The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

NOTA: Todos los procedimientos descritos en este documento se realizan de acuerdo con las directrices establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan. 1. Preparación y configuración del sistema <ol><li> Hacer 5 L de una solución salina fisiológica (PSS), que es la cantidad necesaria para un experimento de contracción baño de tejido que utiliza hasta 50 ml baños de tejido; ver Tabla 2 para la receta PSS. Calcular el volumen total requerido por multiplicar el número de baños de tejido veces el volumen del baño y luego multiplicando por el número de lavados de tejidos requeridos. <ol><li> Utilice la Tabla 2 como guía para hacer PSS. Disolver las sales en aproximadamente 4 L de agua. Se recomienda utilizar agua del Tipo I - HPLC: NOTA </li><li> Añadir 8 ml de 1 M solución de CaCl2 (147 g / L si se utiliza la sal dihidrato) a la solución, por lo que la solución final es de calcio 1,6 mM. </li><li> Solución de PSS Quantum sufficit a 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Precalentar el sistema de baño de tejido a 37 ° C mediante la activación de la recirculación de baño de agua caliente. Paso Crítico: Cada componente del sistema es con camisa de agua, asegúrese de que están conectados en serie entre sí. La dirección del flujo es crítico - asegurarse de que los flujos de agua en cada componente en la conexión de púas más bajo y fuera en el más alto de conexión de púas. </li><li> Encienda el sistema de adquisición de datos. Encienda los transductores de fuerza por lo menos 15 minutos antes del experimento se equilibre la temperatura. NOTA: La mayoría de los transductores de fuerza emplean medidores de tensión que son sensibles a las variaciones de temperatura y exhiben deriva térmica inicialmente después de activar el detector. </li><li> Lanzamiento software de adquisición de datos y garantizar la conexión con el sistema de adquisición de datos. Por favor, siga las instrucciones del fabricante para permitir la grabación de datos. </li><li> Asegúrese de que los transductores de fuerza están calibrados antes de tejido se coloca en el baño de tejido y antes de la grabación de datos se ha iniciado; folas instrucciones del fabricante llow para la calibración. </li><li> Conecte el sistema de baño de tejido a un 95% de O2 / 5% de CO 2 cilindro de gas de uso médico y verificar que no haya fugas de gas y luego presurizar el sistema. </li><li> Llene los depósitos de baño tejidos con PSS y deje que el tiempo de solución alcance la temperatura óptima. Cebe el sistema y eliminar las burbujas de aire dentro del sistema y la tubería. </li><li> Compruebe aireadores de baño tejido para asegurar la aireación solución coherente, que oxigena el buffer PSS y proporciona movimiento browniano para distribuir drogas que se introducirán en el baño de tejidos durante el experimento. Asegúrese de aireación / burbujas no causa el movimiento del tejido, lo que perturbará grabaciones de datos; disminuir el flujo de gas como sea necesario. NOTA: El baño de tejidos y el sistema de adquisición de datos ya están listos para iniciar el experimento. </li></ol> 2. Preparación del tejido <ol><li> Idealmente, diseccionar los tejidos del animal inmediatamente antes de su uso y colocarla directamente into PSS. NOTA: Algunos tejidos se pueden guardar en PSS noche a 4 ° C, pero los controles adecuados deben realizarse para validar la función del tejido después de un almacenamiento prolongado; véase la Sección 6. </li><li> Utilice la aorta torácica como el tejido en este ejercicio. </li><li> Anestesiar la rata de conformidad con las directrices institucionales y coloque la cara dorsal de la rata hacia abajo. Confirme anestesia a través de un dedo del pie-pinch y la pérdida de la respuesta refleja a este estímulo doloroso. NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital entregado a través de una inyección intraperitoneal. Directrices institucionales para la anestesia de roedores pueden diferir. </li><li> Crear un neumotórax mediante la creación de una incisión con unas tijeras a lo largo de la membrana en la parte inferior de la caja torácica. A continuación, continuar la incisión de la parte inferior de la caja torácica hasta el esternón y la bisectriz. </li><li> Diseccionar o colocar a un lado aquellos órganos que están en la parte superior de la columna vertebral y localizar la aorta, que se encuentra directamente sobre la columna vertebral. NOTA: Este estep ofrece un espacio de trabajo claro para diseccionar la aorta. </li><li> Sever todas las conexiones a la aorta; desde el esófago, pulmón, etc., y cortar la aorta perpendicular a la columna vertebral a nivel del diafragma. </li><li> Aplique suavemente la aorta con unas pinzas y unas tijeras para diseccionar la aorta de la columna vertebral. Inicie la disección en la zona inferior del diafragma adyacente a la columna vertebral y el trabajo hacia el corazón. Asegúrese de tomar precauciones adicionales para no tirar o tirón en el tejido aórtico, lo que puede dañar el tejido. </li><li> Coloque inmediatamente la aorta en el plato de la disección preparado que contiene PSS. NOTA: La disección de la aorta en anillos se realiza mejor en un plato de disección que tiene una base de silastic negro. Esto permite el uso de cables que se pueden utilizar para canular la aorta y ser fijado al plato, proporcionando estabilidad mientras que en el plato de la disección. El fondo negro proporciona un contraste que ayuda a la disección. Se debe tener cuidado en el uso de cables de canulación como la endothelcapa de células ial se puede quitar con un exceso de roce del hilo en contra de la luz del vaso. </li><li> Tome un alambre y hacer un pequeño ángulo de 90 ° en un extremo y empuje el extremo en ángulo en la base de silastic para anclar el cable de guía. Colocar el total de la aorta en el plato de la disección. </li><li> Mantenga el extremo del alambre guía con unas pinzas, y luego pase suavemente el cable en el lumen de la aorta. </li><li> El uso de fórceps y deslice la aorta en el cable. Cuando el extremo libre del cable de guía es visible, curva el alambre suavemente y colocar el extremo libre en la base de silastic del plato para estabilizar el tejido. </li><li> Utilizando Vannas pequeñas tijeras y pinzas, retire el tejido adiposo perivascular y todo otro tejido extraño, coágulos de sangre, etc., hasta la aorta torácica aparece en blanco y un poco fibrosa. </li><li> Retire la aorta limpiado de alambre y utilizar tijeras para cortar la aorta en los anillos que son aproximadamente 3-5 mm de ancho. </li><li> Publicar un anillo aórtico en uno de un par de tiganchos DICIÓN mediante la celebración de el gancho y el uso de fórceps para deslizar suavemente el anillo en el gancho. Repita este proceso con el segundo gancho. Tenga cuidado para asegurar los ganchos no enredar; véase la Figura 3. </li><li> Compruebe que cada gancho tiene una sutura de seda diferente adjunto. Compruebe si un gancho tiene un pequeño lazo anudado de la seda que permite la unión a un vidrio o varillas de acero inoxidable, mientras que el otro es un 10-4 cm pieza larga de sutura que será para el transductor de fuerza atado a mano; véase la Figura 3. NOTA: Una vez que la aorta se fija a los ganchos, el tejido está listo para ser montado en el baño de tejido; véase la Figura 3. </li><li> Repetir los pasos 2.14 a 2.15, para montar un segundo anillo aórtico en la segunda cámara de baño de tejido. </li></ol> 3. Colocación del tejido en el baño <ol><li> Tenga en cuenta que en este sistema, los propios baños de tejido son estacionarias. En este momento, llenar los baños de tejido con calentado, PSS aireado y permitir que la solución para llegar a la temperatura:e. </li><li> Con la sutura de seda, ate uno de los ganchos en la preparación del tejido a la clavija en la varilla de acero inoxidable. Coloque este extremo en la cámara de baño de tejido. Conecte la varilla a un soporte universal y coloque el otro extremo en la cubeta de tinción llena con PSS para mantener el tejido sumergido en tampón; véase la Figura 3. <ol><li> Colocar la varilla y el tejido en la cámara de baño de tejido y asegurarse de que el tejido esté totalmente inmerso en PSS y la varilla es seguro; véase la Figura 3. </li><li> Ate el otro sutura para el transductor de fuerza y ​​asegúrese de dejar holgura en la sutura entre el tejido y el transductor de fuerza. NOTA: Este holgura será eliminado ajustando el micrómetro; véase la Figura 3. </li></ol></li><li> Repita estos pasos para la segunda cámara anular y baño de tejido aórtico. </li></ol> 4. Ajuste de la tensión pasiva NOTA: Cada tejido tiene una longitud (Lo) en el que las células musculares lisas responden optimally. Los experimentos preliminares para determinar la tensión de estiramiento óptima que logra esta longitud se debe realizar para cada tipo de tejido individuo para ser examinado. La aorta torácica de rata tiene una tensión de estiramiento pasiva óptima de 4 g. <ol><li> Utilice el micrómetro / piñón y cremallera para aumentar la tensión de 2 g y esperar a que el tejido para llegar a la meseta. Una vez que se alcanza la meseta, aumentar la tensión otro 2 g y esperar a que el tejido a la meseta. NOTA: En los anillos de aorta, después de la tensión inicial de 2 g se ha puesto y meseta alcanzado, el tejido debe luego relajarse a ~ 1,6 g. Una segunda aplicación de 2 g traería el tejido a ~ 3,6 g, de la que el tejido se relaje de nuevo y la tensión disminuirá. Por lo tanto, después de haber añadido 4 g de la tensión total, el software debe indicar aproximadamente 3,2 g de tensión. </li><li> Repita estos pasos para la segunda cámara anular y baño de tejido aórtico. </li></ol> 5. Equilibrio y Toma de Drogas <ol><li> Equilibrar el tejido durante60 min después de la aplicación de la tensión pasiva al tejido. </li><li> Durante la fase de equilibrio, lavar el tejido cada 15-20 min. Vaciar el baño de tejidos y reemplazar el PSS con PSS de un depósito calentado. NOTA: Durante este tiempo, el tejido se relajará, que se indica por la pérdida de la tensión pasiva. </li><li> Durante este tiempo, preparar medicamentos para el experimento, que deben ser de al menos 1.000 veces más concentrada que la concentración real en el baño, por lo que sólo se necesita un pequeño volumen de la madre de fármaco para conseguir la concentración deseada. </li></ol> 6. Desafío inicial <ol><li> Al final del período de equilibrio, lavar el tejido por última vez, guardar los datos y volver a cero todas las entradas. </li><li> Elija un agonista (compuesto que provocará la contracción activa) a la que el tejido responde. NOTA: En la aorta torácica de rata, el músculo liso arterial se contraerá activamente a un agonista de los receptores adrenérgicos alfa debido a la inervación de latejido por el sistema nervioso simpático. Un agonista adrenérgico no sería útil en los tejidos intestinales dado que los agonistas adrenérgicos provocan la relajación. En este caso, un agonista de los receptores tales como acetilcolina (receptor colinérgico) podría ser utilizado. Una alternativa a tanto la fenilefrina y la acetilcolina es el uso de un agonista no receptor tales como niveles altos de potasio (K) como el primer desafío. En el músculo liso, de alta K opera para indirectamente los canales de calcio abierto y por lo tanto es visto como un índice general de la integridad del músculo liso. <ol><li> Realice el primer desafío o el reto de despertar por la adición de 10 -5 M fenilefrina al baño de tejido. Para alcanzar esta concentración en 50 ml de baño tejido, se añaden 50 l de una solución fenilefrina 10 -2 M. NOTA: 50 l en 50 ml de PSS es una dilución 1/1000, de modo que la concentración final es 1.000 x menos de la acción, o 10 -5 M. El conocimiento de volumen y mantenimiento constante del volumen dentro del baño de tejido cHamber es crítico para determinar la concentración de fármaco final. </li></ol></li><li> Añadir 10 -5 M fenilefrina al baño de tejido y permitir la contracción a pico y luego meseta, cuando la pendiente de los datos se convierte en cero. Asegúrese de registrar cada evento experimental para ayudar al análisis post-experimental. </li><li> Después de meseta, lave el agonista a fondo por el vaciado y llenado de la cámara de baño de tejido con nuevo PSS. Asegúrese de registrar estos eventos también. NOTA: Una regla de oro es que la concentración de agonista en el baño se reduce 10 veces con cada lavado. Aunque, más de 3-4 lavados pueden ser necesarios para llevar el tejido hacia abajo a su tono de referencia de equilibrio (tensión). </li><li> Que el resto del tejido en tono de línea de base para ~ 10 min antes de continuar. </li></ol> 7. Experimento NOTA: La prazosina, un antagonista del receptor adrenérgico alfa, será introducido a la cámara de baño de tejido para desplazar la resp concentracióncurva Onse a la fenilefrina (PE); este es un antagonismo demostrable. <ol><li> Para un baño, añadir el vehículo (H 2 O) en el que se disolvió la prazosina. A otro, añadir la concentración apropiada de prazosin. En este caso, añadir 25 l de vehículo para un baño y 25 l de 10 -5 M de concentración de prazosina a la otra para lograr una 5 x 10 -9 M o una concentración 5 nM en el baño. NOTA: Mientras que la adición de vehículo parece innecesaria en este ejemplo, es imperativo para hacerlo cuando se utilizan otros vehículos que tienen un potencial para ser vasoactivo (por ejemplo, DMSO, etanol, acetato). Añadir el vehículo correspondiente, incluso si existe poca evidencia de que sea vasoactivo. </li><li> Deja vehículo / prazosina en los baños y no lavar el tejido durante 1 hora. <ol><li> Mientras que los tejidos se equilibrándose, preparar múltiples concentraciones de agonista (PE). Incluye una amplia gama de concentraciones, de las concentraciones que suscitan ninguna respuesta (por ejemplo, &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) a concentraciones que superan la respuesta máxima (por ejemplo, 10 -4 M PE). Desde curvas concentración-respuesta son logarítmicas en la naturaleza, hacer seis soluciones separadas de valores de PE (10 -6 -10 -1 M) a través de diluciones seriadas de la solución madre 10 -1 M. Asegúrese de que el volumen necesario para cada concentración es ligeramente mayor que el triple del volumen total necesario para todos los baños (es decir,&gt; 300 mu l). </li></ol></li><li> Proceder a la adición de agonista, tal como se describe en la Tabla 1. NOTA: Este experimento generará una curva de respuesta a la concentración acumulada a PE; cada iteración tiene en cuenta la cantidad de sustancia ya añadida al baño. Las adiciones se producen hasta que ya no aumentan la contracción, o toda la curva se ha estabilizado. <ol><li> Añadir cada concentración de fármaco individualmente hasta que se alcanza el umbral de tejido. </li><li> Si no se produce ningún cambio, añada la siguiente concentración en elserie; véase la Tabla 2. NOTA: El momento de estas adiciones depende del agonista utilizado. Por ejemplo, la noradrenalina y la contracción de la fenilefrina se desarrolla rápidamente, y deben estabilizarse en cuestión de minutos. Por el contrario, la endotelina-1 contracción se desarrolla lentamente y puede no estabilizarse por cerca de 45 minutos. Otros experimentación se puede hacer sobre el tejido después de la construcción de una curva como esta, siempre y cuando (1) la sustancia lavados fuera; y (2) se puede demostrar que el tejido vuelve a comportamiento normal contráctil y no se ve afectada por los estímulos previos. </li></ol></li></ol> Análisis 8. Datos <ol><li> Asegúrese de guardar los datos inmediatamente antes y después de una intervención (por ejemplo, despertar o curva completa). </li><li> Encuentra y establecer la línea de base de tejido para cada canal / cámara de entrada de baño de tejido, que ayudará en el análisis de datos. </li><li> Una vez que la línea de base se establece, encontrar la respuesta máxima para cada concentración, y registrar el change de línea de base. Secuencialmente moverse a través de cada una de las concentraciones y registrar el cambio de línea de base. </li><li> Grafica los datos resultantes. Haced esto en cualquier programa de gráficos. NOTA: Graph Pad Prism está diseñada para los farmacólogos, y esto es ideal para el tipo de experimento que aquí se presenta. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

Medición de la fuerza isométrica como herramienta de investigación es más de 150 años, pero sigue siendo la técnica de prototipo para la caracterización de los receptores en los tejidos contráctiles 2. El poder de esta técnica es en su simplicidad y versatilidad: mediante el registro de las respuestas provocadas por concentraciones crecientes de un agonista en presencia o ausencia de un antagonista, una gran cantidad de información puede derivarse de las características farmacológicas de cada fármaco y el receptor al que se se une 3-5. Los experimentos de este tipo también cosechan información sobre el competitiva frente a la naturaleza no competitiva de los antagonistas utilizados, así como la heterogeneidad de receptor y efectos de drogas no específicos 6-8. Así, con permutaciones simples a este experimento aislado baño de tejidos, un perfil farmacológico relativamente completo de los receptores que median la contracción muscular inducida por agonistas se pueden generar. En términos de agonismo, THe eficacia relativa (E MAX) y potencia (CE 50) de un agonista en un tejido dado puede ser calculado y comparado con las respuestas de otros agonistas en el mismo tejido 1. En nuestro experimento, la aorta torácica de rata se incubó con vehículo o la α 1 adrenérgicos prazosina antagonista del receptor (5 nM) durante una hora antes de añadir la α 1 agonista adrenérgico fenilefrina al baño de tejidos y la generación de contracción. La Figura 2 presenta los resultados modificado de la Figura 1. Las respuestas verdes han sido marcados con la contracción máxima alcanzada por PE marcado como máximo, la contracción máxima ½ marcado como tal y luego asociado con la concentración de PE que causó que la respuesta. La identificación de estos valores es la identificación de la concentración eficaz de un agonista que logra un medio max (50%) respuesta o valor de EC50. Desafortunadamente, con el parámetro dependiente de agonistaS sola para determinar las características de unión al receptor pueden ser complicadas 9. Idealmente, los experimentos adicionales utilizando antagonistas de los receptores permiten que el cálculo de dos parámetros importantes que son la clave para la definición de la interacción entre un fármaco y un receptor: el -log 10 de la disociación antagonista constante (pK B) y el -log 10 del antagonista molar la concentración necesaria para provocar doble desplazamiento hacia la derecha en la curva de concentración-respuesta (pA 2) 10. Tanto K B y pA 2 aumento de su utilidad en el hecho de que son los valores de agonistas-independiente, y se mantienen constantes, incluso entre diferentes tejidos 11. A partir de los datos en la Figura 2, pK B se puede calcular utilizando la siguiente ecuación y se basa en CE 50 valores calculados en otra parte: CE 50 en ausencia de prazosin = 2 x 10 -8 M CE 50 en el presentido del prazosin = 7 x 10 -6 M Resuelve para K B en la siguiente ecuación: log (dr-1) = log [B] - log K B Dónde: [B] = concentración de antagonista, o 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3 dr = proporción de dosis de valor de EC50 en presencia del antagonista / CE 50 en ausencia. Si hay un desplazamiento hacia la derecha, este valor será mayor que uno. Por lo tanto: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M o 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Sustituyendo [B] y dr: log (350-1) = -8 - log K B 2.54 = -8 - log KB pK B = 10,54 Este valor de prazosina es consistente con los valores obtenidos cuando prazosina interactúa con un α 1 adrenérgicos recepto 12,13, lo que sugiere que el receptor adrenérgico la mediación de la contracción a la fenilefrina es el receptor adrenérgico α 1. Varios pasos son críticos para el éxito de estos experimentos. Los tejidos deben permanecer en PSS después de la disección para evitar la pérdida de la viabilidad del tejido. Cualquier preparación muscular isométrica tiene una óptima relación longitud-tensión que genera la fuerza máxima contra la tensión pasiva 14,15. Para el experimento descrito en este protocolo, la tensión óptima pasiva se determinó previamente mediante la adición de una breve incrementos de 0,5 g de tensión pasiva al tejido. El tejido debe comenzar sin tono y entonces después de 30 minutos de equilibrio, el tejido fue desafiado con una concentración máxima de KCl (80 mM), lo que generó tono activo. Entonces, el tejido se lavó y se le permitió regresar a tono de línea de base. Después de 15 min a la línea de base, se colocó otro 0,5 g de tensión pasiva y este proceso se repite hasta que una meseta detensión activa se logró con una tensión adicional pasiva. En experimentos preliminares, 4 g total de la tensión pasiva se determinó para lograr la máxima generación de tensión activo en anillos de aorta, y por lo tanto esta cantidad total de tensión se coloca en los anillos antes del equilibrio. Procedimiento, lo mejor es cero solicitud tensión pasiva antes, pero se puede hacer en cualquier momento antes del experimento. El exceso de estiramiento tejidos, en cualquier punto en el experimento o disección, afectará negativamente la viabilidad del tejido y los resultados experimentales. Esto es más imperativo al colocar los tejidos en el baño, ya que este paso tiene la mayor probabilidad de estiramiento excesivo. El lavado adecuado, en el número y la duración se requiere para efectos reproducibles. Un segundo desafío demasiado pronto después de un desafío inicial, o antes tejidos han regresado a la tensión de línea de base, dará lugar a respuestas aberrantes. Si el estudio de antagonistas / inhibidores reversibles, los tejidos no deben lavarse antes de agonista Además, como la inhibiconcentración tor se reducirá. Hay notables ventajas y desventajas de los ensayos de baño tejidos aislados. Desventajas: Los tejidos pueden experimentar diferentes grados de daño durante la extirpación quirúrgica o la colocación de anillos en los ganchos. Dado que la célula endotelial es el revestimiento interno del anillo aórtico, se debe tener cuidado en la colocación del anillo en ganchos para no dañar esta capa de células. Los tejidos también pueden tener muy diferentes períodos de tiempo en los que son viables en el baño de tejidos, y esto tiene que ser determinado; no todos los tejidos son los mismos. En esta línea, los tejidos pueden variar en su capacidad de respuesta a lo largo del día de tal manera que los controles de tiempo se convierten en un control necesario para cada experimento. Un buen ejemplo de esto es la tráquea de cobayo que mejora la contractilidad máximo por 100% durante un experimento típico de 8 hr. Los fármacos que son poco solubles en agua pueden precipitarse en el PSS. Finalmente, un acumulativand adiciones no acumulativas de un medicamento que es un agonista podría dar lugar a resultados diferentes si se produce desensibilización de los receptores al agonista; angiotensina II es una de esas drogas que muestra taquifilaxia rápidos. Ventajas: Una de las principales ventajas de los experimentos de baño de tejido es que es en tiempo real; se puede ver el experimento ya que se desarrolla y puede hacer rápidamente conclusiones y planificar los próximos pasos, así como solucionar problemas durante un experimento. Un experimento toma un día para hacerlo. Tejidos múltiples se pueden preparar típicamente de un animal de tal modo que un animal puede servir como su propio control, y que añade fuerza a un experimento. También se puede aislar el tejido de otros factores con el fin de probar una respuesta relativamente puro del tejido a la droga. Experimentos in vitro tales como el sistema de baño de tejido también permiten el uso de una pequeña cantidad de fármaco en comparación con un experimento in vivo. El diseño experimental básico descrito en el presente documento puede serextensivamente modificado para permitir la grabación de parámetros adicionales o la introducción de otros estímulos externos. Por ejemplo, la adición de electrodos permite la estimulación de campo eléctrico de los nervios que inervan 16,17. Con la adición de sondas térmicas o de pH, los efectos de la temperatura y el pH sobre las respuestas contráctiles también se pueden medir 18,19. Del mismo modo, el oxígeno se puede sustituir parcial o totalmente con N 2 para evaluar los efectos inducidos por la hipoxia. Además, los mismos principios básicos de la medición de la contractilidad isométrica utilizados en este vídeo puede ser utilizado para desarrollar sistemas que permiten la medición concomitante de desarrollo de tensión isométrica y cambios en el calcio intracelular 20. La transducción de señales también se estudia fácilmente, ya que existen sistemas que pueden congelarse rápidamente una muestra de tejido durante una respuesta, de manera que la actividad de un sistema de vía de transducción de señal puede ser verificada bioquímicamente. La variación de equipment que se puede utilizar para hacer esto es enorme. Todo este sistema, cualquier mano construido o automatizado, se puede comprar de varias compañías diferentes. Los baños de tejidos y de los titulares de tejidos utilizados en este protocolo fueron (baños de tejido) y construida de mano (titulares), soplado a mano por un talleres de máquinas de la Universidad Estatal de Michigan en la casa.

La disciplina de la farmacología ha utilizado el sistema aislado baño de tejido durante más de 150 años. La versatilidad de este sistema ha permitido a los científicos de todo el mundo para caracterizar receptores y la transducción de señales del receptor, con este conocimiento que forma la base de las terapias que se han tratado a millones de individuos con enfermedades o trastornos tales como hipertensión, insuficiencia cardíaca, diabetes, enfermedad gastrointestinal, la vejiga Los trastornos de disfunción, asma, y ​​para tragar, por nombrar sólo algunos. A día de hoy, el aislado baño de tejidos sigue siendo un aspecto importante del desarrollo de fármacos y la investigación básica, ya que permite que el tejido para que funcione como un pañuelo de papel. En esta lección JoVE, un protocolo formal es compartida para demostrar un experimento visual y virtual utilizando los datos de un experimento de baño de tejido aislado que mide la contracción isométrica, lo que permite la caracterización del receptor. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido está viviendo unaND funciones como un tejido completo, con un resultado fisiológico (contracción o relajación) que es relevante para el cuerpo. Es una síntesis de pasos (interacción fármaco-receptor, transducción de señales, la segunda generación de mensajero, el cambio en la excitabilidad del músculo liso, y el cambio en la función del tejido). Mientras que otras técnicas permiten el estudio de cada uno de estos pasos (por ejemplo, la unión de radioligando para la afinidad de la droga, la medición de segundos mensajeros), la técnica de baño de tejido aislado permite la integración de todos estos pasos 1. Otra ventaja es que la retención de la función del tejido permite el cálculo de las variables farmacológicas importantes que son más significativo en un tejido vs un entorno celular; se trata más cerca de cómo los fármacos examinados trabajarían en el cuerpo como un todo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

En términos de agonismo, la eficacia relativa (E MAX) y potencia (CE 50) de un agonista en un tejido determinado pueden ser calculados y comparados con las respuestas de otros agonistas en el mismo tejido 1. En nuestro experimento, la aorta torácica de rata se incubó con vehículo o la α 1 adrenérgicos prazosina antagonista del receptor (5 nM) durante una hora antes de añadir la α 1 agonista adrenérgico fenilefrina al baño de tejidos y la generación de contracción (Figura 1). La Figura 2 presenta modificados resultados de la Figura 1. Las respuestas verdes han marcado la contracción máxima alcanzada por PE marcado como máximo, la contracción máxima ½ marcado como tal y luego asociado con la concentración de PE que causó que la respuesta. La identificación de estos valores es la identificación de la concentración eficaz de un agonista que logra un medio max (50%) respuesta o CE <sub&gt; 50 valor. Este fue donegraphically en este software example.Computer que utiliza funciones logísticas para las curvas sigmoideas se pueden utilizar para ajuste de la curva y el cálculo de los valores de CE50. En la generación y la interpretación de estos resultados, es importante utilizar ambas bajas y altas concentraciones de agonista para crear la curva de concentración-respuesta. Sin suficientes puntos para mostrar una línea de base estable y máximo meseta, CE 50 y E MAX sólo se pueden estimar. Esto se hizo gráficamente en este ejemplo. Los programas informáticos que utiliza funciones logísticas para las curvas sigmoideas se puede utilizar para ajuste de la curva y el cálculo de los valores de CE50. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Tissue Bath esquemática de dibujos animados que representan un anillo de tejido colocado en la doble pared, con camisa de agua de tejido baXX. Buffer entrada y salida están regulados por una llave de vidrio de 3 vías integradas en la base de la cámara. O 2 / CO 2 se burbujea a través de un aireador que está sellado con una junta para evitar la fuga de gas o PSS. Recirculación de entrada está por debajo de la salida para mantener recirculación adecuada y evitar la formación de bolsas de aire que podrían causar la desregulación de la temperatura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Rata aorta torácica + endotelio La figura anterior representa cuatro experimentos independientes (diferentes animales y realizados por diferentes investigadores en diferentes montajes representados por diferentes colores) para poner a prueba la capacidad de la prazosina a cambiar una contracción inducida PE. Prazosin (5 nM) claramente desplazado hacia la derecha la curva de contracción inducida por PE-de una manera paralela. Figura 3: Rata aorta torácica + endotelio estimación gráfica de los valores de EC50 para el PE en ausencia (vehículo) y presencia (prazosin) de antagonista.. Línea verde (grupo C) sólo está marcado. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sal </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 Litros </td><td> MM FINAL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (gramos) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7h20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Dextrosa </td><td> 180.16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Normal solución salina fisiológica (PSS) Receta Contenido de la PSS bicarbonato de búfer usado en este experimento.. Se incluyen los pesos moleculares de todas las sales y la cantidad añadida a 5 L de dH 2 O para conseguir la concentración deseada. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Concentración en el baño </td><td> La adición de agonista hecho para baño </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tabla 2:. Tissue Bath Aditivo Agonista concentraciones La cantidad de agonista que se añade a cada baño a properly construir las curvas de concentración-respuesta acumulada. La concentración del baño deseada se logra mediante la adición de cantidades secuenciales de concentraciones crecientes de agonista. Cada adición tiene en cuenta la concentración de agonista ya presente en el baño. Esto se hace para minimizar el aumento en el volumen en el baño de tejido que resultaría del uso de volúmenes crecientes de una única concentración de agonista.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research at JoVE.com

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

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JoVE Core

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Pharmacology

Biology

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

136.5K vistas.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Video: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Investigación

Biología

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...