This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

참고 : 실험은 재향 군인 팔로 알토 보건 의료 시스템에서 동물 연구위원회의 승인을 윤리적 기준에 따라 수행되었다. 1. 골지 - 콕스 염색 <ol><li> 뇌 적출 염색 <ol><li> 1 일에 깊이 일어난 과다 출혈를 통해 안락사 전에 100 ㎎ / kg 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (xylazine)와 쥐를 마취. </li><li> 조심스럽게 두 개관을 제거하고 뇌를 해부. <ol><li> 제 소뇌의 상부에 만곡 시저를 배치, 두개골 위에 피부를 제거하고 부드럽게 후각 망울 향하는 방향으로 이동하는, 외측 지적 시저의 끝 중앙 고랑에 두 개관 평행 통해 잘라. 양쪽에이 과정을 반복합니다. </li><li> 후각 전구쪽으로 선회하면서 두 개관을 들어 올려 끊다 수술 pincet을 사용합니다. 그런 다음, 거꾸로 두개골을 뒤집어 광학 통해 잘라 픽업을 사용하여신경과 뇌를 풉니 다. 마지막으로, 난원 매그넘의 수준에서 척수에서 뇌를 분리 픽업을 사용한다. </li></ol></li><li> 즉시 시판, 희석 골지 - 콕스 솔루션의 15 ml의 뇌를 체험. 실온에서 어두운 곳에서 캡핑 된 20 ㎖의 유리 병에서 골지체 용액 뇌 보관. </li><li> 둘째 날, 천천히 솔루션을 부어 15 ml의 신선한 골지 - 콕스 솔루션으로 교체. 뇌가 들어있는 병을 요점을 되풀이하고 어둠 속에서 또 다른 구일에 대한 방해받지 둡니다. </li></ol></li><li> 단면 및 매립 <ol><li> 11 일에, 탈수 DDH 2 O에서 제조 된 30 % 자당 용액에 머리를 놓으십시오. 12시간 후 새로 제조 한 30 % 자당과 솔루션을 변경합니다. 4 ° C에서 3 일간 30 % 자당 용액에 머리를 품어. </li><li> 블레이드가 덮여 때까지 14 일에, 30 % 자당 용액에 vibratome의 저수지를 입력합니다. 1m에 속도를 설정합니다m / s의 0.95 mm의 진폭. </li><li> 과도한 습기를 제거하고 coronally 잘라 면도날을 사용하여 소뇌를 제거 킴과 머리를시킨다. </li><li> 단단히 superglue를 사용하여에 vibratome 플랫폼으로 전체 뇌를 탑재하고 2-4 분 동안 설정할 수 있습니다. 저수지에 부착 된 뇌와 플랫폼을 삽입하고 뇌의 정상에 블레이드를 조정합니다. </li><li> 에 vibratome를 사용하여, 모든 3 뇌 후 블레이드를 변경 기억, 실온에서 150 μm의 두께 섹션으로 뇌 슬라이스. </li><li> 작은 끝이 브러시를 사용하여 저수지에서 섹션을 들고 DDH 2 O.에서 만들어진 0.3 % 젤라틴을 포함하는 페트리 접시로 몰입 섹션을 배양 접시에 남아 있지만, 각각의 슬라이드에 0.5 ml의 0.3 % 젤라틴의 추가 확산 코트 superfrost + 슬라이드에 브러시를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 페트리 접시에서 침지 된 부분을 선택하고 젤라틴 슬라이드에 배치합니다. 에 의해 뇌 부분의 방향을그들의 측면에 아닌 꼭대기에 그들을 감동. </li><li> 약 10 분 후, 코팅은 조직이 완전히 건조 30 % 수크로오스 전에 섹션. 그 후 공기는 3 일간 슬라이드 랙에 어두운 곳에서 준비한 슬라이드를 건조. </li><li> DDH 2를 사용 O. 배일 시판의 10 배 희석하여 현상액 7-10 분 동안 솔루션을 개발하는 슬라이드를 담가. DDH 2 O.에서 슬라이드 3 회 씻어 </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 증류 DDH O.이 다시 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 에탄올 용액을 준비 </li><li> 10 분 각각에 대해 점점 더 높은 에탄올 솔루션에 슬라이드를 만끽. </li><li> 10 분마다 100 % 에탄올 용액을 3 번 슬라이드를 담근다. </li><li> 그들이 커버 미끄러 때까지 최종 솔루션에 섹션을 유지, 5 분마다 100 %에 크실렌 3 회 연속 슬라이드를 만끽 해보세요. </li><li> DPX (크실렌 디 -n- 부틸 프탈레이트) 매체를 장착 (AB의 충분한 양을 배치플라스틱 이전 피펫을 사용하여 각 슬라이드 아웃 1.5 mL)을 첨가 하였다. 조심스럽게 거품을 방지하기 위해 커버 슬립을 배치합니다. </li><li> 공기 건조 커버 미끄러 뇌 섹션 수평으로 3 일 동안. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin 염색 <ol><li> 깊이 (1.1.1 참조) 동물을 마취. </li><li> 인산 버퍼 (12)에 만든 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드와 심장 관류를 수행합니다. </li><li> 흔들 통에 밤새 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 45 ml의의 두뇌 (1.1.2 참조) 및 저장 압축을 풉니 다. </li><li> 30 % 자당 용액에 머리를 전송하고 4 ℃에서 48 시간 동안 완전한 탈수 기다립니다. 자당에서 뇌를 제거하고 드라이 아이스에 배치 구리 블록에 직접 배치합니다. </li><li> 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물과 블록을 작성하고 랜드 마크로서 후각 망울을 사용하여 뇌의 방향을 표시합니다. </li><li> 저온 유지 장치를 사용하여 -20 ºC에서 70 미크론 두께 부분을 잘라 놓습니다동결 방지제 용액 (0.05 M 인산 나트륨 완충액에서 25 % 에틸렌 글리콜 25 % 글리세롤, pH를 7.4)에 -20 ℃에서 사용할 때까지 유지한다. </li><li> 50 % 동결 방지제 50 % 메탄올 용액을 확인합니다. 이 용액에 0.5 % 과산화수소 (용적 / 용적)을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 부유 섹션. </li><li> 조직 학적 오븐에 배치하여 30 ~ 40 분 TBS에서 37 ºC (TBS 버퍼)의 따뜻한 섹션. </li><li> 면역 염색 전에 실온에서 45 분 동안 0.3 % 트리톤 3 % 정상 말 혈청 섹션을 인큐베이션. 0.3 % 트리톤 1 % 정상 말의 혈청 TBS 500 : 밤새 일을 희석 DCX 항체의 3 ㎖ 용액에 4 ºC에서 섹션을 품어. </li><li> 다음 날은 TBS에서 섹션을 (10 분마다)를 연속 3 회 반복한다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 (TBS 200 1) 바이오틴 말 방지 염소와 섹션을 품어. TBS에서 섹션을 (10 분마다)를 연속 3 회 반복한다. </li><li> t을 품어실온에서 1.5 시간 동안 : ABC 라이트 (1,000 일)와 밑단. </li><li> 2 O 2 DAB 10 mg을 1 M 트리스 - 염산 (PH 7.6) 15 ㎖에 용해 (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) 솔루션 중 하나 태블릿에 30 % H의 5 μl를 추가합니다. 5 분 동안이 솔루션에 즉시 섹션을 품어. </li><li> 빙냉 TBS 실온에서 TBS에서 세척 한 다음에 세 번 세척하게하여 반응을 정지. </li><li> 크실렌 맑은 에탄올 용액의 시리즈 (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 5 분마다)를 이용하여 부분을 탈수하고, 단계 1.3에서와 같이 DPX를 사용하여 슬립 커버. </li></ol> 3. 시각화 <ol><li> 섹션의 완전한 건조에 이어, 날카로운 블레이드와 슬라이드의 상단에 초과 DPX를 제거하고 현미경 스캐닝 스테이지에 배치합니다. 스캐닝 시스템은 스테이지, 조이스틱, 및 12 비트 컬러 카메라가 장착 된 현미경으로 구성된다. </li><li> 프로그램을 시작합니다. 새로운 데이터 파일을 엽니 다. </li><li> 장소임의의 장소에서 마우스 포인터를 클릭하면 화면상의 기준점. 이 프로그램 윈도우의 도구 패널에서 모든 아이콘이 활성화됩니다. </li><li> 도구 모음에서 &quot;조이스틱 무료&quot;아이콘을 클릭 한 다음 첫 번째 섹션에서 해마의 치아 이랑의 위치를​​ 조이스틱을 사용합니다. </li><li> 프로그램 창의 &#39;도구&#39;탭에서 &quot;직렬 과장&quot;을 선택합니다. 윈도우의 왼쪽 하단에 &quot;새 절&quot;아이콘을 클릭합니다. 이것은 &quot;직렬 섹션 설정&quot;창이 열립니다. </li><li> 직렬 제 설정 창을 선택하고 해마 영역을 포함하는 섹션의 총 수를 입력합니다. 평가 간격을 선택합니다. 섹션 절단 두께 (DCX 70 μm의 골지 염색 섹션 150 μm의)를 입력합니다. </li><li> 도구 모음에서 &quot;프리 핸드 윤곽선 그리기&quot;아이콘을 클릭하여 치아 이랑 (dentate gyrus) 영역을 추적을 시작합니다. 이가있는 과립 세포층 개요. &lt;/ 리&gt; <li> &quot;확대&quot;메뉴에서 &quot;100 배&quot;를 선택합니다. 섹션에 침지 기름 한 방울을 추가하고 100X에 목표를 전환합니다. 이러한 목표 아래 이가있는 과립 세포 기관과 수상 돌기를 찾습니다. </li><li> 선택된 신경 세포에 초점 도구 모음에서 &quot;신경 추적&quot;아이콘을 클릭합니다. 이가있는 과립 전지 본체의 원주를 추적. 추적이 완료되면 바로 &quot;마침 셀 바디&quot;를 선택합니다. </li><li> x, y 및 z 방향에서 수동 수지상 추적을 시작하고, 조이스틱 및 Z 모터 노브를 사용하여 각 지점을 따른다. 분기 또는 삼 분기 노드에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭시 드롭 다운 메뉴에서 해당 옵션을 선택합니다. 이러한 노드에서 발생하는 각 분기를 추적합니다. 각 지점의 끝에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 &quot;종료&quot;를 선택합니다. </li><li> 프로그램 창의 화살표 키 아이콘을 사용하여 무작위로 다른 이가 과립 셀을 선택하고 대하여 descr와 동일한 절차를 따라단계 3.9-3.10에 ibed. 전체 추적을 저장합니다. </li><li> 신경 추적 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 실험 그룹의 첫 번째 마우스에서 첫 번째 NRX 데이터 파일을 엽니 다. 실험 집단의 두 번째 마우스의 NRX 파일을 추가합니다. 이 그룹의 모든 NRX 파일이 추가 될 때까지 계속합니다. </li><li> 분석 탭에서 &quot;팬에서 다이어그램&quot;을 선택합니다. 이 팬에서 분석 창을 엽니 다. 마크 &quot;수상 돌기&quot;을 확인하고 쥐의이 그룹 (그림 1)에 대한 수상 돌기의 길이와 분기 패턴을 묘사 표시를 클릭합니다. </li></ol> 4. EDFI 참고 :이 방법은 각 필드의 급속 Z 축 통해 다수의 이미지를 기록하고 Z 축에 걸쳐 모든 화소가 포함 포커싱 2D 화상을 생성하는 것을 가능. 결과는 수집 된 이미지에서 모든 초점을 맞춘 픽셀을 포함하는 합성 이미지 될 것입니다. <ol><li> 디지털 캠에 ​​현미경을 연결시대. 현미경에 연결된 스캔 무대에서 첫 번째 섹션을 배치하고 10 배 목표로 전환합니다. 관심의 영역으로 무대를 이동합니다. </li><li> 비디오 캡처 프로그램을 시작합니다. </li><li> 녹음 버튼을 누릅니다. 즉시 녹화 버튼을 누르면 같이, 4 초 총 부의 상단에서 하단으로 이동 매크로 포커스 노브를 사용. 결과 비디오 파일을 저장합니다. </li><li> 파일을 열고 파일 압축 형식으로 저장하여 비 압축 형식으로 AVI 비디오 파일을 변환 ImageJ에 프리웨어를 사용한다. </li><li> 이미지 분석 프로그램을 시작하고 AVI 파일을 엽니 다. &quot;프로세스&quot;메뉴로 가서 &quot;필드의 확장 깊이&quot;을 클릭합니다. 해당 비디오 파일을 선택합니다. &quot;출력&quot;옵션에서 &quot;복합 베스트 초점 이미지 생성&quot;을 선택합니다. </li><li> &quot;집중 분석&quot;옵션에서 &quot;표준화 된 조명&quot;과 &quot;최대 지역 대비&quot;옵션을 선택합니다. 그런 다음, &quot;Cre 호텔을 선택&quot;먹었다. 결과 이미지는 z 축에 걸쳐 모든 화소 포커스 (도 2)를 나타낸다. </li><li> 결과 이미지를 저장합니다. </li></ol> 5. 매우 높은 해상도 이미지를 생성 주 :이 방법은 사용자가 자동​​으로이 자동화 방식으로 저배율과 고배율 고해상도 이미지에서 매우 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수있다. <ol><li> 현미경에 연결된 스캔 무대에서 첫 번째 섹션을 놓습니다. 현미경은 디지털 카메라에 접속된다. 관심의 영역으로 무대를 이동합니다. </li><li> 화상 취득 프로그램을 시작한다. </li><li> 10 배 목표를 사용하여 획득하고 10 % 이상 중복을 가지고 확인하는 관심 영역에서 높은 해상도 (3116 X 4076) 이미지를 저장합니다. </li><li> 실행 이미지 합성 편집기는 이미지를 스티치합니다. </li><li> 파일 (File) 메뉴로 이동하고, &quot;새 파노라마&quot;을 클릭합니다. 이미지 세인트 된 폴더를 선택OR 연산. 같은 지역하고 &quot;확인&quot;에 속하는 이미지를 선택합니다. </li><li> 보도는 &quot;수출 디스크에&quot;버튼을 누르면 이미지를 저장합니다. 이 이미지는 분석 및 / 또는 데모 (도 3)에 사용될 수있는 관심 영역의 매우 높은 해상도의 화상을 나타낸다. </li></ol>

<ol>
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이 기사에 대한 출판 비용은 MBF 바이오 사이언스가 후원한다.

여기서 두 가지 방법 RTI와 EDFI와 함께 기존의 염색 방법을 사용하여 성숙하고 새로 태어난 뉴런의 수상 돌기 arborization의 정도를 정량화하는 기술되었다. 뉴런의 고해상도 영상의 획득은 차례로, 해마의 신경 세포를 표적 치료 전략을 평가하는 수단을 제공하며, 신경 퇴행성 장애의 해로운 영향을 테스트하기 위해 매우 유용한 방법을 제공한다. RTI의 방법은 심층 데이터 arbori...

시냅스의 수와 구조의 동적 변경은 개발, 노화의 특징, 그리고 수많은 신경 퇴행성 질환 1-3. 시냅스 정보를 수신하고 통합하는 신경 세포의 능력은 돌기 형태와 시냅스 연결의 동적 변경에 따라 달라집니다. 실제로 양의 상관 관계는인지 기능 4에 영향을 모두 돌기 척추 및 시냅스 번호 사이에 존재합니다. 따라서, 수지상 척추 수의 감소가 돌기 척추 정량에 큰 관심을 자극, 신경 장애 5-7의 숫자에인지 기능 장애와 관련 된 것은 놀라운 일이 아니다. 그럼에도 불구하고, 척추 밀도 정량화 수지상 트리 걸쳐 시냅스의 지형 및 분배에 관한 유용한 정보를 생성하지 못하는 시간 소모적이고 지루한 작업이 남아있다. 다행히, 염색 방법 (예를 들어, 골지체 - 콕스와 doublecortin (DCX)) 함께정교한 영상 기술로 현재 장벽을 극복하고 신뢰성 있고 신속하게 수지상 arborization의 고해상도 이미지를 생성하기 위해 이용 될 수있다. 골지 - 콕스 염색 방법은 모든 뉴런 8 수지상 arborization의 상태를 평가하기 위해 배치 될 수 있지만, DCX는 신경이 모두 발생 주어진 특히 치아 이랑 (dentate gyrus)과 뇌실 영역 (9), 중요한 고려 사항에 새로 태어난 뉴런에 라벨을 배포 할 수 있습니다 수명 (10, 11)에 걸쳐이 지역. 염색 후, 두 개의 촬상 방법은 수지상 특성을 평가하기 위해 배치되었다 : ⅰ) 실시간 영상 (RTI) 및 필드 영상 (EDFI)의 Ⅱ) 확장 깊이. RTI의 기술은 추적 및 개별 수지상 세그먼트와 가지를 따라 arborization의 길이와 순서를 정량화 평균을 제공한다. 그러므로 그것은 전체 면적과 각 수지상 트리가 차지하는 부피를 추정을 가능하게한다. 이상의 S를pecifically, RTI의 방법에서 사용자는 연속 세그먼트를 식별하고 추적 소프트웨어 뉴​​런 수지상 구조의 X, Y, Z 좌표를 수집로 반복적으로 초점을 다시 맞 춥니 및 3D에 수지상 구조의 궤도를 재구성한다. 비교적, EDFI 방법은, 합성 화상을 생성하는 전체의 z 축에 대한 정보를 제공함으로써 다소 두꺼운 조직 표본에서 수지상 밀도를 평가하기위한 비교적 간단하고 신속한 방법을 제공한다. 이를 위해, 사용자는 단면의 두께에 걸쳐 고해상도 비디오 파일을 기록하고, 화소에 초점이 완전히 상기 점을 식별하는 비디오 프레임들을 검색하는 소프트웨어를 사용한다. 계속해서, 포커싱 된 화소가 병합 및 고해상도, 복합 2D 화상으로 통합된다. 이 합성 이미지에 관계없이 z 축에서 자신의 위치에 초점 있던 모든 픽셀이 포함되어 있습니다. 이러한 2 차원 영상의 정성 및 정량 분석​​은 밀도를 결정하기 위해 후속 적으로 사용될 수있다수지상의 필드마다 분파. 마지막으로, 관심의 전체 영역에서의 분석 및 평가를위한 수지상 매우 높은 해상도의 이미지를 생성하는 파노라마 방법을 제시한다. 이 기술은 매우 고해상 비싼 디지털 카메라에 대한 액세스의 부족을 극복하기 위해 배치 될 수있다. 이 방법을 사용하면, 하나가 X 축 및 Y 축을 따라 다른 위치에 일련의 이미지를 캡쳐 한 후 자동으로 함께 스티칭 프리웨어를 사용 (예를 들어, 이미지 합성의 편집자). 특히,이 방법은 다소 넓은 영역에서 수지상 arborization의 정량적 평가를 위해 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Modified Golgi-cox staining solution&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">1x Developing Solution (Stock 10x)</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:272px;">30% Sucrose,</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 57-50-1</td>
			<td style="width:159px;">make fresh &#160;in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">0.3% Gelatin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 9000-70-8</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:272px;">Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS 603-003-00-5</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Xylene</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 1330-20-7</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DPX Medium</td>
			<td style="width:263px;">EMS&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#13510</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost (+) white</td>
			<td style="width:263px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:267px;">71869-10</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td>
			<td style="width:263px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#4811-703</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DCX Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:267px;">sc-8066</td>
			<td style="width:159px;">4 C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DAB</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 91-95-2 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">-20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">OCT</td>
			<td style="width:263px;">Tissue-tek</td>
			<td style="width:267px;">4583</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Tris</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 77-86-1 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">ABC Lite</td>
			<td style="width:263px;">Vector</td>
			<td style="width:267px;">PK4000</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">DS-Ri1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">12 bit Camera&#160;</td>
			<td style="width:263px;">QImaging&#160;</td>
			<td>01 MBF2000RF-CLR-12</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Neurolucida System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td style="width:267px;">V.10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Composite Editor</td>
			<td style="width:263px;">Microsoft</td>
			<td>1.4.4.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">F 3.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Pro Plus</td>
			<td style="width:263px;">Mediacy</td>
			<td>Versin 7.00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

현존 및 새로 태어난 이가 과립 세포로부터 발생 arborization의 범위는 골지체 콕스 - 또는 DCX 염색법 (도 1)를 사용하여 야생형 마우스에서 분석 하였다. DCX 양성 세포 수지상 세그먼트는 13-36 미크론 긴 것으로 밝혀졌다. 수지상 길이의 정규 분포 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트하여 테스트 하였다 (D = 0.1217, P &lt;0.01, Liliefors의 p &lt;0.001;도 4 및도 5). ...

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Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K 조회수.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

연구

신경과학

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

설치류에서 시간적 처리의 평가 대 한 Interstimulus 간격의 힘

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.