وقدم الدعم الجزئي لهذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (1R01GM095959-01A1 وR01GM100470، لMA وJDS) ومنحة مرفق الأساسية من معهد العلوم السريرية وبالحركة إنديانا (بتمويل جزئي من المعاهد الوطنية للصحة منحة # UL1 TR000006، ل JDS).

<ol>
	<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Burall, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Proteus+mirabilis.+genes+that+contribute+to+pathogenesis+of+urinary+tract+infection:+Identification+of+25+signature-tagged+mutants+attenuated+at+least+100-fold.">et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold.</a> Infection and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa.+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS One. 6 (6), e20888 (2011).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+waves+of+the+bacterium+Pseudomonas+aeruginosa.+in+propagating+swarms+result+in+efficient+colonization+of+surfaces.">High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 601-609 (2012).</li><li>Morris, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+and+rhamnolipid+production.">Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (23), 8310-8317 (2011).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Partridge, J. D., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming:+flexible+roaming+plans.">Swarming: flexible roaming plans.</a> J Bacteriol. 195 (5), 909-918 (2013).</li><li>Patrick, J. E., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+strains+of+Bacillus+subtilis+.do+not+exhibit+swarming+motility.">Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility.</a> Journal of Bacteriology. 191 (22), 7129-7133 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging. , (2014).</li><li>Harshey, R. M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimorphic+transition+in+Escherichia+coli.+and+Salmonella+typhimurium.:+surface-induced+differentiation+into+hyperflagellate+swarmer+cells.">Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91 (18), 8631-8635 (1994).</li><li>Rashid, M. H., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+polyphosphate+is+needed+for+swimming,+swarming,+and+twitching+motilities+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97 (9), 4885-4890 (2000).</li><li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa.+PA14.">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14.</a> Journal of Bacteriology. 189 (9), 3603-3612 (2007).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic-di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa.:+the+pilY1.+gene+and+its+impact+on+surface-associated+behaviors.">Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors.</a> J Bacteriol. 192 (12), 2950-2964 (2010).</li></ol>

رسوم النشر لهذه المادة رعيت جزئيا من قبل شركة بروكر.

يمكن تحقيق يحتشدون استنساخه في المختبر أن يكون تحديا، والمقايسات سرب شديدة الحساسية للعوامل البيئية مثل الرطوبة والمواد المغذية المتاحة. الجانب الأكثر أهمية من سطح لوحة حركية الاختبار هو الرطوبة على سطح أجار. قبل التلقيح، يجب أن تكون وسائل الإعلام سرب الجاف بما يكفي لمنع الخلايا البكتيرية من السباحة عبر السائل السطح، ولكن لم يجف وذلك لمنع يحتشدون حركية 5. حضانة ينبغي أن يتم في بيئة رطبة بما فيه الكفاية: الرطوبة قليلة جدا يمكن أن يؤدي إلى جفاف الفحص من خلال الحضانة، بينما الكثير من الرطوبة يمكن أن يؤدي إلى سطح الاصطناعي أو مصطنعة الانتشار. ما لم حاضنة التي تسيطر عليها الرطوبة في متناول اليد، ويمكن الحاضنة ومختبر الرطوبة تختلف بشكل كبير. ونتيجة لذلك، خزان إضافي للمياه، المرطب، أو مزيل الرطوبة داخل الحاضنة قد تكون هناك حاجة لمنع أكثر من تجفيف أو تراكم الرطوبة الزائدة مع الحفاظ على تعصبإيف الرطوبة بالقرب من 80٪. الحفاظ على هذه الرطوبة المثالية قد تكون صعبة إذا كانت التغييرات الموسمية والرطوبة كبيرة. إذا كان هذا هو الحال، فإن بروتوكول سرب الفحص تتطلب بعض التعديلات لحساب التغيرات الموسمية في الرطوبة. لقد وجدنا أن تعديل وقت التجفيف وسائل الإعلام سرب هو أبسط وسيلة لضبط التغييرات الرطوبة الموسمية. مراقبة الرطوبة ثابتة، على حد سواء داخل وخارج الحاضنة، يوصى. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن أن الباحثين معايرة والتحقق من صحة من الصكوك، وحاضنات، والمقاييس، الخ الأخطاء الطفيفة كما هو الحال في درجة الحرارة، وحجم أو مبالغ مكونات وسائل الإعلام يمكن أن تؤثر استنساخ هذه المقايسات. كما ينبغي الإشارة إلى أن نوع وحجم لوحة المستخدمة في الفحص يمكن أن تؤثر على لوحة الرطوبة، وبالتالي يحتشدون. لوحات محكم لا تنفيس قبالة الرطوبة الزائدة، وبالتالي تشجيع الحركة السباحة. في المقابل، لوحات مفتوحة الوجه تسمح الكثير من رطوبة من الفرار. طبق بيترييوفر بيئة مثالية لأنه منافس خارج ما يكفي من الرطوبة الزائدة لمنع السائل تتراكم، ولكن يحتفظ رطوبة كافية لمنع وسائل الإعلام من الجفاف. تفاصيل هذه الطريقة بروتوكول فحص الحركة السطحية التي تسمح للتصوير عالية الجودة. للحفاظ على أجار واضحة للأطباق بقطر 60 ملم التصوير تمتلئ 7.5 مل من وسائل الإعلام أجار. إذا لم يكن مطلوبا التصوير بالتفصيل، يمكن أحجام تصل إلى 20 مل أيضا تقديم نتائج قابلة للتكرار. بينما يحتشدون حركية يمكن أن يتحقق على مجموعة واسعة من تركيزات آغار، ومجموعة الأمثل للأجار اللازمة ليحتشدون يعتمد على الأنواع. وعموما، تركيزات أعلى أجار تمنع يحتشدون حركية، وبالتالي الوقت اللازم لإنتاج AN-صورة جاهزة زيادات سرب. P. الزنجارية تكتظ عادة على تركيزات أجار بين 0.4-0.7٪ 1، ومع ذلك نجد أن يحتشدون الأمثل يحدث في نطاق أضيق بكثير (0،4-0،5٪). آخرون، مثل B. الرقيقة وS. المعويسرب عند 0.6٪ أجار، والضمة نظيرة الحالة للدم بنسبة 1.5٪ أجار 10. يتم تحديد تركيز أجار مطلوب أيضا حسب نوع ونوع من أجار. agars نقاء أعلى، مثل نوبل أجار، وتعزيز بقوة يحتشدون في P. ويفضل الزنجارية وأكثر من حبيبات أجار 13،14. ومع ذلك، هذه الإصدارات تنقيته من أجار هي أيضا أكثر عرضة للانتاج الكراميل خلال دورة التعقيم الأوتوكلاف. اعتمادا على الصك، و/ تعديل تسلسل التعقيم تقصير (لربما يغير من دورة العادم لمنع التعرض للحرارة لفترة طويلة) قد تكون هناك حاجة لإعداد وسائل الاعلام سرب باستخدام نوبل أجار. تكوين وسائل الإعلام أيضا يلعب دورا في سرب النمط الظاهري لوحظ 3. P. عادة ما يتم تنفيذ الزنجارية الدراسات يحتشدون حركية باستخدام الحد الأدنى من وسائل الإعلام المغذيات. نحن نفضل فاب المتوسط ​​4،8 (مواد الجدول)، ولكن وسائل الإعلام الأخرى، مثل M9، LB، أو اختلافات طفيفة في وسائل الإعلام هذه الشائعة،وقد استخدمت بنجاح 9،15،16. وأفضل طريقة لتحقيق تشكيل حالق على FAB المتوسطة الحد الأدنى تستكمل مع الجلوكوز كمصدر للكربون والأحماض casamino (CAA)، ولكن من دون مصدر النيتروجين إضافية (أي، (NH 4) 2 SO 4) 6،13. إذا تشكيل حالق أو التشكل ليس هو المحور الرئيسي لهذه الدراسة، ثم FAB الحد الأدنى من المتوسط ​​(مواد الجدول، الجدول 1) تخلو من الجهاز المركزي للمحاسبات يوصى بحيث آثار مصادر الكربون محددة و / أو مغذيات إضافية يمكن دراستها بالتفصيل. الأنواع الأخرى، مثل B. الرقيقة (المقدمة هنا)، هي swarmers تنوعا، وقادرة على يحتشدون على LB وأجار المحبب. هذه الأنواع سرب بسهولة، لا تتطلب سوى ~ 10 ساعة لتطوير سرب كامل. هذا المعدل يحتشدون بسرعة يجعل التالية من تطور سرب المحتمل أن تكون صعبة ولكن لدينا بروتوكول يجعل هذا ممكنا تتبع للغاية. القدرة على أداء سرب الوقت الفاصل بين التصوير توفر substanللمحاكمة سهولة في الحصول على البيانات سرب، ولا سيما من مثل هذا swarmers متعطشا. ونحن نقدم قوية، شامل، والبروتوكول على مرحلتين والمبادئ التوجيهية التي تهدف إلى تعزيز التنفيذ واستنساخ البكتيريا البحوث الحركة السطحية وأكدت في المقام الأول الجوانب الهامة لدراسة بوساطة سوطي يحتشدون. تفاصيل هذا البروتوكول سرب فحص جوانب هامة من تكوين وسائل الإعلام والتعامل مع لوحات حركية سطح لتوفير قدر أكبر من الاتساق والتكاثر داخل وبين المجموعات البحثية. سيؤدي ذلك إلى تحسين أساس المقارنة بين الدراسات البحثية المختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج المقدمة وبروتوكول يوفر وسيلة لجعل البحث على سطح يحتشدون وحركية أقل عرضة للتغيرات البيئية من خلال جعل الباحثون على علم بأن هذه العوامل تؤثر على عملهم وتوفير الحلول الممكنة (على سبيل المثال، كيف يمكن للتغييرات صغيرة في أجار تؤثر يحتشدون 4،5 ). وعلاوة على ذلك، قدم بروتوكول لتحديد جوانب العيانية من يحتشدون، ويوفر فرصة لقياس العديد من سمات النمو سطح البكتيريا التي كانت في السابق غير قابل للقياس. نحن لم فحص كل البكتيريا متحركة السطح في تطوير هذا البروتوكول. على هذا النحو، فمن المتوقع أن سيطلب تعديلات بروتوكول للأنواع لم يقدم هنا. ويقتصر كفاءة هذا البروتوكول في إطار حدود المتأصلة في المعدات والمواد المستخدمة. على سبيل المثال، والدراسات المتعلقة درجة الحرارة ليست ممكنة حتى الآن مع محطة التصوير بروكر، منذ التحكم في درجة الحرارة ليست سمة من سمات المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الأصباغ (مثل النيل الأحمر إلى وصمة عار rhamnolipids) على قيود الحركية وتركيز 8. هذه التقنية تعتمد بقوة على معالجة وتحليل الصور الرقمية. تحسين التشغيل الآلي لتحليل البيانات (على سبيل المثال، وذلك باستخدام وحدات الماكرو إضافية وظيفة البرنامج النصي في يماغيج) من شأنه أن يقلل من الوقت اللازم لتحليلوتوسيع فائدة البيانات. وأخيرا، نظرا لمتانة بروتوكول التصوير، وينبغي أن تهدف التطبيقات المستقبلية في توسيع هذه التقنية لدراسة السطوح نمو أقل موحدة التي هي أكثر أهمية على الأسطح مستعمرة من قبل البكتيريا المسببة للأمراض البيئية و.

العديد من أنواع البكتيريا تتحرك على الأسطح باستخدام مختلف وسائل الدفع الذاتي. بعض الظواهر الحركة يمكن البحث في المختبر باستخدام المقايسات لوحة التي تتأثر البيئة السائلة المرتبطة شبه صلبة تكوين لوحة الفحص. مجموعة فرعية من سطح مفيدا المقايسات لوحة حركية أخرى تنطوي على هواء الغرفة الغاز مراحل عادة. وفقا لذلك، ونتائج معين أي فحص الحركة السطح، يتطلب مراقبة دقيقة واجهة من ثلاث مراحل: سطح صلب البيئي المحلي والبيئة السائلة، وخصائص البيئة الغاز. ومن المعروف أن وضع الحركة الأكثر دراسة عادة في مثل هذا الفحص من ثلاث مراحل كما يحتشدون. يحتشدون الحركة هي الحركة مجموعة منسقة من الخلايا البكتيرية التي تدفعها سياط من خلال الأفلام السائل رقيقة على السطوح 1. وعادة ما درسه في المختبرات باستخدام المقايسات لوحة شبه صلبة تحتوي على 0.4٪ -0.8٪ (وزن / المجلد) أجار 1. مجموعة منمسببات الأمراض البشرية تستغل هذا السلوك الحركة لاستكشاف واستعمار المضيف البشري. على سبيل المثال، يستخدم المتقلبة الرائعة يحتشدون حركية لنقل ما يصل مجرى البول، ووصلت واستعمار المثانة والكلى 2. ويعتبر يحتشدون حركية عموما خطوة تمهيدية لتشكيل بيوفيلم، والسبب الرئيسي لالمرضية في كثير من مسببات الأمراض البشرية 3. النمط الظاهري يحتشدون متنوع للغاية بين الأنواع البكتيرية. نجاح التجريبية والتكاثر تعتمد بقوة على عوامل مثل تكوين المغذيات، نوع أجار وتكوينها، بروتوكول التعقيم (على سبيل المثال، التعقيم)، علاج وسائل الإعلام شبه صلبة، والرطوبة المحيطة (على سبيل المثال، والتغيرات الموسمية)، من بين أمور أخرى 3-5. تباين ردود حركية سطح يؤكد على التحديات التي واجهتها في هذه الدراسات ووسائل الإعلام تأثير كبير والبيئة يمكن أن تمارس. بالنسبة لبعض الأنواع يحتشدون، مثل الزائفة، يحتشدون يذكرهيمكن أن يحدث ility على مجموعة متنوعة من التراكيب وسائل الإعلام، على الرغم من أن النمط الظاهري المرصود والمصاحبة معدل التوسع سرب سوف تختلف اختلافا كبيرا 3. ويمكن الجمع بين هذه العوامل تجعل دراسات الحركة سطح صعبة للغاية. تغيرات موسمية داخل المختبر يمكن أن تؤثر هذه المقايسات ثلاث مراحل: المقايسات قد تعمل على نحو أفضل في الهواء الرطبة من الصيف وأسوأ في الهواء الجاف من الشتاء. هنا نقدم المبادئ التوجيهية العامة للتحايل بعض من أبرز التحديات عند تنفيذ الدراسات سطح لوحة حركية. وبالنسبة لبعض الدراسات حركية السطح، وتطوير الظواهر المحددة هي ذات أهمية كبيرة. معظم، ولكن ليس كل شيء، الدراسات المنشورة لدراسة يحتشدون من P. الزنجارية تظهر تشكيل المحلاق أو فركتلات يشع من مركز التلقيح 3-9. الاختلافات بين P. وقد تم توثيق سلالات الزنجارية 5،8، ولكن الكثير من وجود أو عدم وجود المحلاق يمكن أن يعزى إلى specifiج المتوسطة وبروتوكول يستخدم لهذه المقايسات لوحة سرب الحركة. نحن هنا تتضمن تفاصيل حول كيفية تعزيز أسراب تشكيل حالق لP. الزنجارية. لأن P. الزنجارية هي مجرد واحدة من العديد من أنواع البكتيريا يحتشدون، ندرج أيضا تفاصيل عن طريقة لدينا لدراسة يحتشدون من العصوية الرقيقة ومزلق من المكورة المخاطية زانثس. مثل P. الزنجارية، والبحث الحالي على B. الرقيقة وM. زانثس يمتد مجموعة من الموضوعات مثل الباحثين يعملون على تمييز جوانب تبوغ، حركية، استجابة الإجهاد، والسلوك الانتقالي 1،10. هناك حاجة لتحديد الأنماط وديناميات سلوك معين (ق) لهذه الخلايا في مجموعات يحتشدون. الحصول على البيانات الحركة السطح، ويمكن تحليل، وتفسير تكون مرهقة والنوعي. لقد قمنا بتطوير بروتوكول لتحليل العيانية مفصل لأسراب البكتيرية التي توفر بالإضافة إلى سرب التشكل منطقة والصورةإيزي (على سبيل المثال، قطر)، المعلومات الحيوية الكمية المتعلقة معدل التوسع سرب وتوزيع المنتجات الحيوية البكتيرية أو الكثافة 7. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذا الأسلوب الاستفادة من البروتينات المتاحة الفلورسنت، والتلألؤ، والأصباغ للحصول على رؤية شاملة من التفاعلات البكتيرية 8، وكذلك لتتبع تركيب المنتجات الحيوية (على سبيل المثال، rhamnolipid P. الزنجارية 7،8) ضمن سرب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

الحركة سطح البكتيرية، مثل يحتشدون، يتم فحص عادة في المختبر باستخدام المقايسات لوحة التي تستلزم تركيزات محددة من أجار وأحيانا إدراج العناصر المغذية المحددة في وسط النمو. إعداد هذه الوسائط صريحة وظروف النمو سطح يعمل على توفير الظروف المواتية التي تسمح نمو البكتيريا وليس فقط ولكن الحركة منسقة من البكتيريا على هذه الأسطح ضمن الأفلام السائل رقيقة. استنساخ لوحة سرب وغيرها من المقايسات لوحة حركية سطح يمكن أن يكون تحديا كبيرا. خاصة بالنسبة للأكثر &quot;swarmers المعتدلة&quot; التي تظهر حركية فقط ضمن نطاقات أجار 0.4٪ -0.8٪ (وزن / المجلد)، تغييرات طفيفة في بروتوكول أو بيئة معملية يمكن أن تؤثر بشكل كبير نتائج الفحص سرب. &quot;بلل&quot;، أو محتوى الماء في واجهة السائل الصلبة في الهواء من هذه المقايسات لوحة، وغالبا ما يكون متغير رئيسي أن يكون للرقابة. تحديا إضافيا في تقييم يحتشدون هو كيفية قياس سالخلافات bserved بين أي اثنين (أو أكثر) التجارب. نحن هنا التفاصيل بروتوكول مرحلتين تنوعا لإعداد المقايسات وصورة سرب. نحن وتشمل المبادئ التوجيهية للتحايل على التحديات المرتبطة عادة مع إعداد وسائل الاعلام سرب الفحص النوعي والكمي لبيانات من هذه المقايسات. ونحن على وجه التحديد إظهار أسلوبنا باستخدام البكتيريا التي تعبر عن صحفيين الجيني الفلورسنت أو إضاءة الحيوية مثل الأخضر بروتين فلوري (GFP)، و luciferase (لوكس الاوبرون)، أو البقع الخلوية لتمكين التصوير الضوئي الوقت الفاصل بين. علينا أن نظهر كذلك قدرة لدينا وسيلة لتتبع المتنافسة يحتشدون الأنواع في نفس التجربة.

الاختلاف في إعداد لوحة يمكن أن تؤثر بشكل كبير يحتشدون حركية. لعلاج أو التجفيف مرة بعد صب ذاب المتوسطة أجار يؤثر رقيقة الحاضر الفيلم السائل على سطح المقايسات الحركة والحركة البكتيرية مع مرور الوقت. تغييرات في تكوين المواد الغذائية تؤثر أيضا يحتشدون لعدة البكتيريا. الشكل 1A يظهر تأثير على المدى القصير من وقت التجفيف على انتشار الهند الحبر ونشر من اللقاح الأولي من العصوية الرقيقة (11). ويبين الشكل 1B تأثير وقت التجفيف ويظهر الشكل 1C آثار كبريتات الأمونيوم [(NH 4) 2 SO 4] على التنمية حالق اللاحقة التي كتبها يحتشدون P. الزنجارية 5. ويمكن الحصول على البيانات الكمية من الصور نقطة النهاية من الحركة السطحية باستخدام استراتيجيات التصوير متعددة الشكل 2 يوضح النتائج نمو سطح تمثيلية لل <em&gt; P. الزنجارية يحتشدون وصورتها مضان GFP المرتبطة بها؛ B. الرقيقة يحتشدون وصورة تلألؤ بيولوجي المرتبط به. والنمو سطح المكورة المخاطية زانثس وما يرتبط بها من الصورة مضان الحمراء من خلايا SYTO 64 الملون. التوسع في الحصول على البيانات وراء التفتيش عادل والتصوير النتائج نقطة النهاية يسمح لدراسة السلوك الديناميكي (ق) لسطح البكتيريا النمو. الشكل 3 7 يوضح مثال P. الزنجارية يحتشدون (تصوير لخلايا GFP التعبير) وإنتاج rhamnolipid المرتبط به (تصوير باستخدام النيل الأحمر الدهون وصمة عار) يتم عرض -THE الكمي من البيانات من هذه الصور أيضا لإظهار معدل التوسع في P. الزنجارية يحتشدون. فيديو 1 يظهر الفاصل بين وقت B. تصوير الرقيقة يحتشدون باستخدام التلألؤ من سلالة -expressing لوكس. فيديو 2 8 يظهر الفاصل بين وقت P. الزنجارية </eم&gt; (GFP، معربا عن الأخضر) والسالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (التعبير الحمراء لوكس) في سرب فحص تنافسية. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> الشكل 1: أمثلة من العوامل في إعداد السطح الحركة الفحص التي تؤثر على نتيجة الفحص تأثير (A) وقت أجار على تجفيف رطوبة سطح أجار وانتشار اللقاح لB.. الرقيقة (المرجع 8)، (ب) وقت أجار على تجفيف P. الزنجارية يحتشدون (أعيد طبعها من المرجع 5 بإذن)، و (C) وجود أو عدم وجود كبريتات الأمونيوم على P. الزنجارية يحتشدون وتشكيل حالق. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> الشكل 2: Alternatiلقد النهج للنمو سطح التصوير والحركة من البكتيريا باستخدام محطة التصوير بروكر. جنبا إلى جنب صورة من كاميرا (يسار) وصورة بروكر (يمين) تظهر (A) P. الزنجارية التعبير باستخدام إعدادات الخضراء الإسفار،-تصوير GFP (ب) B. الرقيقة معربا عن وكس تلألؤ بيولوجي باستخدام إعدادات التلألؤ، وتصوير مراسل (C) M. زانثس ملطخة SYTO 64-تصوير باستخدام إعدادات الأحمر الإسفار II. انظر الجدول رقم 2 لوضع التفاصيل. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> الرقم 3: التحليل النوعي والكمي للمقايسة حركية السطح (A) تحليل الوقت الفاصل بين التوزيع كثافة الخلايا، التقط إنتاج rhamnolipid (النيل الأحمر الدهون وصمة عار باستخدام الإسفار الأحمرI الإعدادات. شريط النطاق = 15 ملم)، و (ب) القياس الكمي لللتوسع معدل من الصور توزيع كثافة الخلية من P. الزنجارية سرب. (نقلا عن المرجع 6 بإذن). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">فيديو 1.</a> الوقت الفاصل بين التصوير من B. الرقيقة سرب. B. الرقيقة معربا عن وكس وتسجيلها باستخدام الإعدادات التلألؤ. انظر الجدول رقم 2 لوضع التفاصيل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">فيديو 2.</a> المنافسة بين الأنواع تصور بواسطة التصوير مرور الزمن. أسراب من P. الزنجارية (الأخضر، معربا عن GFP وتسجيلها باستخدام الإعدادات الأخضر الإسفار) وS. التيفية الفأرية الملهبة للضرب مصلي (أحمر، مورينداتاهيتيانونيالغناء لوكس وتسجيلها باستخدام الإعدادات التلألؤ). انظر الجدول رقم 2 لوضع التفاصيل. (طبع بإذن من المرجع 7). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> P. الزنجارية </td><td> P. الزنجارية الدراسات تشكيل حالق </td><td> B. الرقيقة </td><td> M. زانثس </td></tr><tr><td> مرق بين عشية وضحاها سائل الإعلام والثقافة </td><td> FAB بالإضافة إلى 30 ملي الجلوكوز </td><td> FAB بالإضافة إلى 30 ملي الجلوكوز </td><td> رطل </td><td> CTT </td></tr><tr><td> مرق بين عشية وضحاها في درجة الحرارة الثقافة حضانة </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ساعة على 30 ° C </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام سرب </td><td> FAB </td><td> FAB ناقص (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2٪ (وزن / المجلد) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>وسائل الإعلام سرب: مكونات إضافية </td><td> 12 ملي الجلوكوز ل </td><td> 10٪ (وزن / المجلد) الجهاز المركزي للمحاسبات، 12 ملي الجلوكوز ل </td><td> ن / أ </td><td> SYTO® 64 ل </td></tr><tr><td> نوع أجار </td><td> أجار، نوبل </td><td> أجار، نوبل </td><td> حبيبات أجار </td><td> أجار، نوبل Affymetrix </td></tr><tr><td> تركيز أجار (وزن / المجلد) </td><td> 0.45٪ </td><td> 0.45٪ </td><td> 0.60٪ </td><td> 1.50٪ </td></tr><tr><td> سرب حجم لوحة </td><td> 60 ملم </td><td> 60 ملم </td><td> 100 مم </td><td> 150 مم </td></tr><tr><td> حجم وسائل الإعلام في لوحة </td><td> 7.5 مل </td><td> 7.5 مل </td><td> ومن ناحية سكب </td><td> ومن ناحية سكب </td></tr><tr><td> إعداد وسائل الاعلام سرب / طريقة التجفيف </td><td> غطاء محرك السيارة. لوحات كشفت </td><td> غطاء محرك السيارة. لوحات كشفت </td><td> الفوق. لوحات غطت </td><td> الفوق. لوحات غطت </td></tr><tr><td> إعداد وسائل الاعلام سرب / وقت التجفيف </td><td> 30 دقيقة </td><td> 30 دقيقة </td><td> بين عشية وضحاها (20 -24 ساعة) </td><td> بين عشية وضحاها (20 -24 ساعة) </td></tr><tr><td> سرب درجة حرارة فحص حضانة </td><td> 30 أو 37 درجة مئوية </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> الحضانة لوقت التصوير مرور </td><td> 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة </td><td> 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة </td><td> 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة </td><td> RT لمدة 12 ساعة </td></tr><tr><td> الوقت الفاصل بين القبض على طول </td><td> 24 ساعة </td><td> 24 ساعة </td><td> 10 ساعة </td><td> 66 ساعة </td></tr><tr><td> إعداد الوقت الفاصل بين </td><td> 1 الإطار / 10 دقيقة </td><td> 1 الإطار / 10 دقيقة </td><td> 1 الإطار / 6 دقيقة </td><td> 1 الإطار / 10 دقيقة </td></tr><tr><td colspan="3"> واضاف بعد التعقيم. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1: مواصفات السطحية على الحركة الفحص يشمل إعداد السطحمواصفات إعداد مقايسة حركية لP. الزنجارية، B. الرقيقة، وM. زانثس. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> إشارة </td><td> الإسفار الأخضر </td><td> الأحمر الإسفار I </td><td> الأحمر الإسفار II </td><td> التلألؤ </td></tr><tr><td> البروتين أو صبغ </td><td> الإسفار البروتين الأخضر (GFP) </td><td> بروتين mCherry أو النيل الأحمر rhamnolipid وصمة عار </td><td> SYTO® 64 </td><td> luciferase المراسل من لوكس الاوبرون </td></tr><tr><td> الطول الموجي الإثارة (نانومتر) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> بعيدا </td></tr><tr><td> الطول الموجي الانبعاثات (نانومتر) </td><td> 535 ± 17.5 </td><td> 600 ± 17.5 </td><td> 670 ± 17.5 </td><td> لا مرشح </td></tr><tr><td> زمن التعرض (ثانية)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> توقف و- </td><td> 4.0 </td><td> 4.0 </td><td> 2.5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> فوف (مم) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> المستوى البؤري (مم) </td><td> 27.5 </td><td> 27.5 </td><td> 12.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Binning (بكسل) </td><td> لا شيء </td><td> 2 × 2 </td><td> لا شيء </td><td> 8 × 8 </td></tr></tbody></table> الجدول 2: التصوير مواصفات مواصفات محطة بروكر التصوير للأحمر وأخضر مضان، والتصوير التلألؤ للنمو البكتيري السطح.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays at JoVE.com

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Video: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

مراقب على الحركة المعوية (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

التصوير والتحليل الآليان لتحديد كمية الماكروبينوسومات الموسومة بالفلورسنت

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

القياس الكمي للمنافسة بين البكتيريا باستخدام التصوير الفلوري أحادي الخلية

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

تصور الحركة البكتيرية بناء على تفاعل اللون

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...