This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

זהירות: ניסויים כרוכים בשימוש של איזוטופ רדיואקטיבי 32 P ולא עבודה צריכה להתבצע עד שכל תנאי הבטיחות המתאימים מולאו. באופן כללי אנשים נדרשים להשתתף בקורס בטיחות ועוברים בפועל בפיקוח לפני ניסויים באמצעות ריאגנטים רדיואקטיבי. אנא בציוד מגן אישי (מד מינון thermoluminescent, משקפי מגן, כפפות, מעילים במעבדה חדר קרינה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים) בעת ביצוע התגובה. 1. הכנת חומרי Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הנדרש חלבונים עבור assay תמלול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך הניסוי המתואר כאן, overproduce ולטהר E. coli RNAP במעבדה כמתואר 11, או להשיג ממקור מסחרי (רשימת חומרים). הערה: שניהם מספקים תוצאות דומות. שיטות אחרות לטיהור RNAP שכותרתו יליד או זיקה יכולות לשמש גם 12,13. גורמי Sigma / נוסה ניתן להשיג גם דescribed בעבודה קודמת 14,15. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים הערה: לחילופין, RNase ללא מים ניתן להשיג ממקורות מסחריים (רשימת חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל diethyl pyrocarbonate (DEPC) עד 1 ליטר של מים מטוהרים (0.1% v / v) ומערבבים לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים וטיפים DEPC החיטוי פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תבנית ה- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פלסמיד pSG1154 16 ו / או pIA226 17 באמצעות ערכת טיהור פלסמיד (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את תבנית עבור מבחני שעתוק נגר (שבר 360 נ&quot;ב המקיף באזור P xyl האמרגן), להרכיב תגובת PCR על הקרח כולל 25 μl תערובת 2x PCR (חומרים רשימה), 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(קדימה) 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (הפוכה), 1 μl pr פלסמיד pSG1154eparation (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או לחלופין, עבור מבחני שעתוק סיבוב בודד, להגביר שבר 447 נ&quot;ב המקיף באזור האמרגן λ P R מ pIA226 17. הגדרת תגובת PCR על הקרח באמצעות 25 μl תערובת 2x PCR, 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(קדימה) 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (הפוכה), 1 μl pIA226 17 הכנה פלסמיד (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים). הערה: תבנית זו נעדרת ציטוזין עד לתפקיד +26 NT, המהווה את נוקלאוטיד -26 מאתר תחילת שעתוק. לכן, שעתוק באמצעות תבנית זו תאפשר ייזום, אישור אמרגן השתהות בבית +26 NT להקים קומפלקס התארכות שעתוק יציב (EC) כאשר ATP, UTP בלבד GTP נוכחי התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת PCR עם התנאים הבאים: 95 °; צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות, חוזרות במשך 30 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את המוצר באמצעות ערכת ניקוי PCR (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן ו elute חיץ שעתוק 100 μl עבור assay שעתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז ה- DNA תבנית באמצעות fluorospectrometer (רשימת חומרים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת NTP הערה: NTPs ניתן להשיג ממקורות מסחריים שונים (רשימת חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים NTPs (≥99% טהור) במים DEPC שטופלו לעשות 1 M מלאי, aliquot 1 מ&quot;ל של התמיסה לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל (50 μl בצינור אחד) ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol) לפני הניסוי. 32 P יש זמן מחצית חיים קצר של 14.29 ימים. הערה: UTP שימוש שכותרתו אלפא ימנע השוואת עוצמת להקות עם אורך שונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין סולם RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את המעקבing התגובה בטמפרטורת החדר: 0.5 מיקרוגרם Mix תבנית רנ&quot;א (רשימת חומרים), 80 pH7.5 חיץ HEPES מ&quot;מ, 12 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 מ&quot;מ DTT, 2 מ&quot;מ ATP / CTP / GTP, 0.5 מ&quot;מ UTP, 2 μl α- 32 P UTP, 0.5 μl RNAP T7 (רשימת חומרים), DEPC שטופלו מים עד 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובה להמשיך ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. הכנת RNA רצף ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הצלחות מן מנגנון ג&#39;ל רצף (רשימת חומרים) פעמים עם אתנול 70% ומים מטוהרים, ולהרכיב את התא עם מסרק ושני מפרידים. הערה: צלחת אחת יכולה להיות מצופים מגיב siliconizing (רשימת חומרים) כדי להקל על הסרת ג&#39;ל שלב 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אוריאה 33.6 גרם ב -22 מ&quot;ל מים 16.4 מ&quot;ל של 5x טריס / Borate / EDTA חיץ (TBE) (54 גרם טריס (hydroxymethyl) aminomethane; 27.5 גרם חומצת בור; 10 מ&quot;ל של 1 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 7.4 ב 1 מי L) באמצעות בוחש מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16 מ&quot;ל של 40% Acrylamide / bis-acrylamide פתרון (19: 1) לפתרון אוריאה ולסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 514 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום מוכן טרי במים ואחריו 51.4 μl N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethylethylenediamine (TEMED) לפתרון מסוננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך את הפתרון ג&#39;ל כדי למנוע אוורור יתר ולהזריק מייד בצורה חלקה לתוך התא רצף מראש ארז הממוקם אופקי מחור ההזרקה התחתון. תשמור על עצמך כדי להימנע בועות במהלך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר 1-1.5 שעות עד הג&#39;ל מוגדר לחלוטין לפני השימוש ב assay שעתוק. הג&#39;ל ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך יומיים או שלושה, כאשר עטוף רקמה מים רטוב על החלק העליון של התא רצף. </li></ol></li></ol> בתגובה שעתוק 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay השהיית תמלול התארכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינונה של קומפלקס התארכות שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של אנזים הליבה rnab (1 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) לצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של גורם סיגמא-70 מטוהרים (σ 70; 3 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) אל RNAP דגירה על קרח למשך 10 דקות כדי ליצור RNAP holoenzyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 תבנית ה- DNA מטוהרים μl 500 ננומטר (האמרגן R P λ מהמוצר pIA226 PCR) במאגר שעתוק אל holoenzyme RNAP לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור המתחם פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת של מרכיבי התגובה אחרת צינור 1.5 מ&quot;ל באמצעות 5 μl של חיץ שעתוק 10x (רשימת חומרים: 400 מ&quot;מ טריס- HCl, 1.6 KCl M, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM DTT, 50% גליצרול, pH 7.9 ב DEPC שטופלו מים), 2 μl של 250 מיקרומטר אחד GTP ו UTP, 1 μl של 1 מ&quot;מ ATP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC ל -41 μl. לאטה: מעכב RNase (רשימת חומרים) שניתן להשתמש בהם כדי למזער את זיהום RNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון תערובת הצינור המכיל המתחם הפתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי ליצור את מורכבות התארכות שעתוק עצר +26 NT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התגובה לטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) ולהוסיף 1 μl של 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ריפמפיצין לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 0.1 מ&quot;מ מטוהרים נוסה לתערובת התגובה דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 250 מיקרומטר CTP לתוך התערובת לתגובה ליצור נפח סופי של 50 μl ולמדוד את זמן התגובה באמצעות טיימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μl של פתרון התגובה לתוך 2 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) ב 30, 60, 120, 240, 480, ו -1,200 שניות כדי להרוות את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך 32 P UTP טיפים וצינורות בתוך המשך פסולת רדיואקטיביתainer. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמלול ייזום Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינונה של הקומפלקס להרחיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מטוהרים σ 70 כדי 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1.1 כדי 3.1.1.3 באמצעות 0.5 מיקרומטר (במקום 3 מיקרומטר) מטוהרים σ 70, ואת תבנית ה- DNA (באזור האמרגן P xyl ממוצר pSG1154 PCR). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכוב של assay ייזום שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מעכבי שנועדו למנוע היווצרות RNAP holoenzyme כדי אנזים הליבה RNAP לפני תוספת של σ 70 (אחרי 3.1.1.1 שלב), ואחריו צעדים 3.1.1.2 ו 3.1.1.3 לבחון האם מעכב הוא מסוגל לשבש holoenzyme היווצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לאחר שלב 3.1.1.2, להוסיף מעכב לבחון האם הוא מסוגל לעכב תחרותי σ 70 קשירה RNAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש באותה הכמות של DMSO, הממס של המעכב, במקום מעכב היםטוק בתגובות שליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלמת התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים הפרין במים לריכוז מלאי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו המניה ב -20 ° C. הערה: הפרין הוא מתחרה של ה- DNA שיכול לעקל RNAP שלא יצר מורכבות פתוחות. לאחר במתחם הפתוח נוצר, הפרין לא יכול להיכנס לאתר DNA המחייב של RNAP ומעכב שעתוק מתסביך פתוח מראש יצר. לכן, הפרין נדרש רק עבור מבחני יחיד עגול; זה אינו נחוץ עבור מבחנים רבים-עגולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת התגובה באמצעות 5 μl של 10x חיץ שעתוק (רשימת חומרים), 1 μl של 1 מ&quot;ג / פתרון הפרין מ&quot;ל, 1 μl של 10 מ&quot;מ כל ATP, GTP, ו CTP, 2.5 מ&quot;מ UTP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC 45 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את תערובת התגובה עם מורכבות שעתוק פתוחות, הספין הדופק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10 μl של תגובה כהlution לתוך 5 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) כדי להרוות את התגובה. </li></ol></li></ol></li></ol> ריצה ופיתוח 4. RNA ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצת ג&#39;ל denaturing polyacrylamide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 50 מעלות צלזיוס ו -50 W במאגר 1x TBE כ 1.5 שעות עד לטמפרטורה של ג&#39;ל למאגר יציב ב -50 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם דגימות ב 90 ºC למשך 30 שניות ולהעביר אותם על טעינה לפני קרח על הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען לתוך הבורות העליון של ג&#39;ל לצד נתיב אחד המכיל 2 סולם RNA μl (1: 100 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 50 וואט ו -50 ºC במאגר 1x TBE עד לצבוע בכחול bromophenol מגיע ~ 2/3 למטה הג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל הטיפולי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב לאט ובזהירות להפריד את הצלחת העליונה מתא הרצף. להקדיש תשומת לב רבה כדי למנוע את שבירת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut chromatograpHY נייר (רשימת חומרים) כדי להתאים את גודל ג&#39;ל מלמעלה צבע כחול bromophenol. השתמש מונה גייגר כדי לאשר את המיקום המשוער של תעתיקי רנ&quot;א שכותרתו רדיואקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את הג&#39;ל עם נייר הסינון, ולחץ בחוזקה עד הג&#39;ל שומר על נייר הסינון. חותכים וזורקים את החלק התחתון של הג&#39;ל פסולת רדיואקטיבית כמו NTPs מאוגדים עד לבסיסו של ג&#39;ל, אשר יכול להיות חם מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח פיסה בגודל דומה של נייר סינון על מיטת הייבוש של מכונת ואקום ייבוש, ובזהירות להניח את הנייר מצופה-ג&#39;ל על זה עם הצד ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את ג&#39;ל עם בניילון יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים את הצד השני של נייר הסינון מצופה ג&#39;ל בניילון נצמד, ומניחים על צלחת זרחן photostimulable במקרה הדמיה, עם זמן חשיפה מתאימה, אשר יכול לנוע בין 1 hr לילה תלוי יעילות התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת צלחת זרחן באמצעותסורק תרמי על פי הוראות היצרן. לקבוע את עוצמת הלהקה יחסית באמצעות תוכנת ImageJ פי הוראות התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר לבדוק את זיהום רדיואקטיבי באזור העבודה, לנגב את הפריטים החשודים ואזור עם רקמות חומר ניקוי ולהיפטר הרקמה בתוך המיכל לרשות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+by+RNA+polymerase:+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation.">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li><li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does.">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li><li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA:+the+basic+mechanisms.">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li><li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase.">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li><li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA.">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li><li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination.">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li><li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+at+the+core:+Similarities+among+bacterial,+archaeal,+and+eukaryotic+RNA+polymerases.">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li><li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase?.">Is it easy to stop RNA polymerase?.</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li><li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development.">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li><li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li><li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase.">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li><li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions.">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design:+From+in+silico+screening+to+validation.">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li><li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex.">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li><li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis.">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li><li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals.">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li><li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+&#197;+resolution.">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 &#197; resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li><li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp.">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li><li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes.">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li><li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation.">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בכל היצורים, שעתוק הוא תהליך מוסדר בחוזקה. מבחני שעתוק במבחנה פותחו כדי לספק פלטפורמה לבדיקת ההשפעות של גורמי שעתוק, מולקולות קטנות ומעכבי שעתוק. במאמר בשיטה זו, assay שעתוק חיידקים כללי תוארה. מבחני תמלול בשילוב עם ג&#39;ל אלקטרופורזה רצף של תמלילים חשובים מאוד...

תמלול הוא התהליך שבו RNA מסונתז מתבנית DNA ספציפית. בתאים איקריוטיים ישנם שלושה RNAPs ברורים: RNAP שאני מעתיק מבשרי rRNA, RNAP השנייה אחראי לסינתזה של mRNA ו RNAs הגרעיני הקטן מסוים, ואת הסינתזה של 5S rRNA ו tRNA מבוצעת על ידי RNAP III. אצל חיידקים, יש רק אחד RNAP אחראי שעתוק של כל סוגי RNA. ישנם שלושה שלבים של שעתוק: ייזום, התארכות והפסקה. תמלול הוא אחד התהליכים המוסדרים הגבוה ביותר בתא. כל שלב במחזור שעתוק מייצג מחסום להסדרת ביטוי גנים 1. לקבלת החניכה, RNAP יש לשייך גורם סיגמא לגבש holoenzyme, אשר נדרש לכוון את האנזים לאתרים ספציפיים בשם היזמים 2 כדי ליצור תסביך האמרגן פתוח. בהמשך לכך, חבילה גדולה של גורמי שעתוק האחראים o תקנהf RNAP פעילויות במהלך שלבי התארכות והפסקה. גורם השכפול נבחן כאן הוא החלבון השמור ביותר וחיוני, נוסה. הוא מעורב בויסות שהשהית שעתוק והפסקה, כמו גם סיום אנטי במהלך סינתזת rRNA 3-5. במבחנה מבחני שעתוק פותחו כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הצעדים הרגולטוריים מורכבים במהלך שעתוק 6. באופן כללי, שבר ליניארי של DNA כולל אזור האמרגן נדרש כתבנית עבור שעתוק. תבנית ה- DNA בדרך כלל מופק על ידי PCR או על ידי ליניאריזציה פלסמיד. חלבונים NTPs מטוהרים (כולל רדיואקטיבי אחד NTP למטרות זיהוי) מתווספים אז המוצר ניתח בעקבות התקופה הנדרשת של דגירה. שימוש בתבניות מתאימות ותנאי תגובה, בכל שלבי שעתוק נבחנו באמצעות גישה זו אשר אפשרה אפיון מולקולרי מפורט של transcription לעומת מחצית המאה הקודמת 7. בשילוב עם מידע על המבנה 3-הממדי של RNAP זה גם יכל לחקור את המנגנון המולקולרי של עיכוב שעתוק על ידי אנטיביוטיקה מובילה אנטיביוטי, ולהשתמש במידע זה בפיתוח תרופות חדשות, שיפור 8-10. בעבודה זו אנו מספקים דוגמאות לאופן מבחני שעתוק יכולים לשמש כדי לקבוע את מנגנון הוויסות ידי התארכות שעתוק / גרם סיום נוסה, ואיך את מנגנון הפעולה של עופרת מעכב ייזום שעתוק רומן ניתן לקבוע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Obtain the proteins required for transcription assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAP</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>S90250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of DEPC-treated water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard&#160;Plus&#160;SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACCUZYME Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-25028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>U1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G3776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Purity rNTPs</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-32P UTP&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;&#160;</td>
			<td>BLU007C001MC</td>
			<td>Radioactive compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ladder preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&#8211;1 kb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>69003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNAP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;&#160;</td>
			<td>165-3804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>SL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#697;&#8242;,N&#697;&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N",N"-Tetramethylethylenediamine (TEMED) </td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rifampicin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene cyanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;3MM Chr Chromatography Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive decontaminant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>decon</td>
			<td>decon90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio+ imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>63-0055-89</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

במבחנת מבחני שעתוק פותחו בשימוש נרחב במשך שנים רבות כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים שעתוק. תהליך זה דורש RNA פולימראז רב למקטע תלוי DNA (RNAP) וסדרה של גורמי שעתוק שפועלים כדי להשפיע על פעילותם של RNAP במהלך ביטוי גנים. רצף ג&#39;ל אלקטרופורזה של תמלילי רדיואקטיבי משמשת כדי לספק מידע מכניסטית מפורט על איך תמורת שעתוק ומה פרמטרים יכול להשפיע על זה. במאמר זה נתאר את הפרוטוקול ללמוד כיצד גורם התארכות החיונית נוסה מסדיר ששהייה תעתיק, כמו גם שיטה לזיהוי סוכן אנטיבקטריאלי מיקוד ייזום שעתוק באמצעות עיכוב של היווצרות holoenzyme RNAP. שיטות אלה יכולים לשמש כפלטפורמה לפיתוח גישות נוספות כדי לחקור את מנגנון הפעולה של גורמי התעתוק אשר עדיין אינו ברור, כמו גם Agen אנטיבקטריאלי חדשts מיקוד שעתוק אשר מהווה יעד תרופה מנוצלים במחקר ופיתוח אנטיביוטי.

יעילות השעתוק יכול להיקבע על ידי מדידת רמת הקרינה הלהקות בנקודות זמן שונות. את assay השהיה כדי לבדוק את הפונקציה של גורם נוסה לאפשר הדמיה של הפסקה, פיטורין, לבין נגר מוצרים (איור 1 א). בנוכחות של תחום N-terminal של נוסה (נוסה NTD; שאריות חומצת אמינו 1-137),...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery at JoVE.com

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K Views.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Video: In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video