Name: polyacrylamide gels for invadopodia and traction force assays on cancer cells
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
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1. Herstellung der Glasdeckgläser für PAAs <ol><li> Reinigen 12 mm Deckgläser mit fusselarm Tücher. </li><li> Flamme die 12 mm Deckgläser und der 14 mm Deckglas in der Mikrowell jedes 35 mm Glasbodenschale, indem sie durch einen Bunsenbrenner mit einer Pinzette. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 200 ul 0,1 N NaOH für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Absaugen und Luft trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen, die mit 50 bis 100 &amp; mgr; l 3-Aminopropyltrimethoxysilan für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug. Diese Chemikalie reagiert mit Kunststoff; daher verwenden Glaspipetten und nicht die Vertiefungen füllen vollständig den Kontakt mit der Schale aus Kunststoff zu vermeiden. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen, die mit hochreinem Wasser für etwa 10 Minuten, bis der 3-Aminopropyltrimethoxysilan deutlich. </li><li> Spülen Sie die Vertiefungen, die mit hochreinem Wasser zweimal mit einer Spritzflasche. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml Reinstwasser eint Raumtemperatur auf einem Schüttler bei einer mittleren Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 10 Minuten gesetzt. </li><li> Absaugen und Luft trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten. </li><li> Behandeln die Vertiefungen mit 2 ml 0,5% ige Glutaraldehyd-Lösung bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei einer mittleren Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 30 Minuten gesetzt. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml hochreinem Wasser bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 10 Minuten eingestellt. Wiederholen zwei weitere Male für insgesamt 30 min. </li><li> Trocken Vertiefungen in einem steilen Winkel (60º oder mehr) für 30 min. Hinweis: Geschirr kann für 2 Monate in einem Exsikkator aufbewahrt werden. </li></ol> 2. Herstellung von PAA für Invadopodia Assays <ol><li> Für eine 1-ml-Lösung des weichen PAA (8% Acrylamid und 0,05% BIS), vereinige 200 ul 40% Acrylamid, 25 ul 2% BIS, und 574 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung von der Fest PAA (8% Acrylamid und 0,35% BIS), vereinige 200 ul 40% iges Acrylamid, 175 &amp; #181; l von 2% BIS, und 409 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung des starren PAA (12% Acrylamid und 0,60% BIS), vereinige 300 ul 40% iges Acrylamid, 300 ul 2% BIS, und 169 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1). </li><li> Entgasen Sie die Lösungen für 15 Minuten. Geben Sie 200, 215, und 230 ul 1 mg / ml Humanplasmafibronektin in ultrareinem Wasser zu den weichen, harten und starren PAA-Lösungen auf. Bei allen Lösungen, fügen 1 ul 10 mg / ml Acrylsäure-N-Hydroxysuccinimid (NHS) -Ester, 5 ul einer 100 mg / ml Ammoniumpersulfat und 2 ul N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TEMED ; Tabelle 1). Mischen Sie mit sanften Pipettieren und vermeiden, Blasen in Lösungen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% (Ul) </td><td> Ultrapure Wasser (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Elastisch Modul (Pa) </td></tr><tr><td> Weich </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Schwer </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Starr </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22.692 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Bestandteil volumes und resultierende Elastizitätsmoduli für weiche, harte und starre PAAs im invadopodia Assays verwendet. AA = Acrylamid, FN = Fibronectin, APS = Ammoniumpersulfat. <ol start="5"><li> Pipettieren Sie 8,48 ul des PAA-Lösung auf dem Zentrum von jeder Vertiefung. Hinweis: Dieses Volumen theoretisch ergibt eine PAA von 75 um in der Dicke. </li><li> Senken Sie den geflammten Seite der 12 mm Deckglas auf die Tröpfchen im Mikrotiterplatten mit einer Pinzette. </li><li> Zulassen des sandwich PAA Lösung für 15-30 min zu polymerisieren. Stellen Sie sicher, Polymerisation, indem Sie das übrig gebliebene Lösung. </li><li> 2 ml 1x PBS zu jeder Schale und entfernen Sie die 12 mm Deckgläser mit einer Pinzette. Anmerkung: 10x PBS wird im Labor hergestellt und 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M NaCl und 0,056 M Na 2 HPO 4 zusammensetzt. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li></ol> 3. PReparatur von PAA für Traction Force-Assays <ol><li> Für eine 1-ml-Lösung des weichen PAA (8% Acrylamid und 0,05% BIS), vereinige 200 ul 40% Acrylamid, 25 ul 2% BIS, und 566 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung von der Fest PAA (8% Acrylamid und 0,35% BIS), vereinige 200 ul 40% iges Acrylamid, 175 ul 2% BIS, und 401 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung des starren PAA (12% Acrylamid und 0,60% BIS), vereinige 300 ul 40% iges Acrylamid, 300 ul 2% BIS, und 161 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2). </li><li> Entgasen Sie die Lösungen für 15 Minuten. Nach Zugabe von 200, 215, und 230 ul 1 mg / ml menschliches Plasma-Fibronektin zu den weichen, harten und starren PES-Lösungen sind. Mit Ultraschall 8 ul von 200 nm rot fluoreszierende Mikrosphären (Anregung / Emission von 580/605 nm) für 30 Sekunden. Für jede Lösung werden 8 ul von 200 nm rot fluoreszierende Mikrosphären,1 ul 10 mg / ml Acrylsäure-NHS-Ester, 5 ul einer 100 mg / ml Ammoniumpersulfat und 2 ul TEMED (Tabelle 2). Mischen Sie mit sanften Pipettieren und vermeiden, Blasen in Lösungen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% BIS (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapure Wasser (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td> Mikrosphären (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Elastisch Modul (Pa) </td></tr><tr><td> Weich </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Schwer </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Starr </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22.692 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Ingredient und resultierend Elastizitätsmoduli für weiche, harte und starre PAAs der Zugkraft Assays verwendet AA = Acrylamid, FN = Fibronectin, APS = Ammoniumpersulfat. <ol start="5"><li> Pipettieren Sie 8,48 ul des PAA-Lösung auf dem Zentrum von jeder Vertiefung. Hinweis: Dieses Volumen theoretisch ergibt eine PAA von 75 um in der Dicke. </li><li> Senken Sie den geflammten Seite th GentlyE 12 mm Deckglas auf die Tröpfchen im Mikrowell mit einer Pinzette. </li><li> Zulassen des sandwich PAA Lösung für 15-30 min zu polymerisieren. Stellen Sie sicher, Polymerisation, indem übriggebliebene Lösung. </li><li> 2 ml 1x PBS zu jeder Schale und entfernen Sie die 12 mm Deckgläser mit einer Pinzette. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li></ol> 4. Herstellung von ECM für Invadopodia Assays <ol><li> Erhitze das Gelatine-Lösung (1% Gelatine und 1% Saccharose) auf 37 ° C. </li><li> Behandeln Sie die PAA mit 150 ul der Gelatine-Lösung für 1 min vorsichtig absaugen vom Boden der Mikrovertiefungen beim Halten der Glasboden Gerichte zu einem Winkel von 45 °. </li><li> Man trocknet die verbleibende dünne Gelatineschicht auf die PAA in die Vertiefungen in einem steilen Winkel (60 ° oder mehr), um das Trocknen für 60 min zu optimieren. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer gekühlten 0,5% Glutaraldehyd-Lösung auf ice für 15 Minuten, gefolgt von Raumtemperatur für 30 min. </li><li> 5 min Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer 1 × PBS. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer Natriumborhydrid-Lösung für 1 min. Klopfen Sie leicht Gerichte auf der Bank, um Blasen, die an der Oberfläche der Gelatine bilden zu entfernen. </li><li> Aspirieren und waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer 1 × PBS für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Verdünne eines FITC-markierten Humanplasmafibronektin Lösung auf 50 ug / ml mit einer 1 × PBS und Zentrifugation bei 175.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Entweder kaufen kommerziell erhältlichen markierten Fibronektin oder beschriften Sie sie wie folgt: <ol><li> Man löst 5 mg Fibronektin werden in 10 ml Boratpuffer (170 mM Natriummetaborattetrahydrat und 40 mM NaCl) und in einen Dialyseschlauch. </li><li> Etikett der Fibronektin durch das Schlauchsystem in 200 ml Boratpuffer, enthaltend 6 mg gelöstes FITC bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührerbei der niedrigsten Einstellung 1,5 Stunden in der Dunkelheit eingestellt. </li><li> Dialyse mit 500 ml einer 1 × PBS auf einem Magnetrührer bei der niedrigsten Einstellung für 3 Tage in einem dunklen kalten Raum (4 ° C) mit zwei Lautstärke ändert sich täglich. </li><li> Berechnen FITC-markiertem Fibronektin-Konzentration basierend auf der optischen Dichte des verdünnten Aliquots (1: 200) bei 280 nm und 493 nm als [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4-fache der Verdünnungsfaktor von 200 mal 2 (welche Konten für die Glycerin Konzentrieren des Fibronektin im nächsten Schritt), wodurch mg / ml-Einheiten. </li><li> Dialyse über Nacht in einer 50% Glycerin-Lösung auf einem Magnetrührer bei der niedrigsten Einstellung über Nacht in einer dunklen kalten Raum bei 4 ° C eingestellt.) </li></ol></li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 150 ul des FITC-markiertem Fibronektin-Lösung bei Raumtemperatur für 60 min im Dunkeln. </li><li> Sorgfältig absaugen FITC-markiertem Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Mikrovertiefungen beim Halten der Glasboden Gerichteein Winkel von 45 ° und dann füllen die Glasbodenschalen mit 70% Ethanol-Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer dunklen Zelle Kultur Haube für die Sterilisierung. Außerdem füllen Glasbodenschale Deckel oder wischen Sie mit fusselarm Tücher in 70% Ethanol eingeweicht. </li><li> Waschen Glasbodenschalen, indem sie mit 1x PBS für 5 min. Wiederholen noch zweimal mit 2 ml 1x PBS für insgesamt 15 min. </li></ol> 5. Vorbereitung und Imaging von Invadopodia Assays <ol><li> Hinzufügen 25.000 Krebszellen in 2 ml invadopodia Medium (1: 1 DMEM und RPMI 1640 mit 5% proteinarme Serum, 10% fetales Rinderserum und 20 ng / ml frisch zugegeben epidermaler Wachstumsfaktor), um die Glasboden Geschirr und beimpft und über Nacht. </li><li> Absaugen und behandeln die Vertiefungen, die mit 2 ml einer 3,7% Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 Minuten, um die Zellen zu fixieren. </li><li> Nach zwei schnellen Waschungen mit 2 ml 1x PBS, behandeln die Vertiefungen, die mit 2 ml einer 0,1% Triton X-100-Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 5 min, um die Zellen zu permeabilisieren. </li><li> Nach einem Schnellwäsche mit 2 ml 1x PBS, behandeln die Vertiefungen, die mit 3% Rinderserumalbumin blockiert Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 Minuten, um die Zellen zu blockieren. </li><li> In Blockierungslösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 min: die Vertiefungen mit 150 ul Maus-Anti-Cortactin Antikörper (750 1) zu inkubieren. </li><li> Mit 2 ml 1x PBS 5 min waschen Vertiefungen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Inkubieren der Vertiefungen mit 150 ul Ziegen-Anti-Maus-633-Antikörper (1: 500) und 546 Phalloidin (1: 750) in der Blockierungslösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 min. </li><li> Mit 2 ml 1x PBS 5 min waschen Vertiefungen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Fügen Sie sechs Tropfen Eindeckmedium zu jeder Vertiefung zu füllen und decken mit 22 x 22 Deckgläser. </li><li> Bild Cortactin und Aktin zu invadopodia identifizieren mit Anregungs- und Emissionsfilter von 632/647 nm und556/570 nm, mit einem hohen NA, 40X Ölimmersionslinse auf einem Weitwinkel-inversen Mikroskop. Ebenso Bild Fibronektin zu ECM Abbau identifizieren mit einer Anregungs- und Emissionsfilter von 492/518 nm. </li></ol> 6. Vorbereitung und Imaging von Traction Force-Assays <ol><li> In 15.000 Krebszellen in 2 ml invadopodia Medium zu den Glasboden Speisen und Inkubation über Nacht. </li><li> Absaugen Medium in den Glasboden Speisen und ersetzen mit 2 ml L-15-Medium, mit den gleichen Ergänzungsmittel (5% Low-Protein-Serum, das 10% fötales Rinderserum und 20 ng / ml frisch hinzugefügt epidermaler Wachstumsfaktor), vorge -warmed bis 37 ° C. </li><li> Die Glasbodenschalen in einer Umgebungskammer inkubieren auf einem umgekehrten Mikroskop auf 37ºC voräquilibriert mit hoher Luftfeuchtigkeit für 1 Stunde. </li><li> Nehmen Sie vier Sätze von Bildern mit einem hohen NA, 40X-Objektiv auf einem Weitwinkel-inverses Mikroskop mit einem automatisierten Bühne, um zelluläre Positionen zu markieren: <ol><li> Bildzellen aufp der PAA mit Phasenkontrast (&quot;Phase&quot; Bild). </li><li> Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen mit Anregungs- und Emissionsfiltern von 560/645 nm durch Fokussieren leicht unter den Zellen, bis die erste Schicht aus Mikrosphären an der Oberseite der PAAs scharf eingestellt ist (&quot;gestresst&quot; image). </li><li> Außerdem konzentrieren sich auf den Boden der PAAs (unter Verwendung der Mikrokugeln als Marker), und nehmen ein Bild (&quot;bottom&quot; image). Anmerkung: Der Zweck dieses Bild wird auf den z-Position, um den tatsächlichen PAA Dicke an jeder Position für Zugkraft Berechnungen wie im Repräsentative Ergebnisse beschrieben erhalten aufzuzeichnen. </li><li> Nachdem diese Bilder an mehreren Positionen erworben worden, vorsichtig mischen in 220 ul 10% Triton-X-Lösung zur Entfernung der Zellen. Bildmikrokugeln an der Oberseite des PAA an jeder Position, wie zuvor beschrieben (&quot;null&quot; image). </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules,+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin.">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).</li></ol>

Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl K25CA143412 (Parekh) unterstützt. Wir möchten Sie erkennen an, dass zusätzliche Unterstützung wurde von der Abteilung für HNO-Heilkunde zur Verfügung gestellt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Wir stellen ein Verfahren zum Herstellen PAAs, die als Grundlage für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden kann, invasiv und kontraktilen zelluläre Verhalten korrelieren. Während PAAs seit langem verwendet, um an Steifigkeit Wirkungen auf Zellen und berechnet die Zugkräfte 18,24,27 ist dieses Protokoll das erste parallele Assays, die auf PAAs mit den gleichen Steifigkeiten zu entwickeln, die das Vordringen kontraktilen Zellverhalten in Reaktion auf Matrix korrelieren mechanische Eigenschaften. ...

Die Steifigkeit des Tumor-assoziierten ECM wurde als wichtiger Faktor bei der Fahrt malignem Verhalten durch Erhöhung Actomyosin Kontraktilität 1-3 identifiziert. Obwohl dieser Effekt hauptsächlich bei Brustkrebszellen gezeigt hat Matrixsteifigkeit wurde gefunden invasiven Eigenschaften von Zellen, die aus einer Vielzahl von Krebs 4-8 darauf hindeutet, dass Tumor Steifigkeit kann in anderen Arten von Krebs eine Rolle spielen abgeleitet verändern. Vernetzte Geweben während invasiver Migration dringen, Krebszellen zu verwenden Aktin reiche Klebstoff Vorsprünge als invadopodia die Proteinasen zu lokalisieren, um die ECM 9 fokal verschlechtern bekannt. Invadopodia werden als ein Markenzeichen der invasiven Zellen und in Tumorzellinvasion und Metastasierung 10,11 in Verbindung gebracht. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Matrix Steifigkeit invadopodia Zahlen zu regulieren und die damit verbundenen Abbau ECM 4,12 durch Myosin II-Aktivität und mechanosensitive Proteine ​​12. Angesichts derKorrelation zwischen Tumordichte und Krebs Aggressivität 13,14 legen diese Ergebnisse einen Mechanismus, durch den Krebszellen um starre Tumorgeweben zu antworten Invasion und Metastasierung durch Actomyosin Kontraktilität fahren. In vitro ECM Steifigkeit und in vivo Gewebedichte wurde gezeigt, dass invasive Verhalten von Krebszellen 1,15-17 regulieren. Während Actomyosin Kontraktilität scheint wichtig zu sein in diesem Prozess, aktuelle Studien Konflikt, ob metastasiertem Fähigkeit korreliert erhöht oder verringert Kontraktionskräfte 6,18-20. Darüber hinaus bleibt es unbekannt, ob diese Kräfte direkt vermitteln invadopodia Aktivität 21. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Krebszellen Kontraktionskräfte waren abhängig von Matrix Steifigkeit und waren prädiktiv für ECM Abbau durch invadopodia 5. Diese Ergebnisse legen nahe, dass zelluläre Kräfte können eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression durch Vermittlung invadopodia ac spielenvität als Reaktion auf die mechanischen Eigenschaften der Tumor-Mikroumgebung. Um invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen 5 korrelieren, modifizierten wir ein Protokoll für die Erstellung von PAA mit unterschiedlichen Steifigkeiten, die früher verwendet wurde, um die Steifigkeit abhängige invadopodia Aktivität 4,12,22 zu untersuchen. Durch chemisch vernetzenden Humanplasmafibronektin gesamten PAAs können diese modifizierten Hydrogele als Grundlage sowohl für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, um sicherzustellen, dass Zellen erfahren die gleichen Steifigkeiten in beiden Experimenten 5. In den invadopodia Tests bietet das Fibronektin eine natürliche Bindungsdomäne für Gelatine, die überlagerte ECM an die PAA verlinken auf Matrixabbau zu erkennen. In der Zugkraft Tests bietet das Fibronektin einen Liganden für direkte zelluläre Adhäsion an Mikrosphären Verschiebungen verwendet werden, um zelluläre Zugkräfte berechnen zu erkennen. Dieses Verfahren führt zu, was wir weich, hart genannt,und starre PAA, die auf Glasboden Gerichte gebunden sind und Elastizitätsmodul, E, der 1023, 7307 und 22.692 Pa 5, die den Bereich der mechanischen Eigenschaften für den normalen und Krebsgewebe 23 berichtet erstrecken.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic acid NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>can also use rhodamine</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>prepare fresh 10% solution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>use 6 drops to fill microwells</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>dialysis tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>use to make invadopodia medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>use to make acrylic acid NHS ester solution</td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td>use to make invadopodia medium</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>dilute with ultrapure water to 70%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>use to make invadopodia medium</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>protect from light</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &amp;deg;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes (35 mm coverslips)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>coverslips are uncoated</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>dilute with 1x PBS to 0.5%</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Human plasma fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>use to make 10x PBS stock</td></tr><tr><td>Mouse anti-cortactin 4F11 antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>use to make 10x PBS stock</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>use to make 10x PBS stock and borate buffer</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>dilute with ultrapure water to 0.1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (low-protein serum)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>use to make invadopodia medium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)</td></tr><tr><td>PBS (sterile)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>use for cell culture</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>use to make invadopodia medium</td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>Sodium metaborate tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>use to make borate buffer</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &amp;deg;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining</td></tr></tbody></table>

polyacrylamide gels for invadopodia and traction force assays on cancer cells

Starre Tumorgewebe sind stark bei der Regulierung der Krebszelle Migration und Invasion verwickelt. Invasive Migration durch vernetzte Gewebe durch actin reichen Vorsprünge genannt invadopodia die proteolytisch die extrazelluläre Matrix (ECM) abzubauen erleichtert. Invadopodia Aktivität hat sich gezeigt, abhängig von ECM Steifigkeit und Krebszellenkontraktionskräfte darauf hindeutet, dass die Steifigkeit Signale können diese subzellulärer Strukturen durch Actomyosin Kontraktilität zu regeln sein. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Während einige Unterschiede zwischen den beiden Tests bestehen, die hier vorgestellte Protokoll liefert ein Verfahren für die Erstellung PAAs thbei in beiden Tests verwendet werden und sind leicht an die spezifischen biologischen und technischen Anforderungen des Benutzers.

Im invadopodia Assay werden invadopodia typischerweise durch Colokalisierung von Markern wie Actin und Cortactin bei punktförmigen Strukturen innerhalb des Zellenkörpers (1) identifiziert. Sowohl aktiv abzubauen und nicht-abbau invadopodia kann gezählt werden und werden dadurch bestimmt, ob diese Strukturen mit schwarzen Bereichen fehlt Fluoreszenzsignal im FITC-markiertem Fibronektin (Figur 1) kolokalisiert differenziert. Invadopodia manuell gezählt und ECM-Abbau pro Zelle wird dur...

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Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

12.0K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center.  Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix. 

Serie: Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Forschung

Biotechnik

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Immunologie und Infektion

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Biologie

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...