here, we describe a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion using simple sutures and a clamp. This model can be useful for understanding the pathological mechanisms of retinal ischemia caused by cardiovascular abnormalities.

דגם מורין של פגיעה איסכמית ברשתית הנגרמת על ידי חסימת עורקים דו-צדדית משותפת חולפת

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

גלוטמט והיפוקסיה כמודל מתח לperfused חוליות הרשתית מבודדת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video