The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

NOT: Bu yazıda anlatılan tüm işlemler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara göre yapılır. 1. Sistem Hazırlama ve Kurulum <ol><li> 50 ml doku banyolarına kadar kullanan bir doku banyosu daralma deney için gerekli olan miktardır fizyolojik tuz çözeltisi (PSS), 5 L olun; PSS tarifi için bakınız Tablo 2. Gerekli doku yıkama sayısına göre çarpılarak sonra doku banyoları sayısı çarpı banyo hacmi çarpılarak ve toplam gerekli hacmi hesaplayın. <ol><li> PSS yapma bir rehber olarak Tablo 2 kullanın. Suyun yaklaşık 4 L tuzları çözülür. Not: HPLC - Tip I su önerilir </li><li> Son çözelti, 1.6 mM kalsiyum, bu yüzden çözeltisine (dihidrat tuzu kullanılarak, eğer 147 g / L), 1 M CaCI2 çözeltisi 8 ml ilave edilir. </li><li> 5 L. Quantum sufficit PSS çözümü </li></ol&gt; </li><li> Çevrimli ısıtılmış su banyosunda açarak 37 ° C doku banyo sistemi önceden ısıtın. Kritik Adım: Sistemin her bir bileşeni birbirlerine seri olarak bağlandığından emin olun, su-ceketli olduğunu. akış yönü çok önemlidir - en yüksek dikenli bağlantı en düşük dikenli bağlantısında ve dışarı her bileşenin içine su akışını sağlamak. </li><li> Veri toplama sistemi açın. Deney öncesinde kuvvet dönüştürücüler en az 15 dakika Güç sıcaklığını dengelemek için. NOT: Çoğu kuvvet dönüştürücüler sıcaklık değişimlerine duyarlı ve enerji uygulandıktan sonra ilk termal sürüklenme sergileyen gerilme ölçerler kullanır. </li><li> Lansman veri toplama yazılımı ve veri toplama sistemi ile bağlantıyı sağlamak. Veri kayıt etkinleştirme üretim talimatlarını takip edin. </li><li> Kuvvet dönüştürücüler doku doku banyosu ve veri kayıt başlamadan önce yerleştirilmeden önce kalibre emin olun; foKalibrasyon için llow üretici talimatları. </li><li> % 95 O 2 /% 5 CO 2 medikal dereceli gaz silindiri doku banyo sistemi bağlayın ve gaz kaçakları kontrol ve sistemi basınç. </li><li> PSS ile doku banyo rezervuarları doldurun ve çözüm süresi optimum sıcaklığa gelmesini bekleyin. Başbakan sistemi ve sistem ve boru içinde herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak. </li><li> PSS tampon oksijenatlar ve deney sırasında doku banyosunda tanıtılacak ilaçları dağıtmak için Brown hareketi sağlayan tutarlı çözüm havalandırma sağlamak için doku banyo havalandırıcılar kontrol edin. Emin olun havalandırma / kabarcıklar veri kayıtları bozacak doku hareketi, neden olmaz; Gerekirse gaz akışını azaltmak. NOT: Doku banyo ve veri toplama sistemi artık denemeyi başlatmak için hazırız. </li></ol> 2. Doku Hazırlanması <ol><li> İdeal olarak, hayvan dokuları incelemek kullanımdan hemen önce ve i doğrudan yernGoogle&#39;a PSS. NOT: Bazı dokular gecede 4 ° C&#39;de PSS kaydedilebilir, ancak uygun kontroller uzun süreli depolamadan sonra doku işlevini doğrulamak için yapılmalıdır; Bölüm 6&#39;ya bakınız. </li><li> Bu egzersiz doku olarak aorta kullanın. </li><li> Kurumsal kurallarına uygun olarak sıçan anestezisi ve aşağı sıçan dorsal yüzü koyun. Bir ayak-tutam ve bu ağrılı uyaranlara refleks yanıtın kaybı yoluyla anesthetization onaylayın. NOT: Bu protokol, bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen pentobarbital 70 mg / kg kullanılır. Kemirgen anestezi için kurumsal düzenlemeler farklı olabilir. </li><li> Göğüs kafesinin altındaki diyafram boyunca makasla bir kesi oluşturarak bir pnömotoraks oluşturun. Ardından, sternum göğüs kafesi altından kesi devam bisect. </li><li> Parçalara ayır veya omurganın üstünde olan bu organları bir kenara koyun ve omurga boyunca doğrudan yatıyor aort bulun. NOT: Bu step aorta dışarı incelemek için açık bir çalışma alanı sağlar. </li><li> Aorta tüm bağlantıları Sever; ve yemek borusu, akciğer, vb diyafram düzeyinde omurga dik aort kesti. </li><li> Yavaşça forseps ile aort tutun ve omurga aorta incelemek için makas kullanın. Kalbe doğru omurga ve iş bitişik alt diyafram alanında diseksiyonu başlatın. Dokuya zarar verebilir aort dokusu, fazladan çekmeyin önlem veya römorkör almak emin olun. </li><li> Hemen PSS içeren hazırlanmış diseksiyon çanak aort yerleştirin. NOT: halkalar halinde aort diseksiyonu iyi siyah silastik temeli olan bir diseksiyon çanak yapılır. Bu diseksiyon çanak sırasında stabilite sağlayan aorta kanül ve çanak vidalanmış kullanılabilir tellerin kullanımı için izin verir. Siyah arka plan diseksiyon yardımcı kontrast sağlar. Bakım endotelinde olarak kanüle telleri alınmalıdırial hücre tabakası damarın lümeninin karşı telin aşırı sürtünmesi ile temizlenebilir. </li><li> Bir tel alın ve bir ucunda küçük bir 90 ° açı yapacak ve kılavuz tel çapa silastik temele açılı ucunu itin. Diseksiyon çanak bütün aort yerleştirin. </li><li> Forseps ile kılavuz telin ucunu tutun ve yavaşça aort lümenine tel iplik. </li><li> Forseps kullanın ve tel üzerine aorta kaydırın. Kılavuz telin serbest ucu görünür, eğri hafifçe tel ve doku stabilize etmek için çanak silastik temele serbest ucunu yerleştirin. </li><li> Aorta beyaz ve biraz lifli görünene kadar küçük vannas makas ve forseps kullanarak, vb perivasküler adipoz doku ve diğer tüm yabancı doku, kan pıhtıları, kaldırın. </li><li> Tel temizlenmiş aort çıkarın ve genişliği yaklaşık 3-5 mm halkalarda aorta kesmek için makas kullanın. </li><li> Ti bir çiftinin bir üyesi üzerinde bir aort halkası yerleştirinkanca tutup hafifçe kanca üzerine halka slayt forseps kullanarak ssue kanca. İkinci kanca ile bu işlemi tekrarlayın. Arapsaçı yok kanca sağlamak için özen; Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Her kanca takılı farklı bir ipek sütür olduğunu kontrol edin. Öte yandan bağladılar kuvvet dönüştürücü olacak bir 10-4 cm uzunluğunda bir parça dikiş iken bir kanca, bir cam veya paslanmaz çelik çubuk bağlantı için izin veren ipek küçük düğümlü döngü olduğunu kontrol edin; Şekil 3&#39;e bakınız. Not: aort kanca tespit edildikten sonra, doku, doku banyosu içine monte edilmek üzere hazır olduğu; Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Tekrar ikinci doku banyo odasında ikinci bir aort halka monte etmek, 2,14-2,15 adımları. </li></ol> Bath 3. Doku Sıralama <ol><li> Bu sistemde, doku banyoları kendilerini sabit olduğuna dikkat edin. Şu anda, sıcaklık gelmek için çözüm ısındı, gazlı PSS ile doku banyoları doldurun ve izinör. </li><li> Ipek sütür ile, paslanmaz çelik çubuk üzerinde peg doku hazırlama kanca birini kravat. Doku banyosu odasına Bu amaca yerleştirin. Bir halka standı çubuğu bağlayın ve tampon dalmış doku tutmak için PSS ile dolu boyama çanak diğer ucunu yerleştirin; Şekil 3&#39;e bakınız. <ol><li> Doku banyo odasında çubuk ve doku yerleştirin ve doku tamamen PSS batırılır ve çubuk güvenli olduğundan emin olun; Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Kuvvet dönüştürücü diğer sütür kravat ve doku ve kuvvet dönüştürücü arasındaki dikiş gevşekliği terk emin olun. NOT: Bu gevşek mikrometre ayarlayarak tarafından silinecektir; Şekil 3&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> İkinci aort halka ve doku banyo odasının için bu adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Pasif Gerginlik Ayarı NOT: Her doku düz kas hücrelerinin optima cevap hangi bir uzunluğa (Lo) sahiptirLly. Ön deneyler, her bir doku tipi için yapılması gereken bu uzunluk incelenecek elde uygun germe gerilimini belirlemek için. sıçan aort 4 g optimal pasif germe gerilimi vardır. <ol><li> 2 g gerilimi artırmak ve platoya ulaşması dokuya beklemek mikrometre / kremayer kullanın. Plato ulaşıldığında, tansiyonu başka 2 gr artırmak ve yayla dokusu bekleyin. Not 2 g başlangıç ​​gerilimi ayarlamak ve platoya ulaşıldıktan sonra aort halkalarında, Doku daha sonra ~ 1.6 g dinlenmek. 2 g ikinci bir uygulama ~ doku tekrar dinlenmek ve gerginlik azalacaktır hangi 3.6 g, doku getirecek. Bu durumda, toplam gerilim, 4 g sonra, program bir gerilim yaklaşık 3.2 g göstermelidir. </li><li> İkinci aort halka ve doku banyo odasının için bu adımları tekrarlayın. </li></ol> 5. Dengeleme ve İlaç Yapımı <ol><li> Için doku dengelenmesiDokuya pasif gerilim uygulandıktan sonra 60 dak. </li><li> Denge aşamasında, dokuya her 15-20 dakikada yıkayın. Dokular banyo boşaltın ve ısıtılmış hazneden PSS ile PSS&#39;in değiştirin. NOT: Bu süre boyunca, doku pasif bir gerilim kaybı ile gösterilmiş olduğu, gevşetir. </li><li> Bu süre boyunca, yani ilaç içerisinde çok küçük hacimli, istenen konsantrasyon elde etmek için gerekli olan, bir banyo gerçek konsantrasyonda en az 1000 kat daha fazla konsantre olması için gereken deney için olan ilaçların hazırlanması. </li></ol> 6. İlk Mücadelesi <ol><li> Dengeleme dönemi sonunda, dokuya son bir kez yıkayın verileri kaydetmek, ve tüm girdileri sıfır yeniden. </li><li> Doku yanıt hangi (aktif kasılmalara neden olur bileşik) bir agonisti seçin. NOT: sıçan torasik aorta ise, arteriyel düz kas aktif nedeniyle innervasyonunun bir alfa adrenerjik reseptör agonist küçüleceğiniSempatik sinir sistemi tarafından dokusudur. Bir adrenerjik agonisti adrenerjik agonistler gevşemesine neden olduğu göz önüne alındığında bağırsak dokularında faydalı olmaz. Bu durumda böyle bir asetilkolin (kolinerjik reseptörü) gibi bir alıcı agonisti kullanılabilir. Fenilefrin ve asetilkolin bir alternatif örneğin ilk sorun, yüksek potasyum (K) olmayan bir reseptör agonisti kullanmaktır. Düz kasta, yüksek K dolaylı açık kalsiyum kanallarını çalışır ve böylece düz kas bütünlüğünün genel endeksi olarak görülüyor. <ol><li> Doku banyosuna 10 -5 M fenilefrin ekleyerek ilk meydan veya uyandırma meydan gerçekleştirin. 50 ml doku banyosuna bu yoğunluğa ulaşabilmek 10 -2 M fenilefrin çözeltisi 50 ul ekleyin. Not: PSS 50 ml 50 ul nihai konsantrasyon değerden 1,000x az olacak şekilde, bir 1 / 1,000 seyreltme ya da 10 -5, M. Doku banyosu c içinde hacim ve hacim tutarlı bakım Bilgihamber nihai ilaç konsantrasyonunun saptanması için çok önemlidir. </li></ol></li><li> Veri eğimi sıfır olduğunda, doku banyosuna 10 -5 M fenilefrin ekleyin ve tepe ve ardından yayla daralma izin. Sonrası deneysel analiz yardımcı olmak için her deney olayı kaydetmek için emin olun. </li><li> Plato sonra, boşaltma ve yeni PSS ile doku banyo odasını dolumu ile iyice agonist yıkayın. Hem de bu olayları kaydetmek için emin olun. NOT: Dikkat etmeniz gereken bir kural banyosunda agonist konsantrasyonu her yıkama ile 10 kat azalır olmasıdır. Fazla 3-4 yıkar gerekebilir rağmen geri aşağı denge temel tonu (gerilim) için doku getirmek. </li><li> Devam etmeden önce ~ 10 dakika için temel sesi doku dinlensin. </li></ol> 7. Deney NOT: Prazosin, bir alfa adrenerjik reseptör antagonisti, konsantrasyon ve onaya kaydırmaya doku banyo odasına tanıtılacakonse eğrisi fenilefrin (PE) için; Bu bir ispat husumet olduğunu. <ol><li> Bir banyo için araç eklemek (H2O) &#39;in prazosin çözülmüştür. Başka, prazosin uygun konsantrasyonunu ekleyin. Bu durumda, bir 5 x 10 -9 M veya banyoda 5 nM bir konsantrasyon elde etmek için, diğer bir banyo aracın 25 ul ve prazosin 10 -5 M konsantrasyonda 25 ul ekle. NOT: Aracın eklenmesi bu örnekte gereksiz gibi görünse de, vazoaktif olmak için potansiyeli (örneğin, DMSO, etanol, asetat) sahip diğer araçlar kullanırken, bunu yapmak zorunludur. Bu vazoaktif olmak için çok az kanıt varsa bile gelen araç ekleyin. </li><li> Hamam araç / prazosini bırakın ve 1 saat doku yıkama yok. <ol><li> Dokular dengeye iken, agonist (PE) çok sayıda konsantrasyonları hazırlamak. Örneğin, &lt;yanıt ortaya çıkaran konsantrasyon (konsantrasyona, geniş bir yelpazede yer alır/ Maksimal yanıt (aşmak konsantrasyonlarda em&gt; 10 -9 M PE), örneğin, 10 -4 M PE). Konsantrasyon-cevap eğrileri, 10 -1 M stok çözeltisinden PE altı ayrı stok çözeltileri (10 -6 -10 -1 M) seri seyreltileri yapmak doğada logaritmik olduğundan. Her bir konsantrasyon için gerekli hacmi tüm banyo (yani&gt; 300 ul) için gerekli üç toplam hacim biraz daha büyük olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, agonist ilave devam edin. Not: Bu deney PE kümülatif konsantrasyon yanıt eğrisi oluşturur; Her yineleme dikkate zaten banyoya ilave madde miktarını alır. Artık daralma artırmak kadar ilaveler meydana veya tüm eğri plato etti. <ol><li> Doku eşik ulaşılana kadar tek tek her ilaç konsantrasyonu ekleyin. </li><li> Hiçbir değişiklik meydana gelirse, bir sonraki konsantrasyon eklemekserisi; Tablo 2&#39;ye bakınız. NOT: Bu eklemeler zamanlaması kullanılan agonist bağlıdır. Örneğin, norepinefrin ve fenilefrin daralma hızla gelişir ve birkaç dakika içinde plato gerekir. Buna karşılık, endotelin-1 daralma yavaş gelişir ve yakınında 45 dakika boyunca plato olmayabilir. Diğer deneyler sürece, bu gibi bir eğrinin inşaatından sonra doku üzerinde yapılabilir gibi (1) madde yıkar dışarı; ve (2) doku, normal kasılma davranışı döner ve önceki uyarılara etkilenmez olmadığını ortaya konabilir. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Önce ve bir müdahaleden sonra hemen verileri kaydetmek emin olun (örneğin, uyandırma veya tam eğri). </li><li> Bul ve veri analizine yardımcı olacak her doku banyo odası / giriş kanalı, doku taban ayarlamak. </li><li> Taban ayarlandıktan sonra, her bir konsantrasyon için maksimum yanıtını bulmak ve chan kayıtbaşlangıca ge. Sırayla konsantrasyonlarının her gezinmek ve temel vardiya kaydedin. </li><li> Elde edilen verilerin grafik. Herhangi bir grafik programında yapın. NOT: Graph Pad Prizma farmakolog için tasarlanmış, ve bu burada sunulan deney türü için idealdir. </li></ol>

<ol><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+classification+of+drugs+and+drug+receptors+in+isolated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues.</a> Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).</li>
<li>Scheindlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+modern+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">A brief history of modern pharmacology.</a> Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).</li>
<li>Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assessment+of+relative+agonist+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy.</a> Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).</li>
<li>Arunlakshana, O., Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+quantitative+uses+of+drug+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Some quantitative uses of drug antagonists.</a> Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).</li>
<li>Christopoulos, A., Kenakin, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+allosterism+and+complexing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor allosterism and complexing.</a> Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).</li>
<li>Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prejunctional+M1+facilitory+and+M2+inhibitory+muscarinic+receptors+mediate+rat+bladder+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility.</a> Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulins+from+scleroderma+patients+inhibit+the+muscarinic+receptor+activation+in+internal+anal+sphincter+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).</li>
<li>Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+endothelin+receptors+in+the+cerebral+vasculature+and+their+lack+of+effect+on+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).</li>
<li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Agonist-activated ion channels.</a> Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).</li>
<li>Wyllie, D. J., Chen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+time+to+study+competitive+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Taking the time to study competitive antagonism.</a> Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).</li>
<li>Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pA%2C+a+new+scale+for+the+measurement+of+drug+antagonism.+1947%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947.</a> Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).</li>
<li>Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+two+distinct+alpha+1-adrenoceptor+subtypes+in+rabbit+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).</li>
<li>Hiraoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+functional+characterization+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+the+rat+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate.</a> Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).</li>
<li>Cooke, P. H., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fiber+length%2C+ultrastructure%2C+and+the+length-tension+relationship+of+mammalian+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle.</a> J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).</li>
<li>Davis, M. J., Gore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-tension+relationship+of+vascular+smooth+muscle+in+single+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles.</a> Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-month+serotonin+infusion+results+in+a+prolonged+fall+in+blood+pressure+in+the+deoxycorticosterone+acetate+%28DOCA%29+salt+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat.</a> ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).</li>
<li>Heppner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-evoked+purinergic+signalling+suppresses+action+potentials%2C+Ca2%2B+flashes+and+contractility+evoked+by+muscarinic+receptor+activation+in+mouse+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).</li>
<li>Burdyga, T. V., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+whereby+temperature+affects+excitation-contraction+coupling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle.</a> J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).</li>
<li>Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changes+in+pH+on+wall+tension+in+isolated+rat+pulmonary+artery%3A+role+of+the+RhoA%2FRho-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).</li>
<li>Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+are+uncoupled+from+contraction+in+rat+vena+cava%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava.</a> Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).</li>
</ol>

Authors have nothing to disclose.

Bir araştırma aracı olarak izometrik kuvvet ölçümü 150 yaşında, ama kasılma dokularda 2 reseptör karakterizasyonu için prototip tekniği olmaya devam ediyor. Bu tekniğin güç basitliği ve çok yönlülük olup: bir antagonistin varlığında veya yokluğunda, bir agonist arasında artan konsantrasyonları ile tetiklenen tepkileri kaydederek bir bilgi sayısız her ilacın farmakolojik özellikleri ve reseptör ile ilgili elde edilebildiği o 3-5 bağlar. Bu tür deneyler ayrıca, kullanılan antagonistler rekabetçi olmayan doğaya karşı rekabet ilgili bilgilerin yanı sıra reseptör heterojenliği ve spesifik olmayan ilaç etkileri 6-8 toplamak. Bu nedenle, bu izole edilmiş bir organ banyosu deney basit permütasyon ile, agonist kaynaklı kas büzülmesine neden reseptörlerinin nispeten tam farmakolojik profili elde edilebilir. Agonizmi açısından, inciBelirli bir doku, bir agonist e nispi etkinlik (Emax) ve güçte (EC50), aynı doku 1 diğer agonistlerin yanıtlarına göre hesaplanır ve edilebilir. Bizim deneyde, sıçan aort araç ya da önceden daralma doku banyosuna α 1 adrenerjik agonisti fenilefrin ilave edilmesi ve üretilmesi için bir saat α 1 adrenerjik reseptör antagonisti, prazosin (5 nM) ya da birlikte inkübe edildi. Modifiye sonuçları 2 sunar Şekil Yeşil tepkiler max olarak işaretlenmiş PE tarafından elde edilen maksimum kasılma ile işaretlenmiş Şekil 1., ½ maksimum kasılma gibi işaretlenir ve daha sonra cevap olduğunu neden olduğu PE konsantrasyonu ile ilişkili. Bu değerler belirlenmesi yarım maksimum (% 50) tepki ya da EC50 değeri elde eden bir agonistinin etkili konsantrasyonu tespitidir. Ne yazık ki, agonist bağımlı parametre kullanılarakreseptör bağlanma özellikleri 9 karmaşık olabilir belirlemek için tek başına s. Sabit antagonisti ayrışma (pKa B) log 10 mol antagonist -log 10: İdeal olarak, reseptör antagonistleri kullanarak ek deneyler, bir ilacın ve bir reseptörü arasındaki etkileşimin tanımlanması için önemli olan iki önemli parametrelerin hesaplanmasına imkan gerekli konsantrasyonu, konsantrasyon-yanıt eğrisinde iki kat sağa doğru bir kaymaya (pA2) 10 çıkarmak için. K B ve pA 2 kazanç onlar agonist-bağımsız değerlerdir ve hatta farklı dokular 11 arasında sabit kalması aslında onların kullanışlılığı Hem. Başka hesaplanmaktadır 50 değerleri Şekil 2 &#39;de verilerden pKa B, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir ve EC&#39;ye göre: = 2 x 10 8 M prazosin yokluğunda EC50 Öncesi AK 50prazosin sence = 7 x 10 -6 M Aşağıdaki denklemde K B çözün: log (dr-1) = [B] log - K B log Nerede: [B] antagonisti konsantrasyonunu = veya 5 x 10 -9 M log (5 x 10 -9 M) = -8.3 dr = yokluğunda antagonist / EC 50 varlığında AT 50 değer doz oranı. Sağa doğru bir kayma ise, bu değer, birden daha fazla olacaktır. Böylece: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M veya 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 [B] ve dr için yerine: K B log - = -8 (350-1) log 2.54 = -8 - KB log pKa B = 10.54 Prazosinin bir α 1 adrenerjik recept ile etkileşime girdiğinde prazosin Bu değer, elde değerlerle tutarlıfenilefrinle daralma aracılık adrenerjik reseptör α 1 adrenerjik reseptör olduğunu düşündüren ya da 12,13,. Birkaç adım bu deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. Dokular, doku yaşabilirliği kaybını önlemek için ayrıldıktan sonra, PSS kalmalıdır. Herhangi bir izometrik kas hazırlık pasif gerginlik 14,15 karşı maksimum güç üretir optimal uzunluk-gerilim ilişkisi vardır. Bu protokolde tarif edilen deneme için, en iyi pasif gerilim önceden dokuya pasif gerilim 0.5 g kısa bir süre ilave artışlarla saptanmıştır. Doku tonu olmadan başlamalı ve dengeleme için 30 dakika sonra, doku aktif sesi üretilir KCI (80 mM) bir maksimum konsantrasyonu ile meydan. Daha sonra, doku yıkandı ve bazal tonu geri bırakıldı. Başlangıçta 15 dakika sonra pasif geriliminin bir diğer 0.5 gr yerleştirilmiş ve bu işlem, bir plato kadar tekrarlanırAktif gerginlik ek pasif gerilim ile elde edilmiştir. Hazırlık deneylerinde, pasif gerginlik 4 g aort halkalarında maksimal etkin gerilim yaratma amaçlı belirlendi ve böylece gerilim bu toplam miktarı önce dengeleme için çalma üzerine yerleştirilir. Prosedürel, önceden pasif germe uygulaması sıfıra en iyi, ama deney öncesinde herhangi bir zamanda yapılabilir. Deney ya da diseksiyon herhangi bir noktada, dokuları germe Aşırı olumsuz doku canlılığını ve deneysel sonuçlar etkileyecektir. Bu adım, aşırı streç en yüksek olasılığı olduğu gibi, banyoda dokuları yerleştirirken Bu en zorunludur. Sayısı ve süresi yeterli yıkama, yeniden üretilebilir etkileri için gereklidir. İkinci zorluk çok yakında dokular başlangıç ​​gerilim döndü ilk mücadeleden sonra, ya da önce, anormal tepkiler neden olacaktır. Döner antagonistleri / inhibitörleri araştırıldığında ise, dokular inhibi olarak, ilave Agonisti önce yıkanmamalıdırtor konsantrasyonu azalacaktır. Izole organ banyosu deneyleri için önemli avantaj ve dezavantajları vardır. Dezavantajları: Dokular kanca halkaları cerrahi olarak çıkarılması veya yerleştirilmesi sırasında hasar farklı derecelerde karşılaşabilirsiniz. Endotel hücre aort halkasının iç astar olduğu bu hücre tabakasına zarar vermemek için, bakım kanca halka yerleşiminde alınmalıdır. Dokular ayrıca, doku banyosu içindeki uygun olduğu zaman belirgin bir biçimde farklı uzunluklara sahip olabilir, ve bu tespit eder; tüm dokular aynıdır. Bu doğrultuda, dokular zaman kontrolleri, her deney için gerekli kontrol olmak gibi o gün boyunca yanıt değişebilir. Bu iyi bir örnek tipik bir 8 saat deney sırasında% 100 kontraktilite maksimum geliştirir kobay trakea olduğunu. Suda zayıf ölçüde çözünür olan ilaçlar PSS çökelebilir. Son olarak, toplu birnd agonist reseptör duyarsızlaştırma oluşursa bir agonist, farklı sonuçlara neden olabilir olan bir ilacın kümülatif olmayan ilaveler; anjiotensin II hızlı Taşiflaksi gösterir böyle bir ilaçtır. Avantajları: Doku banyo deneylerinin temel avantajlarından biri gerçek zamanlı olmasıdır; o yaşanıyor ve hızla sonuç yapmak ve bir deney sırasında sonraki adımlar, yanı sıra gidermenize planı gibi bir deney görebilirsiniz. Bir deney yapmak için bir gün sürer. Multipl dokular tipik haliyle, bir hayvan, kendi kontrolü olarak görev yapabilir, öyle ki, bir hayvandan elde edilebilir ve bu, bir deney gücü ekler. Ilacın doku nispeten saf karşılığının test edilmesi için, böylece bir diğer faktörlere doku izole edilebilir. Bu tür bir doku banyosu sistemi in vitro deneyler, aynı zamanda bir in vivo deney göre ilacın küçük bir miktarının kullanılmasını sağlar. Burada tarif edilen temel deneysel tasarım olabiliryaygın olarak ilave parametrelerin kaydedilmesi ya da diğer dış uyaranların giriş sağlamak için değiştirilebilir. Örneğin, elektrot eklenmesi innerve sinir 16,17 elektrik alan uyarımı için izin verir. Termal veya pH sondaları eklenmesiyle, kasılmaları üzerindeki sıcaklık ve pH etkileri de 18,19 ölçülebilir. Benzer bir şekilde, oksijen, kısmen veya hipoksi nedenli etkilerini değerlendirmek için N2 ile tam olarak sübstitüe edilmiş olabilir. Bundan başka, bu video kullanılan izometrik kontraktilite ölçüm aynı temel prensiplerin hücre içi kalsiyum 20 izometrik gerilim gelişim ve değişikliklerin eşlik eden ölçümüne olanak sistemleri geliştirmek için de kullanılabilir. Sistemleri, bu hızla yanıt sırasında bir doku örneği dondurarak bulunduğu için sinyal transdüksiyonu, hali hazırda, incelenen, bir sinyal iletim yolu sisteminin aktivitesi biyokimyasal kontrol edilebilir, öyle ki. eşdeğeri varyasyonBunu yapmak için de kullanılabilir ipment çok büyüktür. Bütün bu sistem, inşa veya otomatik iki el, birden fazla farklı şirketlerden satın alınabilir. Bu protokolde kullanılan doku banyoları ve doku sahipleri in-house Michigan State Üniversitesi Makine mağazaları tarafından el üfleme (doku banyoları) ve el inşa (sahipleri) idi.

farmakoloji disiplini, 150 yılı aşkın bir süredir izole organ banyosu sistemi kullandı. Bu sistemin çok yönlülüğü hipertansiyon, kalp yetmezliği, diyabet, gastrointestinal hastalık, mesane gibi hastalıklar ya da bozuklukları olan bireylerin milyonlarca tedavi etmiş tedavilerin temelini oluşturan bu bilgi ile, reseptörleri ve reseptör sinyal iletimini karakterize dünya çapında bilim adamları izin verdi disfonksiyon, astım ve yutma bozuklukları, sadece birkaç isim. Doku, bir doku olarak işlev sağlar gibi bu gün için, izole organ banyosu, ilaç geliştirme ve temel araştırma önemli bir yüzünü kalır. Bu vallahi derste, resmi protokol reseptör karakterizasyonu izin izometrik daralma ölçen bir izole organ banyosu deney, veri kullanan bir görsel ve sanal deney göstermek için paylaşılır. Bu tekniğin en önemli avantajı, doku yaşayan olmasıdırvücuda alakalı bir fizyolojik sonuç (kasılma veya gevşeme) ile bir bütün dokusu gibi nd fonksiyonlar. Bu adımlar (ilaç-reseptör etkileşimi, sinyal iletimi, ikinci haberci nesil, düz kas uyarılabilirliğindeki değişim ve doku fonksiyonunda değişiklik) bir sentezidir. Diğer teknikler bu adımların her birinin çalışma (örneğin radyo-ilaç afinite, ikinci haberciler ölçümü için bağlayıcı) izin verirken, izole organ banyosu tekniği tüm bu adımların 1 entegrasyonu sağlar. Diğer bir avantajı doku işlevini koruyarak hücresel ortamda vs dokuda daha anlamlı olan önemli farmakolojik değişkenlerin hesaplanmasına imkan olduğunu; incelenen ilaçların bir bütün olarak vücutta nasıl çalışacağını yakın geliyor.

<table><tbody><tr><td>LabChart Software</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 channel)&amp;nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4 channel)</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>Grass Adapter Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Grass Force-displacement Transducer</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03</td></tr><tr><td>Grass Transducer Cable</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC to BNC Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>Tissue Bath</td><td>Multiple Sources&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Physiological Salt Solution</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Ring Stand</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Dishes</td><td>Handmade with Silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>Hose Clamps</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml Muscle Bath</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Warming Chambers</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Gas Dispersion Tube</td><td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>Micrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Stands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Three-prong Clamps</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>S-connector</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>Tissue Hooks</td><td>Hand Made in House</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereomicroscope MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>Culture Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glass</td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Kit</td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>Splinter &amp;amp; Fixation Forceps</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

Agonizmi açısından, belirli bir dokuda bir agonist nispi etkinliği (Emax) ve güçte (EC50) hesaplanır ve aynı dokuda 1 diğer agonistlerin yanıtlarıyla karşılaştırıldığında edilebilir. Bizim deneyde, sıçan aort araç ya da önce (Şekil 1) ya da doku banyosuna α 1 adrenerjik agonisti fenilefrin ilave edilmesi ve daralma üretilmesi için bir saat boyunca α 1 adrenerjik reseptör antagonisti, prazosin (5 nM) ya da birlikte inkübe edildi. Şekil 2, Şekil 1 hediye sonuçları değiştirilmiş. Yeşil tepkiler PE tarafından elde edilen maksimum kasılma yanıtı olduğunu neden olduğu max, ½ maksimum kasılma gibi işaretlenir ve daha sonra PE konsantrasyonu ile ilişkili olarak işaretlenmiş işaretlediğiniz. Bu değerler belirlenmesi yarım maksimum (% 50) tepki ya da EC elde eden bir agonistinin etkili konsantrasyonu belirlenmesi olan <sub&gt; 50 değer. Bu Sigmoidal eğriler için lojistik fonksiyonları AK 50 değerlerinin eğri uydurma ve hesaplama için kullanılabilir kullanan bu example.Computer yazılım donegraphically oldu. Oluşturma ve bu sonuçlara, bu konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak üzere agonist hem düşük hem de yüksek konsantrasyonlarda kullanılması önemlidir. Yeterli puan istikrarlı bir temel ve maksimum plato göstermek için olmadan, AK 50 ve E MAX sadece tahmin edilebilir. Bu, bu örnekteki grafik yapıldı. Sigmoidal eğriler için lojistik işlevleri kullanır Bilgisayar yazılımı EC 50 değerleri eğri uydurma ve hesaplama için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Doku Banyosu şematik Karikatür çift duvara yerleştirilen bir doku halka temsil, su ceketli doku bainci. Tampon giriş ve çıkış odasının tabanına entegre bir 3-yollu vana cam tarafından düzenlenir. O2 / CO2 PSS ya da gaz sızmasını önlemek için bir conta ile sızdırmaz bir havalandırıcı yoluyla köpürtülür. Devridaim girişi uygun devridaim korumak ve sıcaklık düzensizliğinin neden olur hava cepleri oluşumunu önlemek için çıkış altındadır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Sıçan Göğüs Aort + Endotel Yukarıdaki dört ayrı deneyler (farklı hayvan ve farklı renklerle temsil edilen farklı set up farklı araştırmacılar tarafından yapılan) PE kaynaklı daralma kaydırmaya prazosin yeteneğini test etmek göstermektedir. Prazosin (5 nM) açık bir şekilde paralel bir şekilde PE kaynaklı kasılma eğrisi sağa doğru kaymıştır. Şekil 3: Sıçan Toraks Aort + Endotel Grafik yokluğu (araç) PE EC 50 değerlerinin tahmini ve antagonist varlığı (prazosin).. Yeşil hat (C grubu) sadece işaretlenmiş. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tuz </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 Litre </td><td> SON mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (Gram) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0,8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7H20 </td><td> 246,5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Üzüm şekeri </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: normal fizyolojik tuzlu çözelti (PSS) Tarif Bu deneyde kullanılan bikarbonat tamponlu PSS içeriği.. Bütün tuzlar molekül ağırlıkları ve istenen konsantrasyon elde etmek için dH 2 O 5 L &#39;sine ilave miktarda bulunuyor. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Banyosunda konsantre </td><td> Agonist eklenmesi banyosuna yapılan </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 mi, 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 mi, 1 x 10 5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 8 M </td><td> 100 mi, 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 7 M </td><td> 35 mi, 1 x 10 4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 7 M </td><td> 100 mi, 1 x 10 4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 mi, 1 x 10 3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 mi, 1 x 10 3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 5 M </td><td> 35 mi, 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 4 M </td><td> 35 mi, 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tablo 2:., Doku banyosu katkı agonist konsantrasyonları agonistinin miktarı, ön maddeye, her banyo için eklenecekPerly kümülatif konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak. istenen banyo konsantrasyonu agonistinin artan konsantrasyonlarının ardışık miktarlarda ilave edilmesi sureti ile elde edilir. Her bir ek dikkate banyosu içinde zaten mevcut olan agonist konsantrasyon alır. Bu agonistin tek bir konsantrasyonda artan miktarlarda kullanmaktan sonuçlanacak olan, organ banyosunda hacmindeki artışı en aza indirmek için yapılır.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research at JoVE.com

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

140.3K Görüntüleme.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Video: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Otomatik Tel kasılmaların kâğıda çizilmesi Yüklü daralma ve Rahatlama Çalışmaları

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Tıp

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Alt Üriner Sistem Farmakoloji değerlendirin bir Yöntem olarak mesane düz kas Şerit Kasılabilme

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Bir Biyoassay olarak Sığır Mezenterik Arter ve Ven Bölüm yalıtma ve kullanma İnce Barsak vazoaktiviteye için Test

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

İnsan rahim düz kas yardım ilaç geliştirme için contractility ölçümleri

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Biyoloji

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak Murine Direnç Arter Fonksiyon değerlendirilmesi

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Perivasküler Adipose dokularında modülasyon odaklı Izole mezenterik arterlerin kullanıldığı vasküler ton tepkisini değerlendirmek

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Gastrointestinal Dinamikleri ve İlaçların Motilite Üzerindeki Etkilerini İnceleme Protokolü

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Sıçan Bağırsak Tüpleri Üzerindeki İlaç Etkisinin Güvenilir ve Tekrarlanabilir İn Vitro Değerlendirmesi

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.