Gli autori non hanno nulla da rivelare.

1. Preparazione di vetrini di vetro per PAA <ol><li> Pulire 12 millimetri coprioggetto con panni bassi lint. </li><li> Flame i coprioggetti 12 mm e il coprioggetto 14 millimetri nel micropozzetto di ogni piatto di vetro fondo 35 millimetri facendoli passare attraverso una fiamma becco Bunsen con una pinzetta. </li><li> Trattare i pozzetti con 200 ml di 0,1 N NaOH per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 50-100 ml di 3-amminopropiltrimetossisilano per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa. Questo prodotto chimico reagisce con plastica; quindi, utilizzare pipette di vetro e non riempire completamente i pozzetti per evitare il contatto con la plastica piatto. </li><li> Lavare i pozzetti con acqua ultrapura per circa 10 minuti fino a quando il 3 amminopropiltrimetossisilano diventa chiaro. </li><li> Sciacquare i pozzetti con acqua ultrapura due volte con una bottiglia a spruzzo. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di acqua ultrapura unt temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 10 min. </li><li> Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 2 ml di soluzione di glutaraldeide allo 0,5% a temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 30 min. </li><li> Lavare i micropozzetti con 2 ml di acqua ultrapura a temperatura ambiente su un bilanciere funzionante a velocità media (~ 1 Hz) per 10 min. Ripetere altre due volte per un totale di 30 min. </li><li> Pozzetti a secco con un angolo ripido (60 ° o superiore) per 30 minuti. Nota: I piatti possono essere conservati per 2 mesi in un essiccatore. </li></ol> 2. Preparazione del PAA per Invadopodi saggi <ol><li> Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 574 ml di acqua ultrapura (Tabella 1). </li><li> Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 e #181; l del 2% BIS, e 409 ml di acqua ultrapura (Tabella 1). </li><li> Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 169 ml di acqua ultrapura (Tabella 1). </li><li> Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano in acqua ultrapura alle molli, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Per tutte le soluzioni, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico N-idrossisuccinimmide (NHS) estere, 5 microlitri di 100 mg / ml, persolfato di ammonio e 2 ml di N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiammina (TEMED Tabella 1). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ml) </td><td> 2% (Ml) </td><td> Ultrapure Acqua (Ml) </td><td> 1 mg / ml FN (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ml) </td><td> TEMED (Ml) </td><td> Elastico Modulo (Pa) </td></tr><tr><td> Morbido </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Ingrediente voluMES e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test Invadopodi. AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio. <ol start="5"><li> Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto. Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore. </li><li> Abbassare delicatamente il lato fiammato del vetrino 12 mm appoggiata al droplet del micropozzetto con una pinzetta. </li><li> Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando la soluzione rimanente. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta. Nota: 10x PBS viene effettuata in laboratorio e composto da 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M di NaCl, e 0,056 M Na 2 HPO 4. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li></ol> 3. Priparazione del PAA per forza trazione saggi <ol><li> Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 566 ml di acqua ultrapura (Tabella 2). </li><li> Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 ml di 2% BIS, e 401 ml di acqua ultrapura (Tabella 2). </li><li> Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 161 ml di acqua ultrapura (Tabella 2). </li><li> Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano ai morbidi, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Sonicare 8 ml di 200 nm microsfere rosse fluorescenti (eccitazione / emissione di 580/605 nm) per 30 sec. Per ogni soluzione, aggiungere 8 ml di 200 microsfere fluorescenti rossi nm,1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico estere NHS, 5 microlitri di 100 mg / persolfato di ammonio ml e 2 microlitri di TEMED (Tabella 2). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ml) </td><td> 2% BIS (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapure Acqua (Ml) </td><td> 1 mg / ml FN (Ml) </td><td> Microsfere (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ml) </td><td> TEMED (Ml) </td><td> Elastico Modulo (Pa) </td></tr><tr><td> Morbido </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabella 2:. Volumi ingrediente e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test di forza di trazione AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio. <ol start="5"><li> Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto. Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore. </li><li> Abbassare delicatamente il lato fiammata di the 12 millimetri coprioggetto al droplet del micropozzetto con una pinzetta. </li><li> Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando soluzione rimanente. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li></ol> 4. Preparazione di ECM per Invadopodi saggi <ol><li> Riscaldare la soluzione di gelatina (1% gelatina e 1% di saccarosio) a 37 ° C. </li><li> Trattare le PAA con 150 microlitri della soluzione di gelatina per 1 min poi accuratamente aspirato dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro con un angolo di 45 °. </li><li> Essiccare il sottile strato residuo di gelatina sulle PAA ai pozzetti con un angolo ripido (60 ° o maggiore) per ottimizzare l&#39;essiccazione per 60 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di glutaraldeide allo 0,5% in refrigerate iCe per 15 minuti seguita da temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di boroidruro di sodio per 1 min. Battere delicatamente piatti sul banco per rimuovere le bolle che si formano sulla superficie della gelatina. </li><li> Aspirare e lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Diluire una soluzione fibronectina plasma umano marcato con FITC a 50 pg / ml con PBS 1x e centrifugare a 175.000 xg a 4 ° C per 15 min. O acquistare in commercio fibronectina etichettati o etichettarlo come segue: <ol><li> Disciogliere 5 mg di fibronectina in 10 ml di tampone borato (170 mM di sodio tetraidrato metaborato e 40 mM NaCl) e posto in tubi di dialisi. </li><li> Etichetta la fibronectina posizionando il tubo in 200 ml di tampone borato contenente 6 mg di FITC disciolto a temperatura ambiente su un agitatore magneticoimpostare al minimo per 1,5 ore al buio. </li><li> Dializzare con 500 ml di PBS 1x su un agitatore magnetico impostato al minimo per 3 giorni in una stanza buia fredda (4 ° C) con due volumi cambia un giorno. </li><li> Concentrazione fibronectina Calcolare FITC-marcato sulla base della densità ottica di aliquote diluito (1: 200) a 280 nm e 493 nm come [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 volte il fattore di diluizione di 200 volte 2 (che rappresenta per il glicerolo concentrare la fibronectina nel passaggio successivo) conseguente unità mg / ml. </li><li> Dializzare notte in una soluzione di glicerolo al 50% su un agitatore magnetico impostato al minimo durante la notte in una camera fredda buio a 4 ° C.) </li></ol></li><li> Trattare i pozzetti con 150 microlitri della soluzione di fibronectina FITC-marcato a temperatura ambiente per 60 minuti al buio. </li><li> Aspirare accuratamente la soluzione fibronectina coniugati con fluoresceina dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro aun angolo di 45 ° e quindi riempire il vetro piatti inferiori con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 10 min in una cappa di coltura cellulare scuro per la sterilizzazione. Anche riempire vetro fondo coperchi piatto o pulire con panni imbevuti lint bassi nel 70% di etanolo. </li><li> Lavare i piatti fondo di vetro da riempire con 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte con 2 ml di PBS 1x per un totale di 15 min. </li></ol> 5. Preparazione e Imaging di Invadopodi Assays <ol><li> Aggiungere 25.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi (1: 1 DMEM e RPMI 1640 con 5% di siero a basso contenuto proteico, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico) ai piatti fondo di vetro e incubare una notte. </li><li> Aspirare e trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di paraformaldeide 3,7% a temperatura ambiente al buio per 20 minuti per fissare le cellule. </li><li> Dopo due lavaggi rapidi con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 2 ml di Triton X-100 soluzione 0,1% a camera temperatura al buio per 5 min a permeabilize cellule. </li><li> Dopo un lavaggio rapido con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 3% di albumina sierica bovina soluzione bloccante a temperatura ambiente al buio per 60 minuti per bloccare le cellule. </li><li> Incubare le micropozzetti con 150 ml di anticorpo anti-topo cortactin (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min. </li><li> Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Incubare i pozzetti con 150 ml di capra anti-topo 633 anticorpi (1: 500) e 546 falloidina (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min. </li><li> Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Aggiungere sei gocce di mezzo di montaggio per riempire ogni micropozzetto e coprire con 22 x 22 lamelle. </li><li> Immagine cortactin e actina per identificare Invadopodi con eccitazione e di emissione filtri di 632/647 nm e556/570 nm, rispettivamente, con un obiettivo ad immersione in olio ad alta NA, 40X su un ampio campo di microscopio invertito. Analogamente, immagine fibronectina identificare degrado ECM utilizzando un filtro di eccitazione ed emissione di 492/518 nm. </li></ol> 6. Preparazione e Imaging di forza trazione Assays <ol><li> Aggiungere 15.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi ai piatti fondo di vetro e incubare durante la notte. </li><li> Aspirare media nei piatti fondo di vetro e sostituire con 2 ml di mezzo L-15, con le stesse integratori (siero ipoproteica 5%, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico), pre -warmed a 37 ° C. </li><li> Incubare i piatti inferiori vetro in una camera ambientale su un microscopio invertito pre-equilibrati a 37 ° C con umidità elevata per 1 ora. </li><li> Prendere quattro serie di immagini con un elevato NA, 40X obiettivo su un microscopio a grande campo invertito, con una fase automatizzata per marcare posizioni cellulari: <ol><li> Celle di immagine su dip dei PAA con contrasto di fase (immagine &quot;fase&quot;). </li><li> Microsfere fluorescenti immagine utilizzando filtri di eccitazione ed emissione di 560/645 nm concentrandosi leggermente sotto le celle fino al primo strato di microsfere nella parte superiore del PAA è a fuoco (immagine &quot;sottolineato&quot;). </li><li> In aggiunta, si concentrano al fondo del PAA (utilizzando le microsfere come marcatori) e prendere una immagine (un&#39;immagine &quot;bottom&quot;). Nota: Lo scopo di questa immagine è di registrare la z-posizione per ottenere lo spessore effettivo PAA in ciascuna posizione per i calcoli forza di trazione come descritto in Risultati rappresentativi. </li><li> Dopo queste immagini sono state acquisite a più posizioni, mescolare delicatamente in 220 ml di soluzione al 10% Triton-X per rimuovere le cellule. Microsfere fotografia in cima ZAP in ciascuna posizione come precedentemente descritto (immagine &quot;nullo&quot;). </li></ol></li></ol>

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health in premio Numero K25CA143412 (Parekh). Vorremmo riconoscere che un ulteriore sostegno è stato fornito dal Dipartimento di Otorinolaringoiatria. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Vi presentiamo un metodo per la fabbricazione di PAA che possono essere utilizzati come base per Invadopodi e forza di trazione saggi di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili. Mentre CPA sono stati a lungo utilizzati per osservare gli effetti sulle cellule rigidità e calcolare le forze di trazione 18,24,27, questo protocollo è il primo a sviluppare test paralleli basati su CPA con le stesse rigidità di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili in risposta alla matrice ...

La rigidità del ECM associati al tumore è stato identificato come un fattore significativo nel determinare comportamenti maligni aumentando actomiosina contrattilità 1-3. Anche se questo effetto è stato dimostrato soprattutto con le cellule del cancro al seno, la rigidità matrice è stato trovato per modificare le proprietà invasive di cellule derivate da una varietà di tumori 4-8 che suggeriscono che la rigidità del tumore può svolgere un ruolo in altri tipi di tumori. Per penetrare i tessuti reticolati durante la migrazione invasivo, le cellule tumorali utilizzano sporgenze adesive ricche di actina conosciuti come Invadopodi che localizzare proteasi a degradare focally ECM 9. Invadopodi sono considerati un segno distintivo di cellule invasive e sono stati implicati in invasione delle cellule tumorali e metastasi 10,11. Il lavoro precedente ha mostrato che la rigidità matrice può regolare numeri Invadopodi e associati ECM degrado 4,12 attraverso l&#39;attività miosina II e proteine ​​meccanosensibili 12. Dato checorrelazione tra la densità del tumore e cancro aggressività 13,14, questi risultati suggeriscono un meccanismo attraverso il quale le cellule tumorali possono rispondere ai tessuti tumorali rigidi guidare invasione e metastasi attraverso actomiosina contrattilità. In vitro rigidità ECM e nella densità del tessuto vivo hanno dimostrato di regolare il comportamento invasivo delle cellule tumorali 1,15-17. Mentre actomiosina contrattilità sembra essere importante in questo processo, gli studi in corso il conflitto come se la capacità metastatica è correlata ad un aumento o diminuzione forze contrattili 6,18-20. Inoltre, resta noto se queste forze mediare direttamente l&#39;attività Invadopodi 21. Abbiamo recentemente scoperto che le forze contrattili cellula tumorale dipendevano rigidità matrice ed erano predittivi di ECM degrado da Invadopodi 5. Questi risultati suggeriscono che le forze cellulari possono svolgere un ruolo importante nella progressione del cancro mediando Invadopodi actività in risposta alle proprietà meccaniche del microambiente tumorale. Al fine di correlare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali 5, abbiamo modificato un protocollo per la creazione di ZAP con differenti rigidità precedentemente utilizzati per studiare l&#39;attività Invadopodi rigidità-dipendente 4,12,22. Con reticolazione chimica fibronectina plasma umano durante ZAP, questi idrogel modificati possono essere utilizzate come base per entrambi Invadopodi e forza di trazione saggi per assicurare che le cellule sperimentato le stesse rigidità in entrambi gli esperimenti 5. Nei saggi Invadopodi, la fibronectina fornisce un dominio di legame naturale per la gelatina di collegare la ECM sovrapposto alla ZAP per rilevare degradazione della matrice. Nei saggi di forza di trazione, la fibronectina fornisce un ligando per adesione cellulare diretta per rilevare spostamenti microsfere utilizzate per calcolare le forze di trazione cellulari. Questo metodo comporta quello che abbiamo chiamato morbido, duro,e CPA rigidi che sono legati ai piatti fondo di vetro e hanno moduli elastici, E, di 1.023, 7.307, e 22.692 Pa 5 che abbracciano la gamma di proprietà meccaniche segnalate per i tessuti normali e tumorali 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic acid NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8060</td>
			<td>prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>can also use rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>prepare fresh 10% solution in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606</td>
			<td>use six drops to fill microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS (2%)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>RPI</td>
			<td>A30075</td>
			<td>make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9777</td>
			<td>pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>use to make acrylic acid NHS ester solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>E200</td>
			<td>dilute with ultrapure water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00639</td>
			<td>typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &#176;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (35 mm coverslips)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td>coverslips are uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>01909</td>
			<td>dilute with 1X PBS to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX-1565-1</td>
			<td>use to make 10X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-cortactin 4F11 antibody&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>05-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX-0720-1</td>
			<td>use to make 10X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23020</td>
			<td>use to make 10X PBS stock and borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td>dilute with ultrapure water to 0.1 N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Serum (low-protein serum)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355500</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros</td>
			<td>416785000</td>
			<td>typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (sterile)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>use for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium metaborate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0251</td>
			<td>use to make borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060</td>
			<td>typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &#176;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td>make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyacrylamide gels for invadopodia and traction force assays on cancer cells

Tessuti tumorali rigidi sono stati fortemente implicati nella regolazione della migrazione delle cellule del cancro e l&#39;invasione. Migrazione invasiva attraverso i tessuti reticolati è facilitato da sporgenze ricchi di actina chiamati Invadopodi che proteoliticamente degradano la matrice extracellulare (ECM). Attività Invadopodi ha dimostrato di essere dipendente da rigidità ECM e il cancro delle cellule contrattili forze che suggeriscono che i segnali di rigidità possono regolare queste strutture subcellulari attraverso actomiosina contrattilità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Mentre esistono delle differenze tra i due test, il protocollo qui presentata fornisce un metodo per la creazione di PAA thin può essere utilizzato in entrambi i test e sono facilmente adattabili alle esigenze biologiche e tecniche specifiche dell&#39;utente.

Nel saggio Invadopodi, Invadopodi sono in genere identificato da colocalizzazione di marcatori come actina e cortactin a strutture puntiformi all&#39;interno del corpo cellulare (Figura 1). Sia attivamente degradante e non degradanti Invadopodi può essere contato e si differenziano per se queste strutture sono colocalized con aree nere prive segnale fluorescente nella fibronectina coniugati con fluoresceina (Figura 1). Invadopodi vengono contati manualmente, e la degradazione ECM per c...

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Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l&#39;attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

11.9K Views.  Vanderbilt University Medical Center.  Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità. 