הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא מאפשר ייצור יעיל בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות, שהם קריטיים ליישומי הנדסת הרקמות, פיתוח התרופות ומידול המחלות המתקדמים שלנו. היתרון הגדול של טכניקה זו הוא יכולתה לייצר כמויות גדולות של ספרואיד רקמה אחיד במהירות ובאופן חסכוני, מבטיחה את הכדאיות הגבוהה של התא, ואת איכות הספרואיד המורכב, שהוא חיוני היישומים הביו-רפואיים השונים שלנו על ידי ייצור סטרואידים ספציפיים למטופל, טכניקה זו מציעה מודל מדויק מבחינה פיזיולוגית, המאפשר מידול מדויק של מחלות, והבנה של מנגנונים מולקולריים והתנהגותיים, כולל סרטן. שיטה זו יכולה לספק תובנות על חקר הסרטן, מחלות נוירודגנרטיביות והנדסת רקמות, וניתן ליישם אותה בפיתוח תרופות וברפואה מותאמת אישית, ובכך לשפר את הבנתנו במערכות ביולוגיות שונות.
הדגמת הראייה שלנו היא קריטית מכיוון שהיא מדגימה בבירור שלבים מורכבים, כגון החדרת מכשירים וזריעת תאים, מסייעת במניעת שגיאות נפוצות ומבטיחה שטכניקה נכונה היא כרית ביטחון לתוצאות עקביות. התחל על ידי הוספת אבקת agarose לתוך אחד x PBS להכין 2% ג'ל agarose במיכל זכוכית. הומוגניזציה של המתלים בתנועות מעגליות.
הכניסו את מיכל הזכוכית למיקרוגל והגדירו את הזמן ל-30 שניות. עצור את המיקרוגל כל חמש שניות, הסר את בקבוק הזכוכית, והומוגניזציה ידנית של התמיסה בתנועות מעגליות. בצע את תהליך החימום, עד שהתמיסה מגיעה למצב של רפיון נוזלי.
לאחר מכן, מוסיפים שישה מיליליטר של תמיסת האגרוז לכל באר של צלחת שש בארות ומחכים 15 דקות או עד שהאגרוז מתמצק. לאחר מכן הכנס בעדינות את מכשיר הביו המודפס בתלת-ממד מעל האגרוז הנוזלי והמתן 30 דקות או עד שהאגרוז יתמצק. לאחר מכן להסיר בעדינות את המכשיר מן agarose ולהוסיף שני מיליליטר של מדיה DMEM.
המתן 10 דקות לפני השלכת המדיה והחלפתה ב- DMEM טרי. חזרו על הכביסה שלוש פעמים. לאחר שתסיים, הוסף שני מיליליטר DMEM ומקם את צלחת שש הבארות לזריעת תאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ו 80% לחות.
לגדל את תאי הפיברובלסטים של העכבר בצלוחיות תרבית תאים ולשמור עליהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני, עד להשגת מפגש של 80%. לאחר מכן לשטוף את התאים עם אחד x PBS ולהוסיף את אנזים דיסוציאציה. לדגור על התאים במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני ו-80% לחות.
לאחר ניתוק התאים מבקבוק תרבית התא, הוסיפו מדיום גדילה כדי לנטרל את אנזים הדיסוציאציה של התא. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולספור את התאים. ל 50 כפול 10 בחזקת חמישה תאים שנלקחו בצינור, להוסיף חמישה מיליליטר של אחד x PBS.
לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה לפני הוספת מיליליטר אחד ממדיום תרבית התאים והומוגניזציה של התמיסה. מתוך צלחת שש בארות מוכן קודם לכן, להסיר שני מיליליטר של בינוני ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיית התא למרכז תבנית agarose שנוצר על ידי מכשיר ביו מודפס 3D.
המתינו 20 עד 30 דקות עד שהתאים ישקעו במיקרו כריתות לפני הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים לבאר. הניחו את צלחת שש הקידוחים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-24 עד 48 שעות להיווצרות כדורית רקמות. המכשיר דמוי הבול המודפס בתלת-ממד המורכב מסיכות מיקרו גליליות יוצר בהצלחה בשיטת הסטריאוליתוגרפיה באמצעות שרף הניתן לריפוי.
המכשיר היה פשוט, קל לחיטוי, רב פעמי וניתן לכוונון בגדלים שונים של צלחות באר וצלחות פטרי. הוא יצר 750 כריתות מיקרו הומוגניות או 4, 716 לכל שש בארות צלחות. הנסיגה המוקדמת של המכשיר מהצלחת שיבשה את העובש הלא דבק ועיוותה את גיאומטריית כריתת המיקרו.
התאים שנזרעו על תבניות האגרוז הלא דבקות שיקעו ויצרו את כדורי הרקמה בערך לאחר 24 שעות. מתודולוגיה זו הדגימה בהצלחה את הייצור בקנה מידה גדול של הספרואידים על ידי שמירה על צורתם, גודלם וכדאיותם, ותמכה בתרבית הסטרואידים במשך חודשים. הדבר החשוב ביותר לזכור כאשר אני חושב על הליך זה הוא להכניס בזהירות את המכשיר כדי למנוע בועות אוויר ולהוסיף בעדינות מדיום תרבית כדי למנוע הפרעה לתאים.
לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות סמים וניתוח ביטוי גנים. מענה לשאלות על יעילות תרופות, תגובה מלוחה וגנטית לטיפולים. טכניקה זו תאפשר מחקר חדש בהנדסת רקמות וברפואה רגנרטיבית בכך שתאפשר ייצור ספרואידי בקנה מידה גדול ובאיכות גבוהה הקריטי להדפסה ביולוגית תלת-ממדית, ותשפר את איכות התא, ואת הכמות לבדיקות רעילות פרמצבטיות וקוסמטיות.
