Name: assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
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This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

注：実験は、退役軍人パロ​​アルトヘルスケアシステムにおける動物研究委員会によって承認された倫理基準に従って行った。 1.ゴルジ - コックス染色<ol><li>脳抽出と染色<ol><li>第一日目には、深く放血を経由して安楽死の前に100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgキシラジンでマウスを麻酔。 </li><li>慎重に頭蓋冠を削除し、脳を解剖する。 <ol><li>まず小脳の上に湾曲したハサミを置く、頭蓋骨の上に皮膚を除去し、軽くはさみの先で中心溝に頭蓋冠と平行を切断嗅球に向かう方向に移動する、外側に指摘した。両側にこのプロセスを繰り返します。 </li><li>嗅球に向かってそれを回しながら頭蓋冠を持ち上げるために、外科ピンセットを使用して、それを破る。その後、逆さまに頭蓋骨を反転し、視神経を切断するためにピックを使って神経や脳を緩めます。最後に、大後頭孔のレベルで脊髄から脳を分離するためにピックを使用しています。 </li></ol></li><li>すぐに市販の、希釈されていないゴルジ - コックス溶液15mlで脳を浸す。暗所で室温で蓋をし、20ミリリットルのガラス瓶にゴルジ液に脳に保管してください。 </li><li> 2日目、ゆっくりとソリューションを注ぐと15ミリリットル新鮮なゴルジ - コックス·ソリューションと交換してください。脳を含むボトルをおさらいし、暗所で別の9日間、平静なままにしておきます。 </li></ol></li><li>セクショニングと埋め込み<ol><li> 11日の日に、脱水のためのddH 2 O中で調製30％のショ糖溶液中で脳を、置く。 12時間後に、新たに調製した30％のスクロースを含むソリューションを変更します。 4℃で3日間、30％ショ糖溶液中で脳をインキュベートする。 </li><li>ブレードが覆われるまで14日目に、30％のショ糖液でビブラトームのリザーバを埋める。 1メートルに速度を設定しますメートル/秒0.95ミリメートルの振幅である。 </li><li>余分な水分を除去し、冠状に切断し、カミソリの刃を使用して、小脳を除去しキムワイプで脳ブロット。 </li><li>しっかりと瞬間接着剤を使用したビブラトームプラットフォームに全脳をマウントし、それが2-4分間に設定することができます。リザーバ内に付着した脳を持つプラットフォームを挿入し、脳のトップに刃を調整します。 </li><li>ビブラトームを使用して、3回目の脳の後にブレードを変更するには、覚えて、室温で150ミクロン厚の切片に脳スライス。 </li><li>小さ ​​な傾いてブラシを使用して、リザーバーからのセクションをピックアップし、のddH 2 Oで行われた0.3％ゼラチンを含むペトリ皿にそれらを浸すのセクションでは、ペトリ皿に残っている各スライド上の0.3％のゼラチンの0.5ミリリットルを追加し、スーパーフロスト+スライドを広げて、コーティングするためにブラシを使用している間。 </li><li>静かにペトリ皿から浸さセクションをピックアップし、ゼラチン化スライド上に配置します。による脳切片の向き唯一の彼らの側にしていないのトップスにそれらに触れる。 </li><li>約10分後、コート組織の前に30％のスクロースを含むセクションが完全に乾く。その後、空気は、3日間のスライドラックに暗い場所で準備スライドを乾燥させます。 </li><li>市販の希釈して10倍ののddH 2 Oを使用して1倍するソリューションの開発7-10分のためのソリューションの開発にスライドを浸す。のddH 2 Oにスライドを3回すすぎ</li></ol></li><li>脱水<ol><li>蒸留のddH 2 Oを使用して20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、および95％エタノール溶液を調製し</li><li> 10分ごとに、ますます高いエタノール溶液にスライドを浸す。 </li><li>各回10分間、100％エタノール溶液で3回スライドを浸し。 </li><li>彼らはカバースリップしているまで、最終溶液中のセクションを保ち、5分ごとに100％のキシレンに3回連続してスライドを浸す。 </li><li> DPXの寛大な量（キシレン中のジ-n-ブチルフタレート）マウンティング培地（ABを配置プラスチック転送ピペットを使用して、各スライドのうち1〜1.5ミリリットル）。慎重に泡を避けるために、カバースリップを配置。 </li><li>エアドライカバーが滑っ脳セクションを水平に3日間。 </li></ol></li></ol> 2.ダブルコルチン染色<ol><li>深く（ステップ1.1.1を参照）、動物を麻酔。 </li><li>リン酸緩衝液12で行われた、新たに調製した4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。 </li><li>ロッキングシェーカー上で一晩4℃で4％パラホルムアルデヒドの45ミリリットル中の脳（1.1.2を参照）、店舗を抽出します。 </li><li> 30％のショ糖溶液に脳を移し、4℃で48時間、完全な脱水を待つ。ショ糖から脳を取り出し、ドライアイス上に置き、銅ブロックの上に直接配置します。 </li><li>最適な切削温度（OCT）化合物でブロックを記入し、ランドマークとして嗅球を用いて脳の向きをマーク。 </li><li>クライオスタットを用いて、-20ºCで70ミクロン厚の切片を切り出し、それらを配置凍結保護物質溶液（0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液中の25％エチレングリコール、25％グリセロール、pH7.4）で-20℃で使用するまで続ける。 </li><li> 50％の凍結保護剤および50％メタノールの溶液を作る。この溶液に、0.5％過酸化水素水（体積/体積）を加える。室温で30分間浮遊切片をインキュベートする。 </li><li>組織学的オーブンに入れて、30〜40分間、TBSで37ºC（トリス緩衝食塩水）でウォームセクション。 </li><li>免疫染色の前に室温で45分間、0.3％トリトンおよび3％の正常ウマ血清を持つセクションをインキュベートする。 0.3％トリトンと1％正常ウマ血清をTBSで500：1に希釈DCX抗体の3ミリリットル溶液中で一晩4ºCでのセクションをインキュベートします。 </li><li>次の日は、セクションをTBSで3回連続して（10分ずつ）洗浄します。 </li><li>室温で2時間：（TBS中200 1）ビオチン化ウマ抗ヤギを持つセクションをインキュベートします。セクションをTBSで3回連続して（10分ずつ）洗浄します。 </li><li> Tをインキュベート室温で1.5時間：ABC Liteの（千1）と裾。 </li><li> 1 Mトリス塩酸（pH7.6）で15mlに溶解DAB（3,3 &quot;-Diaminobenzidine）の溶液に10mgの1錠30％のH 2 O 2の5μLを加える。 5分間この溶液に、すぐにセクションをインキュベートする。 </li><li>氷冷TBSで室温でTBSで1回洗浄した三回、それらを洗浄することにより反応を停止。 </li><li>キシレンで透明なエタノール溶液（50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、5分毎）を用いた一連の切片を脱水した後、ステップ1.3のようDPXを用いてスリップをカバーする。 </li></ol> 3.可視化<ol><li>セクションの完全な乾燥の後、鋭利な刃で、スライドの上に過剰DPXを削除し、顕微鏡の走査ステージ上に置きます。システムは、走査ステージ、ジョイスティック、およびカラー12ビットのカメラを備えた顕微鏡で構成されている。 </li><li>プログラムを起動します。新しいデータファイルを開きます。 </li><li>場所任意の場所でマウスポインタでクリックすることで、画面上の基準点。これは、プログラムウィンドウのツールパネルからすべてのアイコンがアクティブになります。 </li><li>ツールバーの「ジョイスティック無料」アイコンをクリックし、第一項の海馬の歯状回を見つけるためにジョイスティックを使用しています。 </li><li>プログラムウィンドウの「ツール」タブで、「シリアル課長」を選択します。ウィンドウの左下隅の「新規セクション」アイコンをクリックします。これは「シリアルセクションの設定」ウィンドウが開きます。 </li><li>連続切片Setupウィンドウを選択してから、海馬領域を含むセクションの合計数を入力します。評価間隔を選択します。 （DCXのための70ミクロンとゴルジ染色切片のために150μm）の厚さをカットセクションを入力します。 </li><li>ツールバーの「フリーハンド輪郭描画」アイコンをクリックして歯状回領域トレースを開始。歯状回顆粒細胞層の概要を説明します。&lt;/ LI&gt; <li> 「倍率」メニューから「100X」を選択します。セクションのイマージョンオイルの滴を追加し、100Xに目標を切り替えます。この目的の下で歯状回顆粒細胞体と樹状突起の位置を確認します。 </li><li>選択したニューロンに焦点を当て、ツールバーの「ニューロントレース」アイコンをクリックしてください。歯状回顆粒細胞体の周囲をトレースします。トレースが終了したら、右の「完了セルボディ」をクリックして選択します。 </li><li> x、y、z方向に手動で樹状突起のトレースを開始し、ジョイスティック及びz運動ノブを使用して、各ブランチに従う。分岐または三分岐ノードでは、右クリックすると、ドロップダウンメニューからそれぞれのオプションを選択します。これらのノードから発生する枝のそれぞれをトレースします。各ブランチの終わりに右クリックし、ドロップダウンメニューから「エンディング」を選択します。 </li><li>ソフトウェアのウィンドウに矢印キーのアイコンを使用すると、ランダムに別の歯状回顆粒細胞を選択し、DESCRと同じ手順に従ってくださいステップ3.9から3.10にアイベッド。全体のトレースを保存します。 </li><li>ニューロンのトレースソフトウェアを起動します。 </li><li>実験群の最初のマウスからの第NRXデータファイルを開きます。実験群の第二のマウスのNRXファイルを追加します。このグループからすべてのNRXファイルが追加されるまで継続する。 </li><li>分析]タブの下で、「ファンインダイアグラム」を選択します。これはファンイン分析ウィンドウが開きます。マーク「樹状突起」をチェックして、マウスのこのグループ（ 図1）のための樹状突起の長さと分岐パターンを示しているディスプレイをクリックします。 </li></ol> 4. EDFI 注：この方法は、迅速に各フィールドのz軸を介して多数の画像を記録し、z軸全体のすべての集中画素を含む二次元画像を生成することを可能にする。その結果、収集した画像からのすべての集中画素を含む合成画像になります。 <ol><li>デジタルカムにマイクロスコープを接続時代。顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置して、10倍の対物レンズに切り替える。関心のある領域にステージを移動します。 </li><li>ビデオキャプチャプログラムを起動します。 </li><li>録音ボタンを押します。とすぐに録音ボタンを押している、4秒の合計セクションの上から下に移動するために、マクロフォーカスノブを使用しています。結果のビデオファイルを保存します。 </li><li>ファイルを開き、圧縮されていないファイル形式で保存することで、非圧縮フォーマットにAVIビデオファイルを変換するImageJのフリーウェアを使用してください。 </li><li>画像解析プログラムを起動し、AVIファイルを開きます。 「プロセス」メニューに移動し、「フィールドの拡張深さ」をクリックしてください。対応するビデオファイルを選択します。 「出力」オプションでは、「コンポジットベスト焦点画像の生成」を選択します。 </li><li> 「フォーカス解析」オプションでは、「正規化照明」と「最大局所コントラスト」オプションを選択します。その後、「Creを選択「食べた。結果の画像は、z軸（ 図2）を通してすべてのフォーカスピクセルを表す。 </li><li>結果の画像を保存します。 </li></ol> 5.極めて高解像度の画像を生成注：この方法では、ユーザーは自動的に自動化された方法で、高倍率·高解像度画像から低倍率で非常に高解像度の画像を生成することを可能にする。 <ol><li>顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置します。顕微鏡デジタルカメラに接続されている。関心のある領域にステージを移動します。 </li><li>画像取得プログラムを起動します。 </li><li>関心領域の画像は、少なくとも10％のオーバーラップを有することを確認して（xは3116 4076）10倍対物レンズを使用し、高解像度を取得し、保存する。 </li><li>イメージをステッチするイメージコンポジット·エディタを実行します。 </li><li>メニューをファイルに移動し、「新しいパノラマ」をクリックしてください。画像はSTされているフォルダを選択します論理和。同じ領域を押して「OK」に属している画像を選択します。 </li><li>ボタンを押して「ディスクに書き出し」とイメージを保存します。この画像は、分析および/ ​​または実演（ 図3）のために使用することができる関心領域の非常に高解像度の画像を表す。 </li></ol>

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この記事の発行手数料はMBFバイオサイエンスが主催している。

ここでは、2つの方法がRTIとEDFIと組み合わせて、従来の染色法を用いて、成熟した、新たに生まれたニューロンにおける樹状突起樹枝状分岐の程度を定量化するために記載された。ニューロンの高解像度画像の取得は、神経変性障害の有害な影響を試験するための非常に有用な方法を提供し、ひいては、海馬神経細胞を標的とする治療戦略を評価するための手段を提供する。 <p class="jove_con...

シナプスの数と構造の動的な変化は、開発の特徴で、高齢化、および多数の神経変性疾患1-3である。シナプスの情報を受信し、統合するための神経細胞の能力は、樹状形態とシナプス結合の動的な変化に依存している。確かに、正の相関が樹状突起棘と認知機能4に影響を与えるの両方シナプス数、間に存在する。従って、樹状突起棘の数のデクリメントが樹状突起棘の定量化に大きな関心を促し、神経疾患5-7多数の認知機能障害と関連していることは驚くべきことではない。それにもかかわらず、背骨密度の定量化は、樹状ツリー全体のシナプスの地形や流通に関する有用な情報を生成するのに失敗し、時間がかかり、面倒な作業のまま。一緒に幸いなことに、染色方法（ 例えば 、ゴルジ-コックスとダブルコルチン（DCX））高度なイメージング技術と現在の障壁を克服し、信頼性が高く、迅速な方法で樹枝状分岐の高解像度画像を生成するために利用することができる。ゴルジ-コックス染色法は、すべてのニューロン8の樹樹枝状分岐の状態を評価するために展開することができますが、DCXは、特に歯状回と脳室下帯9で新たに生まれたニューロンを標識するために展開することができ、重要な考慮事項は、神経新生の両方で発生していることを与えられた寿命10,11を通じて、これらの地域。 染色後、つの撮像方法は、樹状特性を評価するために配備された：i）のリアルタイムイメージング（RTI）及びフィールドイメージング（EDFI）のii）の拡張深度。 RTI技術は、個々の樹状セグメントと枝に沿って樹枝状分岐の長さと順序をトレースし、定量化するための平均値を提供します。したがって、それぞれの樹状ツリー占める総面積と体積を推定するために1を可能にします。以上のSpecifically、RTIの方法では、ユーザは、連続的セグメントを識別し、ソフトウェアを追跡するニューロンは、樹枝状構造のx、y、およびz座標を収集するように反復的に再集束及び3Dにおける樹枝状構造の軌道を再構成する。比較的、EDFI方法は全体z軸に関する情報を提供し、合成画像を生成することではなく、厚い組織標本において、樹状密度を評価するための比較的単純かつ迅速な手段を提供する。そうするために、ユーザは、セクションの厚さ全体の高解像度ビデオファイルを記録し、画素に焦点が完全であることを特徴とするポイントを識別するためにビデオフレームを検索するためのソフトウェアを使用する。その後、フォーカスピクセルがマージされ、高解像度、合成2D画像に統合される。この合成画像は関係なく、z軸での位置の中で、焦点となったすべてのピクセルが含まれています。これらの2D画像の定性的および定量的分析は、濃度を決定するためにその後に使用することができの樹状突起の各分野での分岐。 最後に、関心領域全体における樹枝状結晶の分析および評価のために非常に高解像度の画像を生成するパノラマの方法を提示する。この技術は、非常に高解像度で高価なデジタルカメラへのアクセスの欠如を克服するために展開することができる。この方法を使用して、一方がx軸とy軸に沿った異なる位置で連続画像を取得し、自動的にそれらを一緒にフリーウェアを使用してステッチ（ 例えば 、画像のコンポジット·エディタ）。特に、この方法は、かなり広範囲に樹状樹枝状分岐の定性的および定量的評価のために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>Modified Golgi-cox staining solution&amp;nbsp;</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>store at 4&amp;deg;C till use</td></tr><tr><td>1x Developing Solution (Stock 10x)</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>store at 4&amp;deg;C till use</td></tr><tr><td>30% Sucrose,</td><td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>make fresh &amp;nbsp;in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>0.3% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medium</td><td>EMS&amp;nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) white</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>CAS Number 91-95-2 &amp;nbsp;</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>CAS Number 77-86-1 &amp;nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12 bit Camera&amp;nbsp;</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

現存及び新生歯状回顆粒細胞から生じる樹枝状分岐の程度は、ゴルジコックスまたはDCX染色（ 図1）のいずれかを使用して、野生型マウスにおいて分析した。 DCX陽性細胞の樹状突起セグメントは、13-36ミクロンの長いことが判明した。樹状長さの正規分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定を用いて試験した（D = 0.1217のp &lt;0.01、Liliefors pは&lt;0.001; 図4および図5?...

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Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

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JoVE Journal

Neuroscience

10.2K ビュー.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

ビデオ: Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

行動学

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

成体マウスから海馬歯状回の解剖

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

生物学

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

生化学

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

神経科学

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

要約

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