תמיכה חלקית עבור עבודה זו סופקה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM100470 ו1R01GM095959-01A1; לתואר שני וJDS) ומענק מתקן Core מהמדעים קליניים וTranslational מכון אינדיאנה (מומן בחלקו על ידי מענק # NIH UL1 TR000006; ל JDS).

1. הנחיל Assay Media הכנה והרכבת 4,5,7,8,11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה הכנה הערה: ההרכב הבינוני המתואר להלן ישים לפ מחקרי היווצרות זלזל aeruginosa. אנא ראה מפרטים של חומרים על לוח 1 לפ aeruginosa, ב &#39; subtilis, ומ &#39; מבחני תנועתיות משטח xanthus. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 200 מיליליטר של FAB-מינוס (NH 4) 2 SO 4 מדיום נחיל (לוח חומרים), 0.9 גר &#39;אגר נובל, ו -0.2 גרם של חומצות Casamino (טבלת 1) על ידי ערבוב עם בר ומערבב מגנטי. השתמש בכמויות קטנות (100-300 מיליליטר) כדי לשפר את ההתאמה בין ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי את תערובת 200 מיליליטר אגר / מדיה באמצעות זמן חשיפה של 22 דקות, טמפרטורת חשיפה של 121.1 מעלות צלזיוס, ואפשרות פורקן מהירה. הגדרות החיטוי תאפשר עיקור תקין והתכה אגר, אבל למנוע שזוף אגר. הערה: אגר נובל נוטה קרמלויזואליזציה; תנועתיות חיידקים משתנים על אגר בקרמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר מחזור העיקור סכם, לסגור את המכסה של בקבוק התקשורת על מנת למנוע אובדן מים על ידי אידוי. עם זאת, יש לציין כי מכסת הדוקה יכולה לגרום &quot;ואקום איטום&quot; אפקט דמוי בבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את התקשורת עד 50 ° C תוך ערבוב בטמפרטורת חדר (RT) ולהוסיף 2 מיליליטר של גלוקוז 1.2 M סטרילי. לחלופין, הנח את המדיה באמבטית חממה או מים 60 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש (עד 15 שעות מאוחר יותר), והמשך כפי שצוין. כדי למנוע את היווצרותן של בועות בתקשורת, ומערבב היטב באמצעות סרגל מערבבים המגנטי; בועות על פני השטח של אגר ימנעו אפילו רוחש. הערה: למבחנים אחרים, להוסיף בשלב זה רכיבים רגישים לחום, שלא ניתן לעקר כגון חומרים מזינים או צבעים נוספים, בהתאם לצורך (למשל, תוספת של 8 μl Invitrogen Syto 63 צבע לכל 100 מיליליטר נמסה אגר לתמונה M. xanthus כפי שמוצג בRepresentative תוצאות, להלן). תוספת של כמה צבע עשויה להשפיע על בסיס התנהגות רץ, שיש לבדוק נגד שליטה הלא-צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף מעבדה, aliquot 7.5 מיליליטר של תקשורת סטרילית לכל צלחת פטרי קלקר בקוטר 60 מ&quot;מ ולשמור על הצלחות בשכבה אחת (לא מוערם). למשטח גדול יותר רץ, aliquot 25 מיליליטר של תקשורת לכל 100 צלחת פטרי בקוטר מ&quot;מ. חשוב למלא את המנות במשטח אופקי אפילו. השתמש בגובה העיניים של שור כדי לבדוק אם השטח הוא מפולס. הערה: לפ מבחני aeruginosa, באמצעות תקשורת ספציפית נפח לכל צלחת ישפרו עקביות ושחזור. לB. subtilis ומ &#39; את מבחני xanthus, תוצאות תשואות יד לשפוך להשוות aliquots נפח מסוים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפוי צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחות קטנות (60 מ&quot;מ), תאפשר בינוני אגר המומס לרפא (שניהם מוגדרים נוזל עודף חצי מוצק והיבש) בשכונה נחשפה (כלומר, ללא מכסים) למשך 30 דקות. יותרצלחות (100 מ&quot;מ) דורשות זמן רב יותר בריפוי (ראה דיון). הערה: לחלופין, כמה מבחני עשויים לדרוש צלחות לרפא בלילה הספסל העליון (20-24 hr) המכוסה (כלומר, מכסים ב) בשכבה אחת (טבלת 1). הרץ הוא רגיש לשתי לחות העודפת ובלתי מספקת. לחות, זרם האוויר, והטמפרטורה של כל מעבדה נתון עשויות להצריך וריאציה לצלחת ריפוי לקדם רץ אופטימלי של חיידקך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן צלחות מייד לאחר תקופת הייבוש נגמרה. אין לאחסן את הצלחות לשימוש נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את &quot;מבחן התפשטות הדיו&quot; על ידי איתור צלחת בדיקה עם תערובת 10 μl של 0.50% (כרך / כרך) השחור Waterproof היגינס הודו דיו ובידוד חיידקי 11. אם תערובת דיו / הבידוד מתפשטת בקלות (כלומר לא שומר על צורת טיפה) על פני השטח של התקשורת, התקשורת זקוקה לזמן נוסף לייבוש. הערה: לזנים שרגישים במיוחד ללחות (&lt;em&gt; לדוגמא, P. aeruginosa), לבצע &quot;בדיקת דיו התפשטות&quot; מהירה 11 כדי לקבוע אם הצלחות הן יבשות מספיק. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נחיל Assay הרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 6 מיליליטר של תקשורת בתרבות המרק (ראה טבלה 1 לפרטים נוספים) עם מושבה מבודדת מתרבות טרי (&lt;5 ימים ההם אם נותרו בטמפרטורת חדר) Lysogeny מרק (LB) צלחת. דגירה תרבויות מרק הלילה (שעות ≤18) על 30 מעלות צלזיוס או 37 מעלות צלזיוס עם רעד אופקי (240 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן צלחות נחיל ידי תצפית עם 1-5 μl של תרבות מרק הלילה, או על ידי &quot;תוקע את&quot; אגר עם שן סטרילי להרים או מחט חיסון תיל. הערה: אנו מעדיפים את השיטה השנייה, כי זה מקטין את הסיכוי של תזת הבידוד ומונע הוספת לחות נוספת לאזור משטח נחיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נחיל Assay דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay הכללי, דגירה צלחות assay נחיל על 30 מעלותC או 37 ° C (או אפילו 42 מעלות צלזיוס למשך &#39;subtilis; טבלת 1) -זהו הוא חיידק ספציפי. הפוך את הצלחות במהלך דגירה, כך שעודף לחות מתעבה על המכסה, לא אגר. הערה: טמפרטורה יכולה להשפיע על הפנוטיפ כמו גם קינטיקה. לP. נחילי aeruginosa, דגירה על 37 מעלות צלזיוס גורמת להרחבת צמיחה ונחיל מהר יותר מדגירה על 30 מעלות צלזיוס; עם זאת, את המורפולוגיה של נחילים אלה לעתים קרובות משתנה עם שינוי זה בטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה זמן לשגות, דגירה צלחות נחיל בטמפרטורה המתאימה לפני ההעברה לתחנת ההדמיה (ראה טבלה 1 לפרטים נוספים). הערה: דגירה מראש הדמיה זו מאפשרת נחילים להתחיל הפיתוח שלהם ולהתבסס לפני שעבר לסביבה חדשה, אשר עשוי או לא עשוי להיות אופטימלי לשורץ תנועתיות. </li></ol></li></ol> 2. הדמיה מקרוסקופית של Surface תנועתיות מבחני 7,8 &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה זמן לשגות, לאחר צלחות assay נחיל מקום תקופת דגירה מראש הדמיה על צלחת הדמיה ברורה בתוך בתחנת הדמיה vivo מסחרית. תמונה עד שש, בקוטר 60 מ&quot;מ או ארבעה, 100 צלחות בקוטר מ&quot;מ בכל פעם. מאז המצלמה לוכדת תמונות מתחת למטוס ההדמיה, להפוך את הצלחות, כך שהנתיב האופטי אינו חסום 8. לחלופין, לדגור על 30 מעלות צלזיוס או 37 ° C (טבלת 1) לתקופת הניסוי, ולהסיר את הצלחות להיות צילמה מן החממה במרווחי זמן קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכסים של צלחות פטרי זקוף על גבי צלחת העמית שמחזיק את התקשורת המחוסנת. מלא את המכסים של צלחות פטרי עם מים כדי למנוע התייבשות מוגזמת במהלך הדמיה, ולהקיף את כל ההגדרה באמצעות אחר מגש ברור לשמור על לחות לאורך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay שימוש בהדמיה מולקולרית (MI) תוכנה 12, לרוץ (ים) בטמפרטורת חדר באמצעות imהזדקנות הגדרות מתוארות בטבלה 2. עבור הדמיה זמן לשגות, להגדיר את פרוטוקול עם הצעדים ומפרטים הדרושים. </li></ol> 3. עיבוד נתונים ופרשנות 7,8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת MI לתמונות אצווה יצוא כקבצי TIFF 16-bit: קובץ&gt; יצוא או יצוא מרובה&gt; בחר קובץ (ים) ליצוא ומיקום יצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ImageJ לפתוח תמונה אחת או לייבא סדרת הזמן לשגות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונה אחת: File&gt; Open </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף יבוא הזמן לשגות תמונה: קובץ&gt; יבוא רצף, ובחר &quot;שמות מיין מספרי&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קבצים גדולים יותר זמן לשגות, בחר באפשרות &quot;השתמש בערימה וירטואלית&quot; בחלון &quot;יבוא הרצף&quot; לערום את התמונות מיוצאות לקטגוריות מתאימות (כלומר, GFP, RFP, וכו &#39;). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, לשנות את התמונות מהקבצים של 16 סיביות לקבצים של 8 ביט: תמונה&gt; סוג&gt; 8 סיביות הערה: כלים ImageJ מסוימים דורשים תמונות 8 ביט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם אות העצמה לתמונה ברצף או זמן לשגות צריכה להיות הפוכה. הצב את הסמן על נקודת אור בתמונה (למשל הצמיחה, שכותרתו fluorescently) ולציין את עוצמת האות &quot;ערך&quot; מסרגל הכלים ImageJ. לאחר מכן, מקם את הסמן בנקודה כהה מחוץ לאזור הצלחת ולב עוצמת האות. אם עוצמת האות לנקודה הכהה היא גדולה יותר מהעוצמת לנקודת האור, עוצמת אות תמונה צריכה להיות הפוכה (בצע substeps 1-2 בהמשך). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את אותות עוצמה: Edit&gt; הפוך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את טבלת חיפוש: תמונה&gt; שולחנות בדיקה&gt; הפוך LUT </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הרקע: התהליך&gt; חיסור רקע, ולהשתמש &quot;רדיוס כדור מתגלגל&quot; עם רדיוס פיקסל שהוא מחצית מממד תמונה אחת (לדוגמא, 1000 פיקסלים לp 2,000 x 2,000תמונת ixel). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מלאכותי צבע תמונה או זמן לשגות רצף: תמונה&gt; שולחנות בדיקה, ובחר את הצבע המתאים מאפשרויות הרשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסרטים עם שניים או יותר ערוצים, למזג ולאזן את הצבעים לפני השמירה כסרט (עיבוד תמונה, שלב 8). כדי למזג תמונות יחד, פתוחים כל ערימות התמונה בImageJ, ולאחר מכן בחר תמונה&gt; צבע&gt; מיזוג ערוצים, ולהקצות לכל מחסנית לערוץ צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את רצף הזמן לשגות כמו AVI או QuickTime סרט: קובץ&gt; שמירה בשם, ובחר בפורמט ומפרטים רצויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת אזור גידול Surface בקטריאלי לכמת שיעור הרחבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה פתוחה (ים) בImageJ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את הקוטר של הצלחת בפיקסלים, למתוח קו החוצה את מרכז צלחת assay עם האפשרות &quot;סטרייט&quot; ומלמדוד את אורכה: ניתוח&gt; מדוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחידת מדידת ברירת המחדל בImageJ היא piXel. להשיג מקדם המרה על ידי חלוקת הקוטר של צלחת assay (למשל, 60 לצלחת 60 מ&quot;מ) באורך פיקסל הושג בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את יחידת מדידה מפיקסל למ&quot;מ: תמונה&gt; מאפיינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את &quot;יחידת אורך&quot; ל &quot;מ&quot;מ&quot;, ואת &quot;Pixel רוחב&quot;, &quot;גובה פיקסל&quot;, ו- &quot;עומק voxel&quot; לגורם ההמרה מחושב בשלב הקודם. בחר בתיבה &quot;גלובל&quot; כדי לשמור על גורם המרה זו על פני מספר רב של תמונות. הערה: אם ImageJ נסגר ונפתח מחדש, או שדה ראייה של תמונה משתנה (כלומר, תמונה אחת מוגדלת יותר מאשר אחר), חייב להיות מחושב מחדש מקדם ההמרה. לחלופין, לבצע את כל ניתוחים בפיקסלים ולאחר מכן הוסב למ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מסגרת, להתחקות ולמדוד את שטח נחיל השימוש באפשרות &quot;בחירות Freehand&quot; בסרגל הכלים כדי לאתר את ouTLine של הנחיל ולמדוד את השטח באמצעות: ניתוח&gt; מדוד. זה יפיק מדידות להיכנס, כי ניתן לשמור לניתוח נוסף בMicrosoft Excel או תוכניות דומות: קובץ&gt; שמירה בשם </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת עצמת צמיחת Surface בקטריאלי לכמת שיעור צמיחת Surface <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרקע מופחת (עיבוד תמונה, שלב 5), השתמש במסגרת האחרונה של הרצף כדי לקבוע את השטח המרבי של נחיל (ניתוח נתונים, שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי הבחירה &quot;הסגלגל&quot; מסרגל הכלים כדי לצייר תיבה מסביב לצמיחת משטח החיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מתכוונים מדידת עוצמת פיקסלים בתיבה באמצעות: ניתוח&gt; מדידות סט, ובחר &quot;Mean ערך אפור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג מדידות אות עוצמה עבור כל מסגרת ברצף הזמן לשגות, ואילו על המסגרת הראשונה של הרצף ללכת ל: ניתוח&gt; מדוד. זה יפיק מדידות להיכנס, כי ניתן לשמור לניתוח נוסף בMicrosoft תוכניות דומות Excel או: קובץ&gt; שמירה בשם </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלופה לסעיף הקודם (ניתוח נתונים, שלב 2). השתמש בתוסף ImageJ מאקרו להתקנה ולהפעיל תסריט מדידת עוצמת צמיחת משטח מאקרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת תסריט מדידה אוטומטית לנתח מסגרות מרובות בו זמנית: Plugin&gt; מאקרו חדש&gt;, ולהדביק את התסריט ובלבד (להלן) לתוך התיבה ולשמור כקובץ טקסט ImageJ מאקרו: File&gt; Save, ולשמור בתיקיית יישום ImageJ תחת &quot; פקודות מאקרו &quot;. numberOfFrames = N ל( i = 0; i &lt;numberOfFrames; i ++) { לרוץ (&quot;מדד&quot;); לרוץ (&#39;הבא Slice [&gt;]&#39;); } הערה: כאן משתנה &quot;N&quot; הוא מספר לא מוגדר של מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוך את &quot;numberOfFrames&quot; בתוסף פקודות מאקרו עבור כל ניסוי על מנת לשקף את מספר המסגרות ברצף התמונה לפני הפעלת הסקריפט. שימוש: Plugin&gt; מאקרו&gt;עריכה, ולהקליד את המספר הנכון של מסגרות ברצף ולשמור (File&gt; Save). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב substeps 1-3 בניתוח נתונים-שלב 2, ואילו במסגרת הראשונה של הרצף להפעיל את תוסף מאקרו: Plugin&gt; מאקרו&gt; הפעלה. זה יפיק מדידות להיכנס, כי ניתן לשמור לניתוח נוסף בMicrosoft Excel או תוכניות דומות: קובץ&gt; שמירה בשם </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Burall, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Proteus+mirabilis.+genes+that+contribute+to+pathogenesis+of+urinary+tract+infection:+Identification+of+25+signature-tagged+mutants+attenuated+at+least+100-fold.">et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold.</a> Infection and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa.+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS One. 6 (6), e20888 (2011).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+waves+of+the+bacterium+Pseudomonas+aeruginosa.+in+propagating+swarms+result+in+efficient+colonization+of+surfaces.">High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 601-609 (2012).</li><li>Morris, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+and+rhamnolipid+production.">Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (23), 8310-8317 (2011).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Partridge, J. D., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming:+flexible+roaming+plans.">Swarming: flexible roaming plans.</a> J Bacteriol. 195 (5), 909-918 (2013).</li><li>Patrick, J. E., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+strains+of+Bacillus+subtilis+.do+not+exhibit+swarming+motility.">Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility.</a> Journal of Bacteriology. 191 (22), 7129-7133 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging. , (2014).</li><li>Harshey, R. M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimorphic+transition+in+Escherichia+coli.+and+Salmonella+typhimurium.:+surface-induced+differentiation+into+hyperflagellate+swarmer+cells.">Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91 (18), 8631-8635 (1994).</li><li>Rashid, M. H., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+polyphosphate+is+needed+for+swimming,+swarming,+and+twitching+motilities+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97 (9), 4885-4890 (2000).</li><li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa.+PA14.">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14.</a> Journal of Bacteriology. 189 (9), 3603-3612 (2007).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic-di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa.:+the+pilY1.+gene+and+its+impact+on+surface-associated+behaviors.">Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors.</a> J Bacteriol. 192 (12), 2950-2964 (2010).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו מומנו באופן חלקי על ידי חברת ברוקר.

השגת רץ לשחזור במעבדה יכולה להיות מאתגר, כמו מבחני נחיל רגישים מאוד לגורמים סביבתיים, כגון לחות וחומרים מזינים זמינים. ההיבט הקריטי ביותר של assay צלחת תנועתיות פני השטח הוא לחות על פני השטח אגר. לפני החיסון, תקשורת נחיל חייבת להיות יבשה מספיק כדי למנוע מתאי חיידקים שחיה על פני נוזל פני השטח, אבל לא כל כך יבשה כמו לעכב רוחש תנועתיות 5. דגירה צריכה להתבצע בסביבה מספיק לחה: לחות מעט מדי יכולה לגרום להתייבשות assay במהלך דגירה, בעוד לחות רבה מדי יכולה להוביל למשטח מלאכותי או artifactual מתפשט. אלא אם כן חממת לחות מבוקרת היא בהישג היד, לחות חממה והמעבדה יכולה להשתנות באופן דרמטי. כתוצאה מכך, מאגר מים נוסף, מכשיר אדים, או מסיר לחות בחממה ייתכן שיידרש כדי למנוע מעל ייבוש או ההצטברות של עודף לחות, תוך שמירה על relatלחות ive קרוב 80%. שמירה על לחות אידיאלית זה עשויה להוכיח מאתגר אם שינויי לחות עונתיות משמעותיים. אם זה המקרה, פרוטוקול assay הנחיל ידרוש קצת התאמות לחשבון לשינויים עונתיים בלחות. מצאנו כי שינוי זמן ייבוש תקשורת הנחיל הוא הדרך הפשוטה ביותר כדי להתאים לשינויי לחות עונתיים. ניטור לחות קבוע, הן בתוך ומחוץ לחממה, מומלץ. יתר על כן, מומלץ שהחוקרים לכייל ולאמת המכשירים, החממות, הקשקשים שלהם, וכו &#39;טעויות קטנות כמו בטמפרטורה, נפח או סכומם של רכיבי תקשורת יכול להשפיע שחזור של מבחני אלה. צריך גם לציין שאת הסוג והגודל של הצלחת המשמש assay יכולים להשפיע על לחות צלחת, ובכך רוחש. צלחות אטום לא לפרוק את עודף לחות, ובכך תנועתיות השחייה מעודדת. בניגוד לכך, צלחות פתוחות פנים לאפשר יותר מדי לחות לברוח. צלחת פטרימספק סביבה אידיאלית כי זה פתחי אוורור מעודף לחות מספיק כדי למנוע נוזל לבנות, אבל שומר על לחות מספיק כדי למנוע את התקשורת מהתייבשות. שיטה זו מפרטת פרוטוקול assay תנועתיות משטח המאפשר הדמיה באיכות גבוהה. כדי לשמור על אגר ברור לכלים בקוטר 60 מ&quot;מ הדמיה מלא 7.5 מיליליטר של תקשורת אגר. אם אינה נדרשת הדמיה מפורטת, כרכים עד 20 מיליליטר יכולים גם לספק תוצאות לשחזור. בעוד תנועתיות רוחשת ניתן להשיג במגוון רחב של ריכוזים אגר, הטווח האופטימלי של אגר הנדרשים לרץ תלוי במין. בסך הכל, ריכוזים גבוהים יותר אגר אינם מאפשרים תנועתיות רוחשת, וכתוצאה מכך את הזמן הדרוש כדי לייצר עליות נחיל דימוי מוכן. P. aeruginosa בדרך כלל שורץ בריכוזים אגר בין .4-.7 1%, עם זאת אנו מוצאים כי רץ אופטימלי מתרחש בטווח צר הרבה יותר (0.4-0.5%). אחרים, כגון B. subtilis וS. entericנחיל באגר 0.6%, וparahaemolyticus Vibrio בשיעור של 1.5% אגר 10. הריכוז אגר הנדרש נקבע גם על ידי הסוג והמותג של אגר. agars טוהר גבוה יותר, כמו אגר נובל, מאוד לשפר שורץ בפ aeruginosa ועדיף על מגורען אגר 13,14. עם זאת, גרסאות אלה מטוהרות של אגר הם גם נוטים יותר לשזופים במהלך מחזור עיקור החיטוי; תלוי במכשיר, רצף מקוצר / שונה עיקור (לאולי לשנות את מחזור הפליטה כדי למנוע חשיפה לחום ממושך) עשוי להידרש להכין תקשורת נחיל באמצעות אגר נובל. הרכב תקשורת גם משחק תפקיד בפנוטיפ הנחיל נצפה 3. P. מחקרי תנועתיות רוחשת aeruginosa מבוצעים בדרך כלל באמצעות מדיה תזונתית מינימאלית. אנחנו מעדיפים FAB 4,8 בינוני (לוח חומרים), אך כלי תקשורת אחרות, כגון M9, LB, או שינויים קלים לתקשורת הנפוצה אלה,שימש בהצלחה 9,15,16. היווצרות זלזל היא הטובה ביותר להשיג על מדיום המינימלי FAB בתוספת גלוקוז כמקור פחמן וחומצות casamino (CAA), אך ללא מקור חנקן נוסף (כלומר, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. אם היווצרות זלזל או מורפולוגיה היא לא המוקד העיקרי של המחקר, ולאחר מכן בינוני מינימאלי FAB (לוח חומרים; טבלת 1) נטול CAA מומלץ כך שההשפעות של מקורות ספציפיים פחמן ו / או חומרים מזינים נוספים ניתן ללמוד בפירוט. מינים אחרים, כגון B. subtilis (המוצג כאן), הוא swarmers תכליתי, מסוגל שורץ על LB ואגר מגורענים. מינים אלה נחילים בקלות, הדורשים רק ~ 10 שעות כדי לפתח נחיל מלא. שיעור מהיר רוחש זה עושה הבא התקדמות הנחיל קשה שעלולים להיות אבל הפרוטוקול שלנו עושה כזה מעקב מאוד ריאלי. היכולת לבצע הדמיה הזמן לשגות נחיל מספקת substantial להקל ברכישת נתונים נחיל, במיוחד מswarmers נלהב כזה. אנחנו מציגים,, פרוטוקול חזק מקיף שני שלבים והנחיות שמטרתן שיפור הביצוע והשחזור של מחקר תנועתיות משטח חיידקים והדגשנו בעיקר היבטים חשובים לבחון רץ בתיווך flagellar. פרוטוקול assay נחיל זה מפרט היבטים חשובים של הרכב תקשורת וטיפול בצלחות תנועתיות פני השטח כדי לספק לעקביות רבה יותר ושחזור בתוך ובין קבוצות מחקר. זה ישפר את בסיס השוואה בין מחקרים שונים. בנוסף, הגישה והפרוטוקול שהוצגה מספק אמצעים לעשות מחקר על תנועתיות רץ ומשטח פחות רגיש לשינויים סביבתיים על ידי הפיכת חוקרים מודעים לכך שגורמים כגון להשפיע על עבודתם ומתן פתרונות אפשריים (למשל, כיצד שינויים קטנים באגרו להשפיע רוחש 4,5 ). יתר על כן, הפרוטוקול הניתן ללכמת היבטים מקרוסקופית של רץ, מספק הזדמנות למדידת תכונות רבות של צמיחת משטח חיידקים שהיו בלתי ניתנים למדידה בעבר. לא בדקנו את כל חיידקי ניע המשטח בפיתוח של פרוטוקול זה. ככזה, הוא צפוי כי שינויי פרוטוקול יידרשו למינים אינם מוצגים כאן. היעילות של פרוטוקול זה מוגבל על ידי הגבולות הגלומים של הציוד וחומרים מועסקים. לדוגמא, מחקרים הקשורים טמפרטורה אינם אפשריים עדיין עם תחנת ההדמיה הברוקר, מאז בקרת טמפרטורה היא לא תכונה של הציוד. בנוסף, השימוש בצבעים (כגון הנילוס אדום להכתים rhamnolipids) יכול להיות מגבלות הקינטית וריכוז 8. טכניקה זו מאוד מסתמכת על העיבוד והניתוח של תמונות דיגיטליות; אוטומציה משופרת של ניתוח נתונים (לדוגמא, באמצעות פקודות מאקרו נוספות פונקצית תסריט בImageJ) היה להפחית את הזמן הנדרש לניתוחולהרחיב את השימושיות של הנתונים. לבסוף, בשל חוסנו של פרוטוקול ההדמיה, יישומים עתידיים צריכים לשאוף בהרחבה בטכניקה זו כדי לבחון משטחי צמיחה פחות אחידים שרלוונטיים יותר למשטחים יישבו על ידי חיידקים פתוגניים וסביבתיים.

חיידקים רבים לעבור על משטחים תוך שימוש באמצעים שונים של הנעה עצמית. אפשר לחקור פנוטיפים תנועתיות מסוימים במעבדה באמצעות מבחני צלחת שמושפעים מהסביבה הנוזלית הקשורים להרכב assay צלחת חצי מוצק. תת-קבוצה של מבחני צלחת תנועתיות משטח שימושי נוספת כרוכה בגז שלב-כלל באוויר חדר. בהתאם לכך, את התוצאה של כל assay תנועתיות משטח מסוים, דורשת שליטה קפדנית של הממשק של שלושה שלבים: המשטח המוצק הסביבתי המקומי, סביבה נוזלית, ואת מאפייני סביבת גז. מצב תנועתיות הנפוצה ביותר למד בassay כגון שלושה שלבים ידוע כשורץ. שורץ תנועתיות היא תנועת הקבוצה מתואמת של תאי חיידקים המונעים על ידי שוטונים שלהם באמצעות סרטי נוזל דקים על משטחי 1. הוא למד בדרך כלל במעבדות באמצעות מבחני צלחת חצי מוצקים המכילים 0.4% -0.8% (wt / כרך) אגר 1. מערך שלפתוגנים אנושיים לנצל זאת תנועתיות התנהגות לחקור וליישב את המארח האנושי. לדוגמא, מיראביליס פרוטאוס משתמש רוחש תנועתיות לעלות השופכה, להגיע ומיישבי שלפוחית ​​השתן וכליות 2. תנועתיות רוחשות נחשבות בדרך כלל שלב מקדים להיווצרות biofilm, הגורם העיקרי להיווצרות מחלה בפתוגנים אנושיים רבים 3. פנוטיפ הרוחשים הוא מגוון מאוד בין מיני חיידקים; הצלחה ושחזור ניסיוני מאוד לסמוך על גורמים כגון הרכב תזונתי, סוג אגר והרכב, פרוטוקול עיקור (למשל, מעוקר), ריפוי תקשורת חצי מוצק, ולחות סביבה (למשל, שינויים עונתיים), בין יתר 3-5. ההשתנות של תגובות תנועתיות משטח מדגישה את האתגרים נתקלו במחקרים הללו והתקשורתיים השפעה המהותית והסביבה יכול תפעיל. לכמה מינים רוחשים, כמו Pseudomonas, mot שורץility יכול להתרחש במגוון של יצירות תקשורת, אם כי הפנוטיפ הנצפה וקצב התפשטות נחילי נלווה ישתנו מאוד 3. , גורמים בשילוב אלה יכולים להפוך את לימודי תנועתיות משטח מאתגרים מאוד. שינויים עונתיים במעבדה יכולים להשפיע על מבחני שלושת שלבים הבאים: מבחני עשויים לתפקד טובים יותר בלח-האוויר של הקיץ וגרוע באוויר היבש של החורף. כאן אנו מציגים הנחיות כלליות לעקוף כמה מהאתגרים הבולטים ביותר בעת ביצוע מחקרי צלחת תנועתיות פני השטח. לחלק ממחקרי תנועתיות פני השטח, הפיתוח של פנוטיפים מסוימים הוא עניין רב. רוב אך לא כולם, מחקרים, שפורסמו לבחון רחש של P. aeruginosa להראות את היווצרות קנוקנות או פרקטלים קורנים ממרכז חיסון 3-9. הבדלים בין פ זני aeruginosa תועדו 5,8, אבל הרבה של הנוכחות או עדר של קנוקנות ניתן לייחס הספציפימדיום ג ופרוטוקול המשמשים למבחני צלחת תנועתיות נחיל אלה. כאן אנו כוללים פרטים על איך לקדם את נחילי יוצרי זלזל לפ aeruginosa. בגלל P. aeruginosa הוא רק אחד של חיידקים שורצים רבים, אנחנו כוללים גם פרטים על השיטה שלנו לבחון רץ של Bacillus subtilis וגלישה של xanthus Myxococcus. כמו P. aeruginosa, מחקר נוכחי בB. subtilis ומ &#39; xanthus משתרע על פני מגוון נושאים כמו חוקרים פועל כדי להבחין באספקטים של נִבִיגָה, תנועתיות, תגובת לחץ, והתנהגות 1,10 מעבר. יש צורך לכמת את הדפוסים ודינמיקה של ההתנהגות הספציפית (ות) עבור תאים אלה בקבוצות רוחשות. רכישת נתונים תנועתיות פני השטח, ניתוח, ופרשנות יכולה להיות מסורבלת ואיכותית. פיתחנו פרוטוקול לניתוח מקרוסקופית מפורט של נחילי חיידקים המספק בנוסף לנחילי מורפולוגיה אזור ושלize (קוטר למשל,), מידע דינמי כמותי לגבי קצב התפשטות נחיל והפצת חיידקים או צפיפות bioproduct 7. יתר על כן, שיטה זו יכולה לנצל את חלבונים זמינים ניאון, הארה, וצבעים כדי להשיג מבט מקיף של אינטראקציות חיידקים 8, כמו גם לעקוב אחר הסינתזה של bioproducts (למשל, P. aeruginosa rhamnolipid 7,8) בתוך נחיל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

תנועתיות משטח חיידקים, כגון רץ, נבחנה בדרך כלל במעבדה באמצעות מבחני צלחת שמחייבים ריכוז מסוים של אגר ולפעמים הכללה של חומרים מזינים מסוימים במדיום הגידול. עריכת כגון המדיה מפורשת ותנאי גידול המשטח משמשת לתת לתנאים המועדפים שמאפשרים לא רק התפתחות חיידקים אבל תנועתיות מתואמת של חיידקים מעל המשטחים אלה בתוך נוזל בסרטים דקים. שחזור של צלחת נחיל ומבחני צלחת תנועתיות משטח אחרים יכול להיות אתגר מרכזי. במיוחד עבור &quot;swarmers הממוזג&quot; יותר שמפגין תנועתיות רק בטווח אגר של 0.4% -0.8% (wt / כרך), שינויים קלים בפרוטוקול או בסביבת מעבדה יכולה להשפיע על תוצאות assay נחיל מאוד. &quot;יכולת רטיבות&quot;, או תכולת מים בממשק נוזל-מוצק-האוויר של מבחני צלחת אלה, היא לעתים קרובות משתנים מפתח להיות בשליטה. אתגר נוסף בהערכת הרץ הוא איך לכמת oהבדלים בין כל שני bserved ניסויים (או יותר). כאן אנו פירוט פרוטוקול שני שלבים תכליתיים להכין ואת מבחני נחיל תמונה. אנו כוללים הנחיות לעקוף את האתגרים הקשורים בדרך כלל עם הכנת תקשורת assay הנחיל וכימות של נתונים ממבחנים אלה. אנחנו במיוחד להדגים את השיטה שלנו באמצעות חיידקים המבטאים כתבים גנטיים ניאון או bioluminescent כמו, לוציפראז (operon סוויטה דה לוקס) חלבון פלואורסצנטי (GFP) הירוק, או כתמים סלולריים כדי לאפשר הדמיה אופטית זמן לשגות. בנוסף, אנו מראים את היכולת של השיטה שלנו כדי לעקוב אחר מתחרים מינים שורצים באותו הניסוי.

וריאציה בהכנת צלחת יכולה להשפיע במידה רבה שורצת תנועתיות. הריפוי או ייבוש הזמן לאחר מילוי בינוני אגר מומס משפיע על הווה סרט נוזל הדק במבחני כושר תנועת פני השטח ותנועתיות חיידקים לאורך זמן. שינויים בהרכב תזונתי משפיעים גם שורצים במשך כמה חיידקים. איור 1 א מציג השפעה לטווח קצר של זמן ייבוש על הפצה של הודו דיו והפצה של הבידוד ראשוני של Bacillus subtilis 11. איור 1 מראה את ההשפעה של זמן ייבוש ותוכניות תרשים 1C ההשפעות של אמוניום סולפט [(NH 4) 2 SO 4] על פיתוח זלזל לאחר מכן על ידי רוחש P. aeruginosa 5. ניתן להשיג תמונות של נקודות קצה של תנועתיות משטח באמצעות אסטרטגיות הדמיה מרובות נתונים מדידים. איור 2 מראה תוצאות צמיחת משטח נציג ל <em&gt; P. aeruginosa רוחש ותמונת הקרינה GFP קשורים אליו; B. רץ subtilis ותמונת פליטת אור הקשורים אליו; וצמיחת משטח xanthus Myxococcus ותמונת הקרינה האדומה הקשורות של SYTO 64 מוכתם תאים. הרחבת רכישת נתונים מעבר רק בדיקה והדמיה של תוצאות נקודת הסיום מאפשרת לחקר התנהגות דינמית (ות) עבור חיידקים גדלו משטח. איור 3 7 מציגה דוגמא של פ aeruginosa רוחש (צילם עבור תאי GFP להביע) וייצור rhamnolipid הקשורים אליו (הדמיה באמצעות הנילוס אדום כתם שומנים בדם) -the כימות של נתונים מתמונות אלה מוצג גם כדי להראות את קצב ההתפשטות של פ aeruginosa רוחש. וידאו 1 מציג זמן לשגות של B. רץ subtilis צילם באמצעות הארה של זן -expressing סוויטה דה לוקס. וידאו 2 8 מראה זמן לשגות של פ aeruginosa </e&gt; Typhimurium מ &#39;(GFP להביע ירוק) וserovar enterica סלמונלה (לוקס להביע אדום) בassay נחיל תחרותי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> איור 1: דוגמאות לגורמים בהכנת assay תנועתיות משטח שמשפיעים על תוצאות assay השפעת () זמן ייבוש אגר על לחות משטח אגר והפצה של הבידוד לב. subtilis (Ref 8), (ב) זמן ייבוש אגר על P. aeruginosa רוחש (הודפס מחדש מRef 5 ברשות), ונוכחות (C) או העדרה של אמוניום סולפט על P. רץ aeruginosa והיווצרות זלזל. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> איור 2: משתנve גישות לצמיחת משטח הדמיה ותנועתיות של חיידקים באמצעות תחנת ברוקר הדמיה. צד על ידי צד תמונה של מצלמה (משמאל) ותמונת ברוקר (מימין) מראים () פ B. aeruginosa להביע באמצעות הגדרות ירוקות הקרינה, צילם-GFP (B) subtilis להביע xanthus פליטת אור לוקס באמצעות הגדרות הארה, ו- צילם כתב (C) מ &#39;מוכתם בSYTO 64 צילם באמצעות הגדרות אדומות הקרינה II. ראה טבלה 2 לקביעת פרטים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> איור 3:. ניתוח איכותי וכמותי של assay תנועתיות פני השטח () ניתוח זמן לשגות של הפצת צפיפות תאים, ייצור rhamnolipid (כתם השומנים הנילוס האדום צילם באמצעות הקרינה האדומהאני הגדרות; סרגל קנה מידה = 15 מ&quot;מ), וכימות (ב) לקצב התרחבות מתמונות הפצת צפיפות תאים של P. נחיל aeruginosa. (הודפס מחדש מRef 6 באישורו.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">וידאו 1.</a> זמן לשגות הדמיה של B. subtilis נחיל. B. subtilis להביע סוויטה דה לוקס ונרשם באמצעות הגדרות ההארה. ראה טבלה 2 לקביעת פרטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">וידאו 2.</a> תחרות interspecies דמיינה ידי הדמיה הזמן לשגות. נחילים של פ aeruginosa (ירוק; להביע GFP ונרשם באמצעות ההגדרות ירוקות הקרינה) וס &#39; Typhimurium serovar enterica (אדום; Expresלשיר סוויטה דה לוקס ונרשם באמצעות הגדרות ההארה). ראה טבלה 2 לקביעת פרטים. (הדפסה חוזרת באישור Ref 7.) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> פ aeruginosa </td><td> מחקרי היווצרות זלזל P. aeruginosa </td><td> &#39;subtilis </td><td> xanthus מ &#39; </td></tr><tr><td> תקשורת ותרבות מרק הלילה </td><td> FAB בתוספת 30 מ&quot;מ גלוקוז </td><td> FAB בתוספת 30 מ&quot;מ גלוקוז </td><td> LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td> טמפרטורת דגירה התרבות מרק הלילה </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 שעות על 30 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> תקשורת נחיל </td><td> FAB </td><td> FAB מינוס (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2% (wt / כרך) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>תקשורת נחיל: רכיבים נוספים </td><td> 12 גלוקוז מ&quot;מ </td><td> 10% CAA (wt / כרך), גלוקוז 12 מ&quot;מ </td><td> n / </td><td> SYTO® 64 </td></tr><tr><td> סוג אגר </td><td> אגר, Noble </td><td> אגר, Noble </td><td> אגר מגורען </td><td> אגר, Noble Affymetrix </td></tr><tr><td> ריכוז אגר (wt / כרך) </td><td> 0.45% </td><td> 0.45% </td><td> 0.60% </td><td> 1.50% </td></tr><tr><td> גודל צלחת נחיל </td><td> 60 מ&quot;מ </td><td> 60 מ&quot;מ </td><td> 100 מ&quot;מ </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> תקשורת לכל צלחת נפח </td><td> 7.5 מיליליטר </td><td> 7.5 מיליליטר </td><td> יד שפכו </td><td> יד שפכו </td></tr><tr><td> הגדרת תקשורת נחיל / שיטת ייבוש </td><td> הוד; צלחות שנחשפו </td><td> הוד; צלחות שנחשפו </td><td> Benchtop; צלחות מכוסות </td><td> Benchtop; צלחות מכוסות </td></tr><tr><td> הגדרת תקשורת נחיל / זמן ייבוש </td><td> 30 דקות </td><td> 30 דקות </td><td> (20 -24 שעות) הלילה </td><td> (20 -24 שעות) הלילה </td></tr><tr><td> טמפרטורת הדגירה assay נחיל </td><td> 30 או 37 מעלות צלזיוס </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> דגירה של הדמיה זמן לשגות </td><td> 30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות </td><td> 30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות </td><td> 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 </td><td> RT עבור שעות 12 </td></tr><tr><td> אורך לכידת זמן לשגות </td><td> 24 שעות </td><td> 24 שעות </td><td> 10 שעות </td><td> 66 שעות </td></tr><tr><td> הגדרת זמן לשגות </td><td> 1 מסגרת דק &#39;/ 10 </td><td> 1 מסגרת דק &#39;/ 10 </td><td> 1 מסגרת דק &#39;/ 6 </td><td> 1 מסגרת דק &#39;/ 10 </td></tr><tr><td colspan="3"> נוסף לאחר מעוקר. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1:. מפרט לSurface תנועתיות Assay הכנה כוללת משטחמפרטי הכנת assay תנועתיות לפ aeruginosa, ב &#39; subtilis, ומ &#39; xanthus. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אות </td><td> הקרינה ירוקה </td><td> אדומה קרינתי </td><td> אדום הקרינה II </td><td> נְהוֹרָנוּת </td></tr><tr><td> חלבון או צבע </td><td> חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) </td><td> חלבון mCherry או כתם האדום הנילוס rhamnolipid </td><td> SYTO® 64 </td><td> לוציפראז מoperon סוויטה דה לוקס </td></tr><tr><td> גל עירור (ננומטר) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> Off </td></tr><tr><td> אורך גל פליטה (ננומטר) </td><td> 535 ± 17.5 </td><td> 600 ± 17.5 </td><td> 670 ± 17.5 </td><td> ללא מסנן </td></tr><tr><td> זמן חשיפה (שניות)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> זיוני תחנה </td><td> 4.0 </td><td> 4.0 </td><td> 2.5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> FOV (מ&quot;מ) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> משטח הפוקוס (מ&quot;מ) </td><td> 27.5 </td><td> 27.5 </td><td> 12.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> יניג (פיקסלים) </td><td> אף אחד </td><td> 2 x 2 </td><td> אף אחד </td><td> 8 x 8 </td></tr></tbody></table> מפרט הדמיה מפרטי תחנת ההדמיה ברוקר לקרינה אדומה וירוקה, והדמיה הארה של משטח צמיחת חיידקים: טבלה 2..

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays at JoVE.com

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Video: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...