אנו מעריכים מאוד את ד&quot;ר טאקשי Ikeya וצוות טכני בToyo Gosei, טוקיו, יפן למתן צלחות תרבות micropatterned thermosensitive כמו גם ייעוץ מדעי. כמו כן, אנו מודים לגב &#39;Satomi Ogura, הגב&#39; Sae סוזוקי, הגב &#39;אסוקה Miyoshi והגב&#39; Katsue Morii לקבלת סיוע טכני בניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה כלכלית בחלקו על ידי JSPs KAKENHI גרנט ב- Aid למחקר מדעי, המרכז של חדשנות תכנית (COI) ותכנית חדשנות S- מהמדע והטכנולוגיה סוכנות יפן (JST), וCore- JSPs ל- Core תכנית, א רשתות מחקר מתקדם.

כל המחקרים בבעלי החיים שנערכו באישור ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה של ​​טוקיו, טוקיו, יפן. 1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לhepatocytes העיקרי, בצע את הפרוטוקול לבידוד hepatocyte מחולדה בתהליך עיכול collagenase שני שלבים שונה 13,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות ספראג Dawley (SD) (זכר, 5 שבועות) תחת הרדמה משאיפת עם isoflurane. מניחים חולדה בתא מחובר למכונת הרדמה כדי לספק isoflurane לתא. קח את העכברוש לאחר להירדם, והניח אותו על שולחן הניתוחים עם אוורור באמצעות מסכה. לשלוט על זרימת isoflurane כ ב0.4-0.7 L / min על ידי בדיקת התנאים של החולדה. Perfuse את הכבדים של ספראג Dawley (SD) חולדות (זכר, 5 שבועות) מוריד השער הכבד עם פתרון מיוחד המורכב של נתרן כלורי 8 גרם / L (NaCl), כלוריד 400 מ&quot;ג / ליטר אשלגן (KCl), 78 מ&quot;ג / Ldodecahydrate פוספט מימן disodium dihydrate פוספט dihydrogen נתרן (אא 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 מ&quot;ג / ליטר (Na 2 HPO 4 · O 12H 2), 2.38 גר &#39;/ ל&#39; 2 [4 (2-hydroxyethyl) -1 -piperazinyl] קרבונט מימן נתרן חומצת ethanesulfonic (HEPES), 190 מ&quot;ג / ליטר חומצת אתילן גליקול tetraacetic (EGTA), 350 מ&quot;ג / ליטר (NaHCO 3), ו -900 גלוקוז מ&quot;ג / ליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ פתרון collagenase דרך כבד. הערה: הפתרון מורכב של 500 מ&quot;ג / collagenase L, / מלח של L האנק 9.8 גרם נאגר, 2.38 גר &#39;/ מיליליטר HEPES, 556 מ&quot;ג / מימה סידן כלורי מיליליטר (CaCl 2 · O H 2), 350 מ&quot;ג / ליטר NaHCO 3, ומעכב 50 מ&quot;ג / ליטר טריפסין, עם החומציות מותאמת ל7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכבד בזהירות, ובררת אותו בעדינות על צלחת באמצעות סכין אזמל, להוסיף בינוני של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), השתנה Dulbecco ולסנן את ההשעיה התא דרך 100 מיקרומטררשת ניילון. כדי להסיר פסולת נוספת, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 20 × גרם דקות 1. בשלב זה, hepatocytes נמצא בsupernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב צנטריפוגה פעמיים (בסך הכל שלוש centrifugations). לבסוף, צנטריפוגות hepatocytes ב 50 × גרם במשך 3 דקות לשחזר אותם בצורה של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש hepatocytes לריכוז של 4 × מיליליטר / 10 5 תאים במדיום תרבות מיוחד המורכב מDMEM בתוספת 10% FBS, 1% עט-דלקת-שפע (PSQ), 1% sulfoxide דימתיל (DMSO), 0.1 dexamethasone μmol / L, 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, nicotinamide / L 10 mmol, ascorbate 0.2 mmol / L פוספורילציה (ASC-2P), ו- 10 ng / ml גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (hEGF) 15. מדיום מיוחד זה הוא חובה לשמירה על התפקוד הכבד בתנאים במבחנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת MSCs חולדה, להרדים ספראג Dawley חולדות (SD) (זכר, 5 שבועות) על ידי ממשל יתר של isoflurAne. לכרות עצמות הירך וtibias, ולאסוף את קישואי עצם על ידי החדרת מחט G 22 לתוך הפיר של העצם כדי לשטוף אותו עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS. לאסוף את התאים על ידי סינון דרך רשת ניילון 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים על 10 מנות תרבות סנטימטר באמצעות DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. לניסויי אליפטית, להשתמש MSCs בתוך 5 קטעים. </li></ol> 2. הכנת Spheroids הסלולרי 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסחרי להשיג צלחות תרבות micropatterned, שבאזורי דבק התא ערוכים באופן קבוע ב 100 מיקרומטר קוטר באופן דו-ממדי, מוקף באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG. הערה: להשתלת תאים, ציפוי נוסף עם PIPAAm פולימר thermosensitive הכרחי כדי לאפשר ניתוק תא על ידי קירור הצלחות (ראה שלב 5.1). תנודות טמפרטורה יכולה לגרום לשינויים בכימיה של פולימרים זה8-10. על 37 מעלות צלזיוס, PIPAAm הוא מעט הידרופובי, מאפשר לתאים להיות מתורבת בתנאים רגילים. ירידה בטמפרטורה מתחת 32 ° C תוצאות בלחות מהירה של הפולימר, שהובילה לניתוק הספונטני של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי hepatocytes או MSCs על 12 גם צלחות micropatterned בצפיפות של 4 × 10 5 תאים / גם andincubate על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. התאים יצטברו באזורי הדבקת micropatterned ויוצרים spheroids סיבוב בהדרגה ב 2 ימים. הערה: להכנת תאי שליטה בתרבות monolayer, להשתמש בצלחות 12 גם נורמליות וזרע התאים בצפיפות זהה, לאחר הליך דומה כפי שתואר לעיל. </li></ol> 3. הכנת Polyplex Nanomicelles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז קופולימר בלוק, PEG-PAsp (DET) (פולי [N &#39;- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, תואר פילמור (DP) של PAsp מגזר (DET) = 59), וhomopolymer שמורכב מרק מגזר קטיוני [PAsp (DET)] (DP = 55), בעקבות ההליכים שתוארו קודם לכן על ידי מהחברים 11, 16, 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מעורב של PEG-PAsp קופולימר הבלוק (DET) וhomopolymer PAsp (DET) ביחס טוחנת שווה של קבוצות אמינו שיורית בחיץ 10 מ&quot;מ HEPES (pH 7.3) על ידי התאמת ריכוז הפולימר ל33.3 מיקרוגרם / מיליליטר ו 19.1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה. הערה: ריכוזי הפולימר שתוארו לעיל הם ערכי נציג להכנת nanomicelles עם יחס שייר טוחנת בסך הכל קבוצות אמינו בשני פולימרים לקבוצות פוספט בpDNA (N / יחס P) של 10. היחס / P N יכול להשתנות בהתאם לסוג התא והמטרה (לפרטים, ראה דיון). השימוש בשילוב של שני פולימרים יכול להשיג את שניהם מיגון יעיל PEG ותפקוד של PAsp (DET) כדי לשפר את endosomalלברוח (לפרטים, ראה דיון) 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את לוציפראז pDNA קידוד Gaussia, לוציפראז GL4, או אריתרופויאטין על ידי שיבוט המקטע המבטא את הגנים המתאימים לפלסמיד pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) כדי לקבל ביטוי תחת האמרגן / משפר CAG באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. להגביר את pDNA בזן coli Escherichia מוסמך ולטהר אותו באמצעות מערכת טיהור פלסמיד דנ&quot;א ללא רעלן פנימי. קבע את ריכוז pDNA בספיגה של 260 ננומטר כדי להשיג פתרון / מיליליטר 150 מיקרוגרם בחיץ 10 מ&quot;מ HEPES (pH 7.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את nanomicelles polyplex, ומערבב היטב פתרון pDNA (150 / מיליליטר מיקרוגרם ב 10 חיץ HEPES מ&quot;מ) ופתרון המעורבב מראש של שני הפולימרים ביחס של 2: 1 (לפי נפח). </li></ol> 4. ג&#39;ין Transfection לSpheroids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים (hepatocytesאו MSCs) במשך 72 שעות לאחר זריעה על צלחות micropatterned כדי לאפשר ההיווצרות של spheroids הבוגר. עבור transfection גן, להוסיף את פתרון nanomicelle polyplex 100 μl (המכיל 10 מיקרוגרם של pDNA) זה טוב לאחר החלפת מדיום התרבות עם 1 מיליליטר של מדיום טרי. המשך דגירה עם פתרון nanomicelle למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשליטה באמצעות מגיב transfection שומנים מבוסס, לערבב פתרונות pDNA עם מגיב במגיב / pDNA יחס משקל של 3. כוון את המינון הסופי של pDNA להיות שווה לשניהם מגיב שומנים מבוססי ושיטות nanomicelle. </li></ol> שחזור 5. והשתלות של Spheroids הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם 200 μl של PBS הקר ומניח את הצלחות על קרח. הערה: באופן כללי, spheroids יכול לנתק בכ -15 דק &#39;וניתן לשחזר בצורה של השעיה להשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את התאים בμl 200השעיה באמצעות מזרק עם G 23 או מחט 27 G זריקות in vivo. </li></ol> 6. הערכה של ביטוי transgene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכה במבחנה של הביטוי של בלוציפראז Gaussia מופרש במדיום התרבות, לאסוף 50-100 μl של המדיום בדיוק 24 שעות אחרי החלפה עם מדיום חדש. להעריך את הביטוי בלוציפראז באמצעות מערכת מסחרית לוציפראז renilla assay וluminometer פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: לוציפראז Gaussia נותר יציב במדיום התרבות ליותר משבוע. לכן, כדי להעריך את היעילות של ביטוי transgene בזמן אמת, להחליף בינוני עם טרי אחד לפני האיסוף בינוני המדגם. העיתוי של השינוי הבינוני יכול להיות גמיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכה in vivo של ביטוי transgene בבעלי חיים מארח לאחר השתלת תאים, להרדים BALB / עכברים בעירום ג (נקבה; 7 שבועותישן) תחת הרדמה משאיפת עם isoflurane. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בתא מחובר למכונת הרדמה כדי לספק isoflurane לתא. קח את העכבר לאחר שנרדם, והניח אותו על שולחן הניתוחים עם אוורור באמצעות מסכה. לשלוט על זרימת isoflurane כ ב0.2-0.5 L / min על ידי בדיקת התנאים של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של ההשעיה התא המכילה spheroids transfected עם pDNA להביע לוציפראז GL4 (כפי שמתואר ב4.1) לרקמה התת עורית באזור הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הזרקת D-luciferin (150 מ&quot;ג / קילוגרם; מסלול תוך ורידי), למדוד את הביטוי בלוציפראז באמצעות מערכת ההדמיה IVIS פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת ההשפעות הטיפוליות של השתלת התאים, להזריק 200 μl של ההשעיה התא המכילה spheroids transfected עם pDNA קידוד-אריתרופויאטין לרקמה התת עורית באזור הבטן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות דם על ידי דימום submandibular להשיג כ -200 μl דם 19. מדוד את ההמוגלובין והמטוקריט באמצעות נתח דגימת דם. הערה: מספר התאים להשתלה מוסדר על ידי המספר נזרע על הצלחות. למרבה הצער, קשה לקבוע את מספר התא המדויק, כי המספר בתוך spheroids לא ניתן למדוד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניסויים, למקם את העכברים על כרית חימום מחוברת עם בקר טמפרטורה עד התעוררות מהרדמה. </li></ol>

<ol>
	<li>Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroidal+aggregate+culture+of+rat+liver+cells:+histotypic+reorganization,+biomatrix+deposition,+and+maintenance+of+functional+activities.">Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities.</a> J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).</li><li>Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+cell+aggregation+for+expression+of+liver+functions+and+regeneration+demonstrated+with+primary+cultured+hepatocytes.">Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes.</a> J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).</li><li>Otsuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+multiarray+formation+of+hepatocyte+spheroids+on+a+microfabricated+PEG-brush+surface.">Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface.</a> Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li><li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties.">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li><li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential.">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li><li>Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+spheroids+underlayered+with+nonparenchymal+cells+for+biomedical+applications.">Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications.</a> IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).</li><li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+reconstruction+with+tissue-engineered+cell+sheets+composed+of+autologous+oral+mucosal+epithelium.">Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium.</a> N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+two-+and+three-dimensional+liver+systems+in+vivo+using+hepatic+tissue+sheets.">Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets.</a> Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).</li><li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+cell+sheet+transplantation+improves+damaged+heart+function+via+superior+cell+survival+in+comparison+with+dissociated+cell+injection.">Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection.</a> Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li><li>Itaka, K., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+polyplex+nanomicelles+for+plasmid+DNA+delivery.">Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery.</a> Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).</li><li>Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfection+to+spheroid+culture+system+on+micropatterned+culture+plate+by+polyplex+nanomicelle:+a+novel+platform+of+genetically-modified+cell+transplantation.">Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation.</a> Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).</li><li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver.">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Tateno, C., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+adult+rat+hepatocytes+that+undergo+multiple+cell+divisions+and+express+normal+parenchymal+phenotypes.">Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes.</a> Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).</li><li>Kanayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PEG-based+biocompatible+block+catiomer+with+high+buffering+capacity+for+the+construction+of+polyplex+micelles+showing+efficient+gene+transfer+toward+primary+cells.">A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells.</a> ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).</li><li>Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polyamino+acid-based+polycations+as+safe+and+effective+gene+carrier+minimizing+cumulative+toxicity.">Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity.</a> Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).</li><li>Uchida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+Polyplex+With+Optimized+PEG+Shielding+Enhances+Gene+Introduction+in+Lungs+by+Minimizing+Inflammatory+Responses.">PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses.</a> Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).</li><li>Uchida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+spheroid+system+with+genetic+modification+for+cell+transplantation+therapy.">An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy.</a> Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בפרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לשמור על מבנה 3D של spheroids במהלך השלבים של מבוא גן והתאוששות אליפטית. זה חיוני כדי לשמור על מייקרו-סביבות נוחים לתאים, כדי למנוע מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. לדוגמא, הפרשת אלבומין, פונקציה מולדת נציג hepatocytes, נשמרה היטב בspheroids hepatocyte, בעוד ...

טיפול השתלת תאים משך תשומת לב נרחבת לטיפול במחלות שונות סוררות. הפעילות וזמן מחצית החיים של גורמים ביו המופרשים על ידי התאים המושתלים הם חיוניים ליעילות טיפולית משופרת של מערכת השתלת תאים. הנדסה גנטית של התאים לפני ההשתלה היא טכניקה מועילה להסדיר ולטפל פונקציות סלולריות, כולל ההפרשה של הגורמים ביו. כמו כן, חשוב לשמור על מייקרו-סביבה נוחה לתאים למניעת מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. תרבות תלת ממדי תא (3D) אליפטית, שבו אינטראקציות תא אל התא נשמרות היטב, מבטיחה למטרה זו, למשל, לשיפור הפרשת אלבומין מhepatocytes העיקרי וקידום בידול רב שושלת מתאי גזע mesenchymal (MSCs ) 1-7. במחקר זה, מערכת שילוב רומן של spheroiתרבות ד וtransfection הגן משמש לשמש כפלטפורמה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. ליצירת תאי אליפטית, משמשת מערכת תרבות אליפטית על צלחות תרבות micropatterned. על צלחות אלה, אזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר ערוכים באופן קבוע באופן דו-ממדי ומוקפים באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG 3. על ידי זריעת מספר מספיק של תאים, מערכים של spheroids 3D של 100 מיקרומטר בקוטר נוצרים מתאים למיטת תרבות micropatterned. Spheroids הם התאוששו מבלי לשבש את המבנה שלהם 3D באמצעות צלחות תרבית תאי thermosensitive, שמצופים בפולימר thermosensitive, פולי (ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. ארכיטקטורת micropatterned בנויה על צלחות thermosensitive (שנבנה מותאם אישית). פשוט על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, spheroids מנותק מהמיטה התרבות ולפזרד בפוספט שנאגרו מלוח (PBS). לפיכך, ניתן להשיג מספר רב של spheroids עם גודל אחיד של 100 מיקרומטר בצורה של השעיה להזרקה. <img alt="איור 1" p="" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג סכמטי של מערכת תרבות אליפטית על צלחת micropatterned. שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex. הוא מורכב מפלסמיד דנ&quot;א (pDNA) וקופולימרים לחסום -polycation פוליאתילן גליקול (PEG) 11. יש לי אלה מבנה ליבה-קליפה אופיינית מורכב מפגז PEG וליבה פנימית של pDNA תמצית, המאפשר הקדמת גן בטוחה ויעילה לתאים למטרות טיפוליות 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תי</a>דמות של. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig2.jpg" /> איור 2. מבנה של nanomicelle polyplex שהוקם על ידי המורכב של חומצות גרעין וקופולימרים לחסום PEG-הגוש-polycation. במחקר זה, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שמבנה אליפטית לא יופרע במהלך transfection גן על ידי nanomicelles. לאחר transfections תיווך nanomicelle של spheroids hepatocyte העיקרי עכברוש, ביטוי transgene ממושך מתקבל ליותר מחודש עם הפרשת אלבומין רציפה מhepatocytes ברמה דומה לזו של spheroids untransfected 12. ביטוי transgene והפרשת אלבומין מspheroids גם נשמרים לאחר התאוששות מהצלחות thermosensitive. ברור שnanomicelles יכול להקל מבוא גן בבטחה מבלי לפגוע בפונקציות המולדת של ממולחatocytes. לפיכך, שילוב של תאי אליפטית תרבותיים על צלחות micropatterned thermosensitive עם מבוא גן באמצעות nanomicelles היא פלטפורמה מבטיחה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Glut</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>041-18861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>141-01202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (hEGF)</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>PT10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-able multi-well plates</td>
			<td>Toyo Gosei</td>
			<td>PP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermosensitive cell culture plates (Upcell)</td>
			<td>CellSeed Inc</td>
			<td></td>
			<td>The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4 Luciferase Reporter Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDNA expressing Gaussia luciferase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N8082S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse erhthropoietin-expressing vector</td>
			<td>Origene</td>
			<td>MC208445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-GS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945; competent cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-free plasmid DNA purification system</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NucleoBond Xtra EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>639-00951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GloMax&#8482; 96 Microplate Luminometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Imaging System</td>
			<td>Xenogen Corp.</td>
			<td>Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood sample analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>pocH-100i Automated Hematology Analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene transfection toward spheroid cells on micropatterned culture plates for genetically-modified cell transplantation

כדי לשפר את היעילות הטיפולית של השתלת תאים, מערכת השתלה, spheroids זריקות מהונדס גנטי פותחה. Spheroids התא ערוכים מערכת תרבות על צלחות micropatterned מצופות פולימר thermosensitive. מספר spheroids נוצרים על הצלחות, מתאים לאזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר הערוך באופן קבוע באופן דו-ממדי, מוקפים באזורים שאינם דבקים שהם מצופים בפוליאתילן גליקול מטריצה ​​(PEG). ניתן לשחזר בקלות spheroids כהשעיה נוזלית על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, והמבנה שלהם נשמר היטב על ידי עובר אותם באמצעות מחטי הזרקה עם קליבר גדול מספיק (מעל 27 G). שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex, אשר מסוגל החדרת גנים לתאים מבלי לשבש את מבנה אליפטית. לחסודspheroids hepatocyte ארי transfected עם גן להביע לוציפראז, לוציפראז מתקבל בר קיימא בבעלי חיים מושתלים, יחד עם פונקצית hepatocyte נשמר, כפי שצוין על ידי ביטוי אלבומין. מערכת זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי גזע mesenchymal.

transfection הגן של pDNA להביע לוציפראז Gaussia בוצע בspheroids הוקם על ידי hepatocytes או MSCs באמצעות nanomicelles polyplex או מגיב transfection שומנים מבוססי שליטה 12. Nanomicelles מושרה כמעט ללא שינוי במבנה אליפטית לעומת spheroids-transfected לא על צלחות micropatterned, ואילו מגיב השליטה שיבש באופן משמעותי את המבנה יום ?...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation at JoVE.com

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

gene-transfection-toward-spheroid-cells-on-micropatterned-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K Views.  The University of Tokyo. This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Video: Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...