The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

<ol>
	<li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+classification+of+drugs+and+drug+receptors+in+isolated+tissues.">The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues.</a> Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).</li><li>Scheindlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+modern+pharmacology.">A brief history of modern pharmacology.</a> Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).</li><li>Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+assessment+of+relative+agonist+efficacy.">Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy.</a> Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).</li><li>Arunlakshana, O., Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+quantitative+uses+of+drug+antagonists.">Some quantitative uses of drug antagonists.</a> Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).</li><li>Christopoulos, A., Kenakin, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+allosterism+and+complexing.">protein-coupled receptor allosterism and complexing.</a> Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).</li><li>Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prejunctional+M1+facilitory+and+M2+inhibitory+muscarinic+receptors+mediate+rat+bladder+contractility.">Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility.</a> Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).</li><li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulins+from+scleroderma+patients+inhibit+the+muscarinic+receptor+activation+in+internal+anal+sphincter+smooth+muscle+cells.">Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).</li><li>Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+endothelin+receptors+in+the+cerebral+vasculature+and+their+lack+of+effect+on+spreading+depression.">Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).</li><li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonist-activated+ion+channels.">Agonist-activated ion channels.</a> Br. J. Pharmacol. 147, S17-26 (2006).</li><li>Wyllie, D. J., Chen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+the+time+to+study+competitive+antagonism.">Taking the time to study competitive antagonism.</a> Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).</li><li>Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pA,+a+new+scale+for+the+measurement+of+drug+antagonism.+1947.">pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947.</a> Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).</li><li>Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+two+distinct+alpha+1-adrenoceptor+subtypes+in+rabbit+thoracic+aorta.">Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).</li><li>Hiraoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+functional+characterization+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+the+rat+prostate.">Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate.</a> Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).</li><li>Cooke, P. H., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+fiber+length,+ultrastructure,+and+the+length-tension+relationship+of+mammalian+smooth+muscle.">Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle.</a> J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).</li><li>Davis, M. J., Gore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Length-tension+relationship+of+vascular+smooth+muscle+in+single+arterioles.">Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles.</a> Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-month+serotonin+infusion+results+in+a+prolonged+fall+in+blood+pressure+in+the+deoxycorticosterone+acetate+(DOCA)+salt+hypertensive+rat.">One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat.</a> ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).</li><li>Heppner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-evoked+purinergic+signalling+suppresses+action+potentials,+Ca2++flashes+and+contractility+evoked+by+muscarinic+receptor+activation+in+mouse+urinary+bladder+smooth+muscle.">Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).</li><li>Burdyga, T. V., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanisms+whereby+temperature+affects+excitation-contraction+coupling+in+smooth+muscle.">On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle.</a> J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).</li><li>Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+changes+in+pH+on+wall+tension+in+isolated+rat+pulmonary+artery:+role+of+the+RhoA/Rho-kinase+pathway.">Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).</li><li>Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+are+uncoupled+from+contraction+in+rat+vena+cava.">Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava.</a> Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

מדידה של כוח איזומטרי ככלי מחקר היא בן למעלה מ -150 שנים, אבל היא ממשיכה להיות הטכניקה הטיפוסית לאפיון רצפטור ברקמות התכווצות 2. כוחה של טכניקה זו הוא בפשטות וברבגוניות שלו: על ידי הקלטת תגובות שהושרו על ידי הגדלת ריכוזים של אגוניסט בנוכחותו או היעדריו של יריבו, מספר עצום של מידע ניתן לגזור על המאפיינים תרופתיים של כל תרופה והקולט ש הוא נקשר 3-5. ניסויים מסוג זה גם לגייס מידע על התחרותי מול הטבע הלא תחרותי של היריבים משמשים, כמו גם ההטרוגניות קולט והשפעות תרופה שאינן ספציפיות 6-8. לפיכך, עם תמורות פשוטות לניסוי אמבטיה רקמה מבודד זה, פרופיל תרופתי יחסית מלא של קולטנים אשר מתווכים התכווצות שרירים הנגרם אגוניסט יכול להיות שנוצר. במונחים של agonism, הניתן לחשב דואר יעילות היחסית (E MAX) ועצמה (50 EC) של אגוניסט ברקמות נתון ובהשוואה לתגובות של אגוניסטים אחרים באותו הרקמה 1. בניסוי שלנו, אב העורקים החזי העכברוש הודגרה גם עם רכב או prazosin α אדרנרגיים 1 אנטגוניסט לרצפטור (5 ננומטר) במשך שעה אחת לפני הוספת phenylephrine אגוניסט אדרנרגי 1 α לאמבטיה הרקמה ויצירת התכווצות. איור 2 מתנות שונה תוצאות של איור 1. התגובות הירוקות סומנו בהתכווצות המרבית מושגת על ידי PE סומנו כמקסימום, ההתכווצות המרבית ½ מסומן ככאלה ולאחר מכן קשור עם ריכוז PE שגרמה שתגובה. זיהוי ערכים אלה הוא זיהוי הריכוז היעיל של אגוניסט שמשיג תגובת מחצית מקסימום (50%) או ערך EC 50. למרבה הצער, שימוש בפרמטר אגוניסט תלויזה לבד כדי לקבוע יכול להיות מסובכים מאפיינים מחייבים קולט 9. באופן אידיאלי, ניסויים נוספים באמצעות יריבים הקולטן לאפשר החישוב של שני פרמטרים חשובים, כי הם מפתח להגדרת האינטראקציה בין תרופה וקולט: 10 -log של דיסוציאציה אנטגוניסט הקבועה (PK B) ו-log 10 של היריב טוחנת ריכוז דרוש כדי לעורר שינוי הכפול ימינה בעקומת ריכוז התגובה (PA 2) 10. שני K B והרשות פלסטיני 2 רווח התועלת שלהם מהעובדה שהם ערכי אגוניסט-עצמאי, ויישארו קבוע גם בין רקמות שונות 11. מהנתונים בתרשים 2, PK B יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הבאה ומבוסס על EC 50 ערכים מחושבים במקום אחר: EC 50 בהעדר prazosin = 2 x 10 -8 M EC 50 במראשהיגיון של prazosin = 7 x 10 -6 M לפתור עבור K B במשוואה הבאה: יומן (dr-1) = להיכנס [B] - יומן K B איפה: [B] = ריכוז antagonist, או 5 x 10 מ &#39;-9 יומן (5 x 10 -9 M) = -8.3 dr = יחס מינון של ערך EC 50 בנוכחות של אנטגוניסט / 50 EC בהעדר. אם יש תזוזה ימינה, ערך זה יהיה גדול יותר מפעם אחת. כך: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M או 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 מחליף [B] וdr: יומן (350-1) = -8 - יומן K B 2.54 = -8 - להיכנס KB PK B = 10.54 ערך זה לprazosin עולה בקנה אחד עם הערכים שהתקבלו כאשר prazosin אינטראקציה עם recept adrenergic 1 αאו 12,13, דבר המצביע על כך שהקולטן adrenergic תיווך התכווצות לphenylephrine הוא קולטן adrenergic α 1. כמה צעדים הם קריטיים להצלחה של ניסויים אלה. רקמות חייבת להישאר בPSS לאחר נתיחה כדי למנוע אובדן של כדאיות רקמות. יש כל הכנת השרירים איזומטרי יחסי אורך-מתח אופטימלי שיוצר כוח מקסימאלי נגד מתח פסיבי 14,15. לניסוי המתואר בפרוטוקול זה, מתח פסיבי אופטימלי נקבע בעבר על ידי מרווחי הוספה בקצרה של 0.5 גרם של מתח פסיבי לרקמות. הרקמה צריכה להתחיל בלי טון ואז אחרי 30 דקות של איזון, הרקמה אותגרה עם ריכוז מקסימאלי של KCl (80 מ&quot;מ), שנוצר צליל פעיל. לאחר מכן, הרקמות נשטפו והורשו לחזור לטון בתחילת מחקר. אחרי 15 דקות בתחילת המחקר, 0.5 גר &#39;נוסף של מתח פסיבי הוצב והתהליך הזה שוב ושוב עד לרמה שלמתח פעיל הושג עם מתח פסיבי נוסף. בניסויים ראשוניים, 4 סך גרם של מתח הפסיבי היה נחוש להשיג דור מתח פעיל מקסימאלי בטבעות אב העורקים, ובכך סכום כולל זו של מתח מושם על הטבעות לפני האיזון. פרוצדורלית, עדיף להתמקד יישום מתח פסיבי לפני, אבל ניתן לעשות זאת בכל עת לפני הניסוי. המשתרע על פני-רקמות, בכל נקודה בניסוי או לנתיחה, תשפיע לרעה על כדאיות רקמות ותוצאות ניסוי. זה הכרחי ביותר בעת ביצוע רקמות באמבטיה, כצעד זה יש הסבירות הגבוהה ביותר של מתיחה מוגזמת. שטיפה נאותה, במספר ומשך נדרשת לאפקטים לשחזור. אתגר שני מוקדם מדי אחרי אתגר ראשוני, או לפני הרקמות חזרו למתח בסיסי, יגרום לתגובות חריגות. אם לומדים יריבים / מעכבים הפיכים, לא צריכים לשטוף רקמות לפני אגוניסט בנוסף, כinhibiריכוז טור יהיה ירידה. ישנם יתרונות וחסרונות בולטים למבחני אמבטיה רקמות המבודדים. חסרונות: רקמות עלולות להיתקל בדרגות שונות של נזק במהלך ניתוח להסרת או מיקום של טבעות על ווים. מאז התא האנדותל הוא הציפוי הפנימי של טבעת אב העורקים, יש להקפיד על המיקום של הטבעת על ווים, כדי שלא לפגוע בשכבת תאים זו. רקמות יכולות להיות גם באורכים שונים במובהק מהזמן שבו הם קיימא באמבטיה הרקמות, ואת זה יש שייקבע; לא כל הרקמות זהות. לאורך שורות אלה, רקמות עשויות להשתנות בהיענות שלהם לאורך כל היום כך שהבקרה בזמן הפכה לשליטה הנדרשת עבור כל ניסוי. דוגמא טובה לכך היא קנה הנשימה חזיר גינאה שמשפרת במקסימום התכווצות ב -100% במהלך ניסוי 8 שעות טיפוסיות. תרופות שהן מסיסים היטב במים עלולות לעורר בPSS. לבסוף, מצטברnd תוספות שאינן מצטברות של תרופה שהיא אגוניסט עלול לגרום לתוצאות שונות אם הפחתת רגישות הקולטן לאגוניסט מתרחשת; אנגיוטנסין II הוא תרופה אחת כזו שמראה tachyphylaxis המהיר. יתרונות: אחד היתרונות העיקריים של ניסויי אמבטיה רקמה הוא שזה בזמן אמת; ניתן לראות את ניסוי עת התרחשותה ומהירות יכולה לעשות את המסקנות ולתכנן את הצעדים הבאים, כמו גם פתרון בעיות במהלך ניסוי. ניסוי לוקח יום לעשות. בדרך כלל ניתן להכין רקמות מרובות מחיה אחת כזאת שחיה יכולה לשמש כשליטה שלו, וזה מוסיף כוח לניסוי. אפשר גם לבודד את הרקמה מגורמים אחרים כדי לבחון את התגובה טהורה יחסית של הרקמה לתרופה. בניסויים במבחנה, כגון מערכת האמבטיה הרקמות מאפשרים גם שימוש בכמות קטנה של תרופה בהשוואה לניסוי in vivo. עיצוב ניסיוני הבסיסי שתואר במסמך זה יכול להיותשינוי נרחב כדי לאפשר הקלטה של ​​פרמטרים נוספים או ההקדמה של גירויים חיצוניים אחרים. לדוגמא, תוספת של אלקטרודות לאפשר לגירוי שדה חשמלי של עצבי innervating 16,17. עם התוספת של בדיקות תרמית או pH, ניתן גם למדוד את ההשפעות של טמפרטורה ו- pH על תגובות התכווצות 18,19. באופן דומה, חמצן ניתן להחליף באופן חלקי או במלואו עם N 2 כדי לבדוק את ההשפעות מושרה היפוקסיה. יתר על כן, אותם העקרונות הבסיסיים של מדידת התכווצות איזומטרי בשימוש בוידאו זה יכול לשמש לפיתוח מערכות המאפשרות מדידה במקביל לפיתוח מתח איזומטרי ושינויים בסידן תוך תאי 20. התמרה אות היא גם למדה בקלות, שכן מערכות קיימות שיכול במהירות להקפיא דגימת רקמה בתגובה, כך שהפעילות של מערכת מסלול העברת אותות ניתן לאמת ביוכימית. הווריאציה של סוסיםipment שיכול לשמש כדי לעשות את זה הוא עצום. מערכת זו כולה, כל היד שנבנתה או אוטומטית, ניתן לרכוש מחברות שונות מרובות. אמבטיות הרקמה ובעלי רקמת שימוש בפרוטוקול זה היו מנופח ביד (אמבטיות רקמה) ויד שנבנתה (בעלים) על ידי מכונה חנויות אוניברסיטת מישיגן בבית.

המשמעת של פרמקולוגיה השתמשה במערכת האמבטיה רקמה המבודדת למעלה מ -150 שנה. צדדיות של מערכת זו אפשרה למדענים ברחבי העולם כדי לאפיין קולטנים והעברת אותות קולט, עם הידע הזה עומד בבסיס הטיפולים שטופלו מיליוני אנשים עם מחלות או הפרעות כגון יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, סוכרת, מחלות במערכת העיכול, שלפוחית ​​השתן הפרעות בתפקוד, אסטמה, ובליעה, לשם רק כמה. עד עצם היום הזה, האמבטיה הרקמה המבודדת נשארה פן חשוב של פיתוח תרופות ומחקר בסיסי, שכן היא מאפשרת לרקמות לתפקד כרקמה. בשיעור זה יופיטר, פרוטוקול רשמי משותף להפגין ניסוי חזותי ווירטואלי ניצול נתונים מניסוי מבודד רקמת אמבטיה המודד כיווץ איזומטרי, המאפשר אפיון רצפטור. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שרקמת חייםפונקציות nd בכללותה רקמה, עם תוצאה פיזיולוגית (כיווץ או הרפיה) שהוא רלוונטי לגוף. זה הוא סינתזה של צעדים (אינטראקציה תרופה-קולטן, הולכים אותות, דור שליח שני, שינוי ברגישות שריר חלק, ושינוי בתפקוד רקמות). בעוד שיטות אחרות מאפשרות לימוד של כל אחד משלבים הבאים (לדוגמא radioligand מחייב לזיקת סמים, מדידה של שליחים שני), טכניקת האמבטיה רקמה המבודדת מאפשרת אינטגרציה של כל 1 את הפעולות הבאות. יתרון נוסף הוא ששמירה על תפקוד רקמות מאפשרת חישוב של משתנים תרופתיים חשובים, כי הם יותר משמעותיים ברקמה לעומת הגדרה סלולרית; מדובר קרוב יותר לאופן שבו התרופות שנבדקו היו עובדות בגוף כולו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

במונחים של agonism, היעילות היחסית (E MAX) והעצמה (50 EC) של אגוניסט ברקמות נתון יכולות להיות מחושבת ובהשוואה לתגובות של אגוניסטים אחרים באותו הרקמה 1. בניסוי שלנו, אב העורקים החזי העכברוש הודגרה גם עם רכב או prazosin α 1 adrenergic אנטגוניסט לרצפטור (5 ננומטר) לשעה אחת לפני הוספת phenylephrine אגוניסט אדרנרגי α 1 לאמבטיה הרקמה ויצירת התכווצות (איור 1). 2 מתנות איור שונה תוצאות של איור 1. התגובות הירוקות סימנו ההתכווצות המרבית מושגת על ידי PE סומנה כמקסימום, ההתכווצות המרבית ½ המסומן ככאלה ולאחר מכן קשורים עם ריכוז PE שגרם שתגובה. זיהוי ערכים אלה הוא זיהוי הריכוז היעיל של אגוניסט שמשיג תגובת מחצית מקסימום (50%) או EC <sUB&gt; 50 ערך. זה היה donegraphically בתוכנת example.Computer זה שמשתמש בפונקציות לוגיסטי לעקומות sigmoidal יכולים לשמש לעקומה ראויה וחישוב EC 50 ערכים. ביצירה ופירוש התוצאות הללו, חשוב להשתמש בשני ריכוזים נמוכים וגבוהים של אגוניסט ליצור עקומת ריכוז התגובה. בלי מספיק נקודות כדי להראות בסיס יציב ורמה המרבית, ניתן להעריך EC 50 ו- E MAX בלבד. זה נעשה בצורה גרפית בדוגמא זו. תוכנת מחשב שמשתמשת בפונקציות לוגיסטי לעקומות sigmoidal יכולה לשמש לעקומה ראויה וחישוב EC 50 ערכים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> איור 1:, ba רקמת מים במעייל רקמות אמבט סכמטי Cartoon מייצג טבעת של רקמה ממוקמת בקיר דו-.<html> ה. זרימת החיץ ויצוא מוסדרים על ידי ברזלים זכוכית 3-בדרך שולבו בבסיס של החדר. O 2 / CO 2 הוא מבעבע בבאמצעות aerator שהוא חתום עם אטם כדי למנוע דליפה של PSS או גז. קלט מחזור נמוך מהתפוקה כדי לשמור על מחזור תקין ולמנוע היווצרות של כיסי אוויר שיגרמו disregulation טמפרטורה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> איור 2:. עכברוש בית החזה אב העורקים + האנדותל איור לעיל מתאר ארבעה ניסויים נפרדים (בעלי חיים שונים ועל ידי חוקרים שונים על עליות להגדיר שונות כפי שהוא מיוצג על ידי צבעים שונים) כדי לבדוק את היכולת של prazosin להעביר התכווצות מושרה PE. Prazosin (5 ננומטר) באופן ברור העביר ימינה עקומת התכווצות מושרה PE באופן מקביל. &gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig3highres.jpg" /> איור 3: עכברוש בית חזה אב העורקים + האנדותל הערכה גרפית של EC 50 ערכים לPE בהעדר (הרכב) ונוכחות (prazosin) של אנטגוניסט.. קו ירוק (C קבוצה) רק מסומן. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מלח </td><td> MW (ז / שומה) </td><td> 5 ליטר </td><td> מ&quot;מ FINAL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (גרם) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7H20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> דקסטרוז </td><td> 180.16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> מתכון רגיל פיזיולוגית תמיסת מלח (PSS) תוכן של PSS-נאגר ביקרבונט השתמש בניסוי זה: טבלה 1.. נכללים המשקל המולקולרי של כל המלחים והסכום נוסף ל5 L של DH 2 O כדי להשיג את הריכוז הרצוי. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז באמבטיה </td><td> תוספת של אגוניסט עשתה לאמבטיה </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 מיליליטר 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 מיליליטר 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 מיליליטר 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 מיליליטר 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 מיליליטר 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 מיליליטר 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 מיליליטר 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 מיליליטר 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 מיליליטר 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 מיליליטר 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 מיליליטר 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> טבלה 2:. רקמות אמבט תוסף אגוניסט ריכוזי הסכום של אגוניסט שיש להוסיף לכל אמבט לפרוperly לבנות עקומות ריכוז תגובה מצטברות. ריכוז האמבטיה הרצויה מושגת באמצעות תוספת הסכומים רציפים של ריכוזים גוברים של אגוניסט. כל תוספת לוקחת בחשבון את הריכוז של אגוניסט כבר מקיים באמבטיה. הדבר נעשה כדי למזער את הגידול בהיקף באמבטיה הרקמות שכתוצאת משימוש כרכים הולכים וגדל של ריכוז יחיד של אגוניסט.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research at JoVE.com

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

135.9K Views.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Video: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...