יש לי המחברים אין לחשוף.

<ol>
	<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nature. 10, 63-73 (2009).</li><li>Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension+mounts:+mechanics+meets+morphogenesis+and+malignancy.">The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy.</a> Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).</li><li>Parekh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+modulation+of+invadopodia+across+a+wide+range+of+rigidities.">Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities.</a> Biophysical. 100, 573-582 (2011).</li><li>Jerrell, R. J., Parekh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+mediate+extracellular+matrix+degradation+by+invadopodia.">Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia.</a> Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7, e32572 (2012).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2014).</li><li>Haage, A., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+contractility+and+extracellular+matrix+stiffness+regulate+matrix+metalloproteinase+activity+in+pancreatic+cancer+cells.">Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells.</a> FASEB J. , (2014).</li><li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia:+specialized+cell+structures+for+cancer+invasion.">Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion.</a> Clinical &amp; experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).</li><li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia.">Invadopodia.</a> Curr Biol. 18, R362-364 (2008).</li><li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis.">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li><li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity.">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li><li>Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+breast+cancer+risk+prediction+model+for+women+undergoing+screening+mammography.">Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projecting+absolute+invasive+breast+cancer+risk+in+white+women+with+a+model+that+includes+mammographic+density.">Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).</li><li>Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tense+situation:+forcing+tumour+progression.">A tense situation: forcing tumour progression.</a> Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).</li><li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype,+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage.">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Rosel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+Rho/ROCK+signaling+in+sarcoma+cells+drives+invasion+and+increased+generation+of+protrusive+forces.">Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces.</a> Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).</li><li>Indra, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity.">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys Biol. 8, 015015 (2011).</li><li>Parekh, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+invasiveness+by+the+physical+extracellular+matrix+environment.">Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment.</a> Cell adhesion &amp; migration. 3, 288-292 (2009).</li><li>Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).</li><li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues:+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples).">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples).</a> Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).</li><li>Wang, J. H., Lin, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+traction+force+and+measurement+methods.">Cell traction force and measurement methods.</a> Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).</li><li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method.">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).</li><li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+elasticity:+measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation.">Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+and+branching+of+PC12+cells+on+very+soft+substrates+sharply+decreases+below+a+threshold+of+substrate+rigidity.">Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity.</a> J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).</li><li>Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules,+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin.">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).</li></ol>

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס K25CA143412 (פארח). ברצוננו להכיר בכך שתמיכה נוספת סופקה על ידי המחלקה אף אוזן הגרון. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

אנו מציגים שיטה לבודת PaaS שיכול לשמש כבסיס למבחני invadopodia וכוח המתיחה לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות. בעוד PaaS כבר מזמן משמש להסתכל על השפעות נוקשות בתאים ולחשב כוחות המתיחה 18,24,27, פרוטוקול זה הוא ראשון לפתח מבחני מקבילים המבוססים על PaaS עם אותו הקשיחויות לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות בתגובה למטריצה תכונות מכאניות. כראוי הפעלת coverslips של המנות תחתית הזכוכית מבטיחה כי PaaS יהיה לאגד אותם ולא יורד. אמנם יש לנו ואחרים הסתמכו על חומרים כימיים כגון sulfo-SANPAH ואסתר NHS חומצה אקרילית להיקשר ג&#39;לטין אל פני השטח של PaaS ב4,12,28 האחרונים, מצאנו כי שיטות אלה לא לייצר שכבות משטח אחידות באופן מהימן של פיברונקטין . לכן, פיברונקטין היה משובץ וcrosslinked ברחבי PaaS באמצעות אסתר NHS חומצה אקרילית כפי שבוצעעל ידי קבוצות אחרות 29,30. עם זאת, ריכוזים הולכים וגדל של פיברונקטין נדרשו כדי להפיק את אותו הצפיפות ליגנד במשטחים של PaaS הרך, קשה, ונוקשה 5. בנוסף, שילוב של פיברונקטין (אך לא microspheres) הפחית את התכונות מכאניות של PaaS הרך, קשה, ונוקשה מ1,071, 9299, ו28283 4 אבא ל1,023, 7307, ואבא 22692 5, בהתאמה. עם זאת, ערכי moduli אלה מופחתים אלסטי עדיין הקיפו מגוון רחב של רקמות נורמליות וסרטניות 23. moduli האחסון של PaaS יכול בקלות להיות שנמדד על ידי rheometry והמיר לmoduli אלסטי 1,4. בעוד הפרוטוקול הוא ישר קדימה, הורדה והסרת 12 מ&quot;מ coverslips הם הצעדים הקשים ביותר ודורש אימון. האתגר הגדול ביותר בעת הורדת coverslip הוא להבטיח כי פתרון PAA מתפשט באופן שווה ללא כל בועות או התזות. הסרת coverslip מחייביד יציבה על מנת שלא לפגוע בcoverslip 12 מ&quot;מ, 14 מ&quot;מ הזכוכית תחתון coverslip, או PAA. יש לנו ניסינו ציפוי הידרופובי על coverslip 12 מ&quot;מ כדי לסייע בהסרה אך נמצא כי PaaS נשאר עם דפוסים בשטח שלהם. השימוש בטיפ נאה ופינצטה להורדה והסרת 12 מ&quot;מ coverslips הדק, בסגנון ההנעה, בהתאמה, מומלץ מאוד. בנוסף, כמות האור משמשת לתמונת התאים חייבים להיות ממוזערת מאז כמה סוגי תאים רגישים לאור המרוכז במיקרוסקופ. כמו כן, L-15 בינוניים שימש למבחני כוח המתיחה מאז קאמרי הסביבתית שלנו במיקרוסקופ שלנו אינו מצויד לCO 2. בעוד אותו התוספים שמשו בתקשורת למבחני invadopodia וכוח המתיחה בניסיון לשמור על תנאים זהים, יכולים לשמש DMEM וRPMI 1640 במקום L-15 אם ניתן לשלוט CO 2 רמות. בעוד שהיקף פתרון PAA נבחר באופן תיאורטי yג&#39;לי ield בעובי של 75 מיקרומטר, עובייהם להשתנות בדרך כלל בין 30-60 מיקרומטר. עם זאת, טווח זה הוא הרבה מעל הערך שבו תאים יכולים לחוש את הקשיחות הבסיסית של coverslips של מנות תחתית כוס 31. בנוסף, עובי שכבת ECM משמש לאיתור השפלה (ג&#39;לטין ופיברונקטין FITC שכותרתו מעולף על לPaaS) דווח ככ 1 מיקרומטר בעובי 12 בעבר; לכן, שכבה דקה זה לא להגן על התאים מהקשיחויות של PaaS. עם זאת, פסולת מוצקה, סדקים, ועיוותים אחרות באו PaaS ו / או שכבת ECM יכולים להשפיע על תכונות פולשניות והתכווצות סלולריות אישיות. יכולות להיגרם בעיות אלו על ידי coverslips 12 מ&quot;מ טמא שמציג את הפסולת לתוך הידרוג, ייבוש מוגזם של ג&#39;לים ו / או ג&#39;לטין, ושאיפה שלמה של borohydride נתרן שיכול להשאיר את הבועות שלעוות את שכבת ECM. לכן, יש להקפיד בעת בחירת ceLLS הדמיה כדי לוודא שהם אינם מושפעים יתר על המידה על ידי אי-סדרים מקומיים במשטחים של הדגימות. ריכוזים גבוהים יחסית של פיברונקטין בשני PaaS (מעורב ב200-230 מיקרוגרם / מיליליטר) ושכבת ECM (מעולף על ג&#39;לטין ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר) היה בשימוש; עם זאת, הריכוזים בפועל משני פני השטח לא היו למדוד באופן ישיר. למרות שכל פני השטח נראה שרוויים בפיברונקטין, לא ברור אם תאים לחוות את אותה צפיפות יגנד מדויקת בין שני מבחני. למבחני כוח המתיחה, 200 ננומטר microspheres בדילול של 1: 125 הוכיח אופטימלי להדמיה. עם זאת, זה די נפוץ למצוא קבוצות אחרות באמצעות microspheres של קטרים ​​או דילולים שונים. במערכת זו, microspheres הקטן יותר מוצג תנועה בראונית בתוך PaaS, בעוד microspheres הגדול גרם לסדקים ועיוותים. תצפיות אלה הן ככל הנראה בשל התכונות הפיסיקליות של PaaS (כלומר </eמ &#39;&gt;, גודל נקבובית, מידת crosslinking, וכו&#39;), הנובע מהכמויות הספציפיות של acrylamide וBIS שהיו בשימוש. דילול microsphere מספק רזולוציה מצוינת להתקות מעקב בPaaS, במיוחד מאז תאים סרטניים מפעילים כוחות קטנים יחסית. לרזולוציה אופטית משופרת, במיוחד אם משתמש בmicrospheres הקטן עוד יותר, ניתן להשתמש ביעדי מים או טבילת שמן NA גבוהים. בסך הכל, רב של גורמים הניסיוניים אלה יכולים להיות מותאם על בסיס הדרישות של המשתמש כגון PaaS עם תכונות מכאניות שונות, תאי סרטן עם משתנה תכונות פולשניות והתכווצות, ומערכות מיקרוסקופיה עם יכולות הדמיה אחרות. היחס של acrylamide: BIS יכול להיות מגוון כדי לייצר PaaS עם moduli אלסטי דומה או שונה וcrosslinking 27. הרגישות של מבחני כוח המתיחה יכולה להיות מותאמת לחשבון לרמות כוח סלולארי שונות על ידי שינוי dilut הנוקשות ו / או microsphereיון. יכולה להיות גם שנבחרה fluorophores שונה לתיוג immunofluorescence ופיברונקטין מבוסס על מפרטי מיקרוסקופ. בעוד FITC עושה אקונומיקה, זה השפלה ECM קבלת בהירה למדי לזיהוי בקלות. עם זאת, הדמיה הקרינה של microspheres invadopodia וקטן בדרך כלל דורשת מטרות NA גבוהות לרזולוציה אופטימלית. בנוסף, ניתן לבצע שני מבחני על coverslips זכוכית בצלחות גם. עם זאת, כלים מזכוכית תחתונה הם הרבה יותר קלים להכין ולהשתמש בכל התהליך הניסיוני. בעתיד, שילוב מבחני אלה לאחד יאפשר להדמיה ישירה של שתי השפלה ECM ודור כוח סלולארי. עם זאת, כמה אתגרים טכניים תקומנה כוללים הדמיה חיה תא להתקות invadopodia וmicrobead, חשיפה מוגברת לאור סלולארי, הלבנה של פיברונקטין FITC, ואם כוחות המתיחה הם transduced לחלוטין דרך שכבת ECM שכותרתו fluorescently וצולבים למשטחי PAA . </p&gt;

הנוקשות של ECM גידולים הקשורים זוהתה כגורם משמעותי בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת התכווצות actomyosin 1-3. בעוד השפעה זו בעיקר הודגמה עם תאי סרטן השד, נמצאו נוקשות מטריצה ​​לשנות תכונות פולשנית של תאים שמקורם במגוון רחב של סוגי הסרטן 4-8 טוענים כי נוקשות גידול עשוי לשחק תפקיד בסוג אחר של סרטן. לחדור רקמות צולבות במהלך נדידה פולשנית, תאים סרטניים לנצל בליטות דבקים אקטין עשיר הידוע בשם invadopodia שלמקם proteinases להשפיל ECM 9 focally. Invadopodia נחשב לסימן היכר של תאים פולשניים והיה מעורב בפלישת תאי גידול וגרור 10,11. מחקרים קודמים הראו כי נוקשות מטריצה ​​יכולות לווסת מספרי invadopodia וקשורים השפלה ECM 4,12 באמצעות פעילות שרירן השני וחלבוני mechanosensitive 12. בהתחשב במתאם בין צפיפות גידול ותוקפנות סרטן 13,14, משתמע מתוצאות אלה מנגנון שבאמצעותו תאי הסרטן עשויים להגיב לרקמות גידול נוקשה לנהוג פלישה וגרורות דרך התכווצות actomyosin. בקשיחות ECM מבחנה ובצפיפות רקמת vivo הוכח לווסת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים 1,15-17. בעוד התכווצות actomyosin נראית חשוב בתהליך זה, סכסוך לימודים נוכחי, האם יכולת גרורתי מתואמת לעלתה או ירד כוחות התכווצות 6,18-20. יתר על כן, הוא נשאר לא ידוע אם כוחות אלה ישירות לתווך פעילות invadopodia 21. מצאנו לאחרונה כי כוחות התכווצות תאי הסרטן היו תלויים בנוקשות מטריצה ​​והיו חזוי של השפלה ECM על ידי invadopodia 5. תוצאות אלו מצביעות על כך שכוחות סלולריים עשויים לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות סרטן על ידי תיווך ac invadopodiativity בתגובה לתכונות מכאניות של מייקרו-הסביבה של הגידול. על מנת לתאם את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאים סרטניים 5, שינינו פרוטוקול ליצירת PaaS עם קשיחויות שונות ששימשו בעבר לחקירת פעילות invadopodia קשיחות תלויה 4,12,22. על ידי כימי crosslinking פיברונקטין פלזמה האנושי לאורך PaaS, יכול לשמש הידרוג שונה אלה כבסיס לשני invadopodia ומבחני כוח המתיחה על מנת להבטיח שתאים חוו את אותו הקשיחויות בשני הניסויים 5. במבחני invadopodia, פיברונקטין מספק תחום מחייב טבעי לג&#39;לטין לקשר ECM המעולף לPaaS לזהות הפחתת מטריצה. במבחני כוח המתיחה, פיברונקטין מספק ליגנד להידבקות סלולרית ישירה לאתר התקות microsphere המשמשות לחישוב כוחות מתיחה הסלולר. תוצאות שיטה זו במה שאנו קוראים רכים, קשים,וPaaS הנוקשה שחייבים מנות תחתית זכוכית ויש לי moduli אלסטי, E, של 1,023, 7307, והאבא 22692 5 שמשתרעים על פני מגוון רחב של תכונות מכאניות דיווחו לרקמות נורמליות וסרטניות 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic acid NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8060</td>
			<td>prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>can also use rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>prepare fresh 10% solution in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606</td>
			<td>use six drops to fill microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS (2%)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>RPI</td>
			<td>A30075</td>
			<td>make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9777</td>
			<td>pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>use to make acrylic acid NHS ester solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>E200</td>
			<td>dilute with ultrapure water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00639</td>
			<td>typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &#176;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (35 mm coverslips)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td>coverslips are uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>01909</td>
			<td>dilute with 1X PBS to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX-1565-1</td>
			<td>use to make 10X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-cortactin 4F11 antibody&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>05-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX-0720-1</td>
			<td>use to make 10X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23020</td>
			<td>use to make 10X PBS stock and borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td>dilute with ultrapure water to 0.1 N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Serum (low-protein serum)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355500</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros</td>
			<td>416785000</td>
			<td>typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (sterile)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>use for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium metaborate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0251</td>
			<td>use to make borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060</td>
			<td>typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &#176;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td>make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyacrylamide gels for invadopodia and traction force assays on cancer cells

רקמות גידול נוקשה היו מעורבות מאוד בויסות נדידת תאי הסרטן ופלישה. נדידה פולשנית דרך רקמות צולבות היא הקלה על ידי בליטות אקטין עשיר בשם invadopodia שproteolytically לבזות את המטריצה ​​תאית (ECM). פעילות Invadopodia הוכחה להיות תלוי בכוחות קשיחות ECM והתכווצות תאים סרטניים המצביעים על כך אותות קשיחות יכולים לווסת מבני subcellular אלה באמצעות התכווצות actomyosin. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג&#39;לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג&#39;לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. בעוד כמה וריאציות בין שני מבחני קיימות, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה ליצירת PaaS הבניתן להשתמש בשני מבחני והם בקלות להתאמה לצרכים הביולוגיים וטכניים הספציפיים של המשתמש.

בassay invadopodia, invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של סמנים כמו אקטין וcortactin במבני punctate בתוך גוף התא (איור 1). שני invadopodia פעיל המשפיל ולא משפיל ניתן לספור ונבדלים באם מבנים אלה colocalized עם אזורים שחורים חסרי אות ניאון בפיברונקטין FITC שכותרתו (איור 1). Invadopodia נספרים באופן ידני, והשפלה ECM לכל תא נקבעה על ידי thresholding ידני האזורים השחורים האלה בתוך קווי המתאר של התאים. בassay כוח המתיחה, ארבע תמונות שנתפסו בכל מקום סלולארי מתאפיין בעמדת שלב (איור 2). ראשון, &quot;שלב&quot; ו- &quot;הדגיש&quot; תמונות שצולמו של כל התאים של עניין. תמונה &quot;תחתונה&quot; של PAA נלקחה גם בכל עמדה על מנת לחשב עובי הידרוג&#39;ל. לאחר הסרת tהוא תאים, תמונה &quot;null&quot; נלקחת במיקום כל שלב מסומן. עיוותים בPaaS מחושבים על בסיס השינוי בעמדות microsphere בין &quot;הדגיש&quot; ותמונות &quot;null&quot;. התקות אלה ואת התכונות מכאניות של PaaS (E ומקדם פואסון להניח כ0.5) משמשים לאחר מכן לחישוב כוחות מתיחה (איור 2). כמה שיטות שונות קיימות לחישוב כוחות המתיחה 24 המבוססים על כמה גיבוש פתרון Boussinesq למחצית שטח אלסטיות אינסופי 25. בעוד הפרטים של ניתוחים אלה הם מעבר להיקף של הטקסט הזה, יש לנו רישיון תוכנת LIBTRC ממיכה דמבו באוניברסיטת בוסטון שמשתמש בשיטה שתוארה לעיל לחישוב כוחות המתיחה 26. שיטה חישובית מסוימת זה מפצה על עובי סופי בחישוביה המחייב את העובי של PaaS בכל עמדה שמחושב על בסיס difference בz-העמדה ותמונות &quot;, הדגישו&quot; &quot;מלמטה&quot;. יש קבוצות מחקר רבות חבילות מחשב דומות זמינות או בוחרות לכתוב תוכניות משלהם. בנוסף, קיימות שיטות אחרות לחישוב כוחות מתיחה המבוססים על גישות מתמטיות שונות 24. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52343/52343fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1: assay invadopodia יכול לשמש כדי לזהות invadopodia והשפלה ECM הקשורים תמונות הקרינה רחב בתחום דוגמא invadopodia בתא SCC-61 (ראש וקרצינומה של תאי קשקש צוואר) על PAA קשה עם ג&#39;לטין 1% וFITC-. פיברונקטין שכותרת. Invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של שני סמנים כגון אקטין וcortactin (אדום וכחול בתמונה השכבה, בהתאמה). Invadopodia ניתן נרשמת כשני פעילים המשפילים (colocalized עם אזורים שחורים מחוסרing אות FITC ככונתה על ידי חצים צהובים) ולא משפיל (כונה על ידי חצים לבנים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52343/52343fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52343/52343fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2: assay כוח המתיחה יכול לשמש כדי לקבוע כוחות מתיחה סלולריים שנוצרו על ידי cytoskeleton אקטין על ידי מעקב העקירה של microspheres המשובץ בתמונות שלב וקרינה רחב בתחום PaaS דוגמא של תא SCC-61 על PAA קשה (. &quot;שלב&quot;), וmicrospheres ישירות מתחת לתא במשטח העליון של PAA (&quot;הדגיש&quot;). יכולה גם לקחת תמונה של החלק התחתון של PAA מאוחר יותר לחישוב העובי המקומי שלה (&quot;מלמטה&quot;). לאחר התא מוסר, תמונה נלקחה שוב של microsphereים במשטח העליון של PAA (&quot;ריק&quot;). עמדות Microsphere בין &quot;הדגישו&quot; וניתן לעקוב תמונות &quot;null&quot; להניב &quot;שדה עקירה.&quot; התקות Microsphere ותכונות מכאניות PAA לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב &quot;שדה כיוון מתיחה.&quot; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52343/52343fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells at JoVE.com

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג&#39;לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

12.0K Views.  Vanderbilt University Medical Center.  קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תא...

Video: Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Stereotactic Radiosurgery for Gynecologic Cancer

Stereotactic body radiotherapy (SBRT) distinguishes itself by necessitating more rigid patient immobilization, accounting for respiratory motion, intricate treatment planning, on-board imaging, and reduced number of ablative radiation doses to cancer targets usually refractory to chemotherapy and conventional radiation. Steep SBRT radiation dose drop-off permits narrow 'pencil beam' treatment fields to be used for ablative radiation treatment condensed into 1 to 3 treatments.
Treating physicians must appreciate that SBRT comes at a bigger danger of normal tissue injury and chance of geographic tumor miss. Both must be tackled by immobilization of cancer targets and by high-precision treatment delivery. Cancer target immobilization has been achieved through use of indexed customized Styrofoam casts, evacuated bean bags, or body-fix molds with patient-independent abdominal compression.1-3 Intrafraction motion of cancer targets due to breathing now can be reduced by patient-responsive breath hold techniques,4 patient mouthpiece active breathing coordination,5 respiration-correlated computed tomography,6 or image-guided tracking of fiducials implanted within and around a moving tumor.7-9 The Cyberknife system (Accuray [Sunnyvale, CA]) utilizes a radiation linear accelerator mounted on a industrial robotic arm that accurately follows patient respiratory motion by a camera-tracked set of light-emitting diodes (LED) impregnated on a vest fitted to a patient.10 Substantial reductions in radiation therapy margins can be achieved by motion tracking, ultimately rendering a smaller planning target volumes that are irradiated with submillimeter accuracy.11-13
Cancer targets treated by SBRT are irradiated by converging, tightly collimated beams. Resultant radiation dose to cancer target volume histograms have a more pronounced radiation "shoulder" indicating high percentage target coverage and a small high-dose radiation "tail." Thus, increased target conformality comes at the expense of decreased dose uniformity in the SBRT cancer target. This may have implications for both subsequent tumor control in the SBRT target and normal tissue tolerance of organs at-risk. Due to the sharp dose falloff in SBRT, the possibility of occult disease escaping ablative radiation dose occurs when cancer targets are not fully recognized and inadequate SBRT dose margins are applied. Clinical target volume (CTV) expansion by 0.5 cm, resulting in a larger planning target volume (PTV), is associated with increased target control without undue normal tissue injury.7,8 Further reduction in the probability of geographic miss may be achieved by incorporation of 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG) positron emission tomography (PET).8 Use of 18F-FDG PET/CT in SBRT treatment planning is only the beginning of attempts to discover new imaging target molecular signatures for gynecologic cancers.

Stereotactic body radiotherapy (SBRT) involves image-guided, ablative radiation delivered to cancer targets refractory to chemotherapy or to conventional radiation treatment. The robotic-armed Cyberknife SBRT system, using sophisticated target localization, delivers hypofractionated radiation doses capable of sterilizing cancer targets. This article will consider new therapeutic roles of SBRT for gynecological cancers.

Stereotactic Radiosurgery עבור גניקולוגיות סרטן

Stereotactic body radiotherapy (SBRT) distinguishes itself by necessitating more rigid patient immobilization, accounting for respiratory motion, ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.