אחד האתגרים בחקר הרשתית הוא לחקור את ההצלבה בין תאים שונים, כגון נוירונים ברשתית, תאי גליה ותאי כלי דם. בפרט, בידוד והתרבות של נוירונים ברשתית הוא מאתגר. אנו מאמינים כי צמח רשתית בתרבית יכול להתגבר על מגבלה זו ולהציע מערכת ex vivo ייחודית המאפשרת לנו לחקור את ההצלבה בין תאי רשתית שונים, תחת פרמטרים ביוכימיים מבוקרים היטב, ובלתי תלויים במערכת כלי הדם.
כמו כן, יציאת רשתית היא כלי סינון בולט לחקר התערבויות פרמקולוגיות חדשניות במחלות רשתית ונוירודגנרטיביות שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, המאופיינת בפגיעה וסקולרית ועצבית. המעבדה שלנו חוקרת שינויים פתופיזיולוגיים, המקדמים תפקוד לקוי של הרשתית המיקרו-וסקולרית במשך שנים. השימוש במגוון רחב של מודלים, כולל מודלים in vivo ו-in vitro, אפשר לנו לייעל טכניקות רבות בתוך המעבדה שלנו.
במאמר זה נתאר פרוטוקול מפורט לצמחי רשתית שמקורם בעכבר בוגר מסוג בר שניתן לשמור בתרבית במשך שבועיים. שמור על בעלי החיים שוכנים תחת טמפרטורה קבועה וסביבה מבוקרת אור. בדקו כל בעל חיים לבריאות, מזון הולם ומים.
הקפידו לספק לבעלי החיים מזון טרי ומים נקיים. החלפת כלובים מלוכלכים על בסיס יומי או לפי הצורך לבריאות בעלי החיים. יש להשתמש בעכברים שחורים זכרים בני יותר מ-12 שבועות.
להרדים את בעלי החיים בכלוב הביתי שלהם על ידי שאיפת מנת יתר של פחמן דו חמצני. לאחר השלמת ההליך, אשר את מות החיה בשיטה מתאימה, כגון אישור דום לב ונשימה או התבוננות בתלמידים קבועים ומורחבים של החיה. בצע אישור מוות על ידי שיטה משנית של המתת חסד כגון נקע צוואר הרחם.
הפעל לחץ על המסלול באמצעות מלקחיים מעוקלים עד שהגלובוס בולט. סוגרים בעדינות את המלקחיים בחלק האחורי של העין ומרוממים בתנועה רציפה. לטבול את גלגל העין בצינור של 1.5 מיליליטר המכיל HBSS קר כקרח של מיליליטר אחד.
מעבירים את גלגל העין לצינור של 1.5 או שני מיליליטר המכיל מדיה מלאה. עכשיו הוא מוכן לנתיחה. דיאגרמה זו ממחישה את השלבים העוקבים שיוצגו עבור ניתוח גלגל העין של העכבר כדי ליצור את יציאת הרשתית.
חתך היקפי נעשה לאורך הלימבוס כדי לפתוח את גלגל העין. הקרנית מוסרת באמצעות כריתה לאורך החתך הלימבלי. לאחר מכן מסירים את העדשה ואת הזגוגית, ומותירים עיניים ריקה.
באמצעות החזקת האזור של ראש עצב הראייה עם מלקחיים עדינים, קילוף את המעיל החיצוני של העין מבוצעת בעדינות. תשומת לב רבה במהלך הסרת הפרווה החיצונית על מנת לא לפגוע ברשתית העצבית ולקבל את הרשתית שלמה לחלוטין. לאחר מכן, הרשתית תיחתך לחתיכות קטנות יותר.
זה יהיה יתרון גדול, כי זה יאפשר לך לערוך ניסוי שבו קבוצת הביקורת שלך וקבוצות הניסוי נגזרות מאותה חיה. עם זאת, חיתוך הרשתית לחתיכות קטנות יהפוך את הטיפול בה למאתגר יותר. לכן, פיתחנו טכניקה לטיפול בחלקי הרשתית הקטנים האלה כדי להבטיח כיוון נכון של תרבות הרשתית.
לכו עם להב המספריים המנתח פתוח ממש מתחת לפיסת הרשתית. מרימים באיטיות את חתיכת הרשתית עם קצה של להב מספריים פתוח ומעבירים אותה בעדינות לצלחת התרבית. האקספלנטים יועברו בנפרד לתוספות תרבית תאים בלוחות מרובי בארות, שכל אחד מהם מכיל 300 מיקרוליטרים של מדיית רשתית עם צד הרשתית העצבית פונה כלפי מעלה.
תרביות צמחי הרשתית יישמרו באינקובטורים לחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. יש לוודא שמשטח הרשתית פונה כלפי מעלה. אם פיסת הרשתית הפוכה או מקופלת, נסו להתאים אותה בעדינות לכיוון הנכון.
אי מיקום יציאת הרשתית בכיוון הנכון כאשר הרשתית העצבית פונה כלפי מעלה תגרום לכישלון של צמיחה תקינה של תאי הרשתית בתרבית. כאן, אנו יכולים לראות אימונופלואורסצנציה מכתים את השתלים ברשתית המוכתמים בתרבית במשך שבועיים. האקסים היו מקובעים ומוכתמים ב-NeuN עבור נוירונים ברשתית, GFAP עבור תאי גליה ולקטין עבור כלי דם.
הכתמים הראו תאי רשתית וכלי רשתית מפותחים היטב. כאן, אנו יכולים לראות צביעה אימונופלואורסצנטית של צמחי רשתית קבועים ומוכתמים ב- GFAP עבור תאי גליה ולקטין עבור כלי דם. התמונות מראות כתמים פגומים ותת-התפתחות של תאי הרשתית וכלי הרשתית.
הסיבה לכך היא שיציאת הרשתית הייתה מקופלת ולא הייתה מכוונת נכון על צלחת התרבית. יש להקדיש תשומת לב רבה לכיוון הנכון של הצמח כאשר הרשתית פונה כלפי מעלה. העובדה שקבוצת הביקורת נגזרת מאותה חיה בודדת כמו הקבוצה המטופלת הופכת את זה ליתרון גדול להשוואה אמינה יותר של תנאי ניסוי שונים.
שתלי רשתית יכולים לספק פלטפורמה הגונה לחקר מטרות טיפוליות אפשריות למגוון רחב של מחלות רשתית, כגון רטינופתיה סוכרתית ומחלות רשתית ניווניות.
