Name: synthetic methodology for asymmetric ferrocene derived bio-conjugate systems via solid phase resin-based methodology
Uploaded: 2015-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology at JoVE.com

KG נתמכה על ידי P-1,760 מענק RA וולש הקרן, TCU אנדרוס מכון למתמטיקה וחינוך מדעי (לק&quot;ג), מחקר TCU ויצירתיות הפעילות גרנט (לק&quot;ג) וTCU SERC גרנט (לJHS).

1. סינתזה של ביוטין-FC-ציסטאין (1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטות שלב מוצקות לייצר שרף הנכנס 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שרף ביוטין טעון (250 מ&quot;ג, 0.145 mmol) לתוך מזרק fritted ולהתנפח השרף על ידי ציור את dimethylformamide (5 מיליליטר) ולוחץ את המזרק על שייקר מעבדה במשך 20 דקות. לגרש את הפתרון ולחזור dimethylformamide נפיחות עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קבוצת הגנת Fmoc על ידי הוספת 4-6 מיליליטר של piperidine 20% בdimethylformamide למזרק ואחרי 10-15 דקות של רועד. חזור על תהליך deprotection עם עוד 4-6 מיליליטר של piperidine. לשטוף את השרף עם רצף של dimethylformamide 3x, 3x dimethylformamide: מתנול (1: 1), מתנול 3x: dichloromethane (1: 1), dichloromethane 3x, ~ 5 מיליליטר כל אחד. האם מבחן ninhydrin (+) בדגימה קטנה (~ 10) של חרוזים כדי לאשר deprotection מוצלח על ידי הנוכחות של כחול על חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים תמיסה המכילה חומצה 1&#39;-Fmoc-אמינו--1-קרבוקסיליות ferrocene(203.3 מ&quot;ג, .4350 mmol), 1-hydroxybenzotriazole מימה (מ&quot;ג 58.8, .413 mmol), diisopropyl carbodiimide (.0673 מיליליטר, .435 mmol), (.0757 מיליליטר, .435 mmol) diisopropyl אתיל אמין, ו4: תערובת 1 של dichloromethane ו dimethylformamide. לצייר את זה לתוך מזרק fritted ועדינות לנער על מעבדה שייקר במשך 6 שעות. ואז לגרש את הפתרון מן המזרק ולשטוף כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את בדיקת ninhydrin (-) כפי שתואר לעיל כדי לאשר צימוד. מבחן ninhydrin עדיין יכול להיות שימושי במאשר צימוד למרות הצבע הכתום של חרוז נגזר מהחיבור של הברזל המכיל מחצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להסיר את קבוצת Fmoc על ידי התוספת של 20% בpiperidine dimethylformamide ורחץ כפי שתואר לעיל. מבחן ninhydrin (+) יש להשתמש כדי לאשר את הסרת Fmoc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן, 1-hydroxybenzotriazole מימה (מ&quot;ג 58.8, .4125 mmol), diisopropyl carbodiimide פתרון המורכב מFmoc-Cys (TRT) אה (254.8 מ&quot;ג, .4350 mmol) (.0673 מיליליטר, .4350mmol), diisopropyl אמין אתיל (.0757 מיליליטר, .4350 mmol), ושל 4: 1 תערובת של dichloromethane וdimethylformamide. הוסף קוקטייל צימוד ציסטאין זה מזרק fritted ועדינות לנער במשך 6 שעות. לשטוף באמצעות הפרוטוקול שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר צימוד באמצעות בדיקת ninhydrin (-), ואחריו ההסרה של רכיב Fmoc עם piperidine 20% וכביסה. ודא מסוף החופשי אמין באמצעות בדיקת ninhydrin (+). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחשוף של 1 מהשרף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של TFA (9.45 מיליליטר), מים (0.25 מיליליטר), 1,2-ethanedithiol (0.25 מיליליטר), וsilane triisopropyl (0.1 מיליליטר), להוסיף אותו למזרק וללחוץ בעדינות במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הפתרון חום-אדום וכתוצאה מכך צינור Eppendorf ולהתאדות TFA באמצעות זרם של אוויר לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת אתר diethyl קר (~ 15 מיליליטר) לצינור Eppendorf כדי לזרז 1, אשר יהווה תסיסה עדינה. לבודד את המוצר באמצעות צנטריפוגה (ז 1, 5 דקות). Tמחזורים חוזרים תרנגולת של כביסות אתר diethyl (~ 60 מיליליטר סה&quot;כ) ו צנטריפוגות כדי להשיג 1 כאדום / חום מוצק. </li></ol></li></ol> 2. אפיון וניתוח של 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהזהות תואמת את הקישוריות והרכב שמוצג באיור 2 באמצעות H 1 (16 סריקות) ו- 13 C NMR (512 סריקות) במתנול deuterated (300 μl) וניתוח ESI-MS. מצפה את התוצאות הבאות: 1 ספקטרום NMR H (CD 3 OD) δ / עמודים לדקה: 1.407-1.684 (מ &#39;, 6 שעות), 2.245 (t, 2H), 2.665-3.150 (מ&#39;, 12H), 4.015 (t, 1H), 4.104 (ד, 2H ), 4.274 (q, 1H), 4.426 (ד, 2H), 4.479 (q, 1H), 4.595 (t, 1H) ו -13 ספקטרום NMR C (CD 3 OD) δ / עמודים לדקה: 24.644 (CH 2), 25.472 (CH 2), 28.051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35.474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39.241 (CH 2), 39.717 (CH 2), 55.340 / 55.538 (CP-טבעת), 60.286 (CH), 61.964 (CH), 62.521 / 62.821 (CP-טבעת), 66.038 / 66.170 (CP-טבעת), 69.153 / 69.328 (CP-טבעת), 71.468 / 71.593 (CP-טבעת), 76.466 (CH), 171.770 (C = O), 175.361 (C = O). ESI-MS (m / z): נמצא: 639.00 [1 + Na] +, תיאורטי: 639.1 [1 + Na] + וHR-MS (m / z): נמצא: 617.2049 [1 + H] +, תיאורטי: 617.1622 [1 + H] +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע HPLC, ניתוח יסודות כדי לאשר את ההרכב של 1 מבודד. לבצע chromatograms HPLC באמצעות C8 הפוך טור שלב עם 100% MeOH בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה. הערה: פעמים שמירת HPLC היו: 3.198-4.674 דקות. </li></ol> 3. קיבוע של 1 על משטח זהב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולימר Cut מגובה שקופיות זהב לריבועים של ~ 0.25 ב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא כוס 50 מיליליטר עם פתרון מים DI של 1 (~ 1 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את שקופיות זהב לכוס ומכסה בזכוכית שעון. כלow שקופיות הזכוכית כדי לדגור O / N ב RT ללא תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שקופית זהב מהפתרון ולאפשר לו להתייבש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים (או שווה ערך) כדי לצפות במשותק 1. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הסינתזה של נגזרי ferrocene סימטריים מאתגרת בפתרון. לדוגמא, מנסה לייצר 1 בפתרון הביא לתשואות נמוכות של המוצר הרצוי (פחות מ -20%). כמו כן, תגובות ניצול 1&#39;-אמינו-ferrocene חומצה קרבוקסילית (sans Fmoc) וביוטין מחויב השרף הביאו מוצר מסיס בקנה אחד עם מוצר polymerized שדווח על ידי <em...

חיישנים ביולוגיים הם התקנים קטנים המעסיקים טכנולוגיית זיהוי biomolecular כפלטפורמה לניתוח סלקטיביים, ומנוצלים לספציפיות שלהם, מהירות, ובעלות נמוכה. biosensors אלקטרוכימי לגילוי מולקולות הביולוגיים הוא בחוד החנית של תחום זה בשל הפשטות שלהם, עלות תועלת, ורגישות גבוהה. 1,3 האנטומיה הכללית של חיישנים אלה היא אלקטרודה מצוידת במולקולת הכרה ספציפית לסמן הביולוגי של עניין . הכריכה של הסמן הביולוגי על ידי מולקולת ההכרה מביאה לשינוי מקומי של פוטנציאל או נוכחי שיכול להיות מזוהה על ידי מדידה פשוטה. עד כה מחצית ההכרה יכולה לנוע בין אנזימים, נוגדנים 4-8, 9-12 תאים שלמים, 13-16 קולטנים, 17-20 פפטידים 21-23 ו -24 DNA והתמקד בעיקר במולקולות גדולות יותר, ביולוגיות. מחקר 25-28 מאמצים בתחום זה התמקדו בעיקר בimmunosensors wheמחדש אימונוגלובולינים הוא משותק עם ליבה פעילה חיזור (כגון ferrocene) ומשמשים לאיתור נוגדנים של עניין. מחקרים אלה לא נכללו ביישומים קליניים בשל דיוק עני וצריכת זמן נובעים מהסיבוכים הנובעים משימוש של אנטיגן / נוגדנים. תשומת לב גוברת 1,3 התמקדה בזיהוי של מולקולות קטנות (פחות מ 1 קילוגרם / mol) של יו-רפואי , מזון ואיכות הסביבה ריבית בנוסף לביטחון לאומי. 29 דוגמאות הידועות ביותר של התקני biosensor הם צגי גלוקוז בדיקה עצמית, שיש להם אלקטרודות אנזים מסך מודפסות מצמידים את מד אמפרומטריים כיס בגודל. מערכות אלו בדרך כלל לנצל שיטת coulometric כאשר הסכום הכולל של מטען שנוצר על ידי תגובת חמצון הגלוקוז נמדד על פני תקופה של זמן. מכשירים סחירים חייבים להיות ניידים, חזקים והחזיק ביד לעשות שימוש קליל לאוכלוסייה בכללותה. תגי חיזור כגון ferrocene הם necessaר&quot;י לספק זיהוי אלקטרוכימי של סמנים ביולוגיים או מולקולות קטנות בפתרון כמו רוב הסמנים הביולוגיים אינם במהות אלקטרוכימי פעילים. 30-38 Ferrocene היא מולקולה אורגנה-מתכתית שהיא סטנדרט זהב לאלקטרוכימיה, מה שהופך אותו לבחירה מצוינת להשתלבות biosensors אלקטרוכימיים. מינים פעילים חיזור מבוסס Ferrocene כבר זכו לתשומת לב רבה בשל גודלם הקטן, יציבות טובה, גישה נוחה סינתטית, שינוי כימי קל, lipophilicity היחסי, וקלות כוונון חיזור. 3,30-42 מולקולות קטנות המבוססים על הליבה שיש לי ferrocene נעשה שימוש נרחב כגלאים של יוני מתכת ומולקולות קטנות. 32-38,43 מערכות מיקוד מינים גדולים כגון מולקולות ביולוגיות נצלו את הקובץ המצורף של נוגדנים או אימונוגלובולינים גדולים לנגזרי ferrocene שכבר מוטבעים על גבי משטח אלקטרוכימיים. 1,3,39 , 44 בכל מקרה, התעצם הפוטנציאלי ונוכחיty של בני זוג רדוקס Fe III / II Fe שונה על צימוד מולקולרי, ובכך לייצר ידית ספקטרוסקופיות חדשה המעידה על הנוכחות של המולקולה אנליטי. שינוי זה נובע מהחפיפה הנרחבת המתרחשת בין pi-המערכת של טבעות cyclopentadienyl וד-אורביטלי הברזל. אם pi-המערכת היא שונה, כלומר, derivatized או הגיב, אז האינטראקציה מסלולית, בתורו, שינוי. זה ישפיע על הליבה פה וניתן לראות כשינוי בפוטנציאל של בני זוג Fe III / II פה. 40,45,46 תכונות אלו הופכות את מערכת כזו אטרקטיבית לשימוש כסוכן כימות בimmunoassay או biosensor אלקטרוכימי. על מנת לייצר מערכות ferrocene מכיל ספציפיות ליכולות biosensor זה הוא אופטימלי לשנות טבעת Cp אחד עם יו-קולטן ספציפי למולקולת מטרה ולנצל את טבעת Cp אחרת כמו לקשור מולקולרי לקריאה או elec אלקטרוכימייםtrode (איור 1). הסינתזה של נגזרי ferrocene א-סימטריים אלה נתקל בתגובות לוואי והיווצרותם של מיני dimeric ופולימרים נוצרו על cross-linking מולקולאריים. 47 עם זאת, כימיה צימוד ייצור קשר אמיד היא הדרך הישירה ביותר כדי לספק נגזרים פשוטים של ferrocene מעורב רכיבים ביולוגיים כגון כפפטידים ומטבוליטים שלהם. לכן, ניתן ליישם טכניקות שלב מוצקות ראשון שפותחו בשנת 1950 על ידי Merrifield לסינתזת פפטיד לתרכובות אורגנו-מתכתיות המכילות ferrocene. באמצעות השימוש במולקולה להחליף orthogonally 1-קרבוקסיליות 1&#39;-Fmoc-אמינו-ferrocene-החומצה, מערכת ferrocene שיכול להכיל מחצית קולט (ביוטין), קריאה אלקטרוכימיים (ferrocene), ומרכיב משתק-מקשר (ציסטאין) יש נבנה ומפורט במסמך זה. הסינתזה של ביו-המצומד זה נדונה, כמו גם ראיות לקיבוע על משטח זהב. represen עבודה זוts המצגת הראשונה של מערכת המורכבת של ביוטין, ferrocene וחומצת אמינו לקיבוע על משטח זהב.

<table><tbody><tr><td>Biotin Novatag Resin</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Acros</td><td>P/3520/PB05</td><td></td></tr><tr><td>ninhydrin test</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;rsquo;-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid</td><td>Omm Scientific</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropyl silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (20 ml)</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>dimethylformamide</td><td>any source</td><td></td><td>dry with molecular sieves prior to use &amp;amp; store in 100 ml media bottle for easy usage</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthetic methodology for asymmetric ferrocene derived bio-conjugate systems via solid phase resin-based methodology

גילוי מוקדם הוא מפתח להצלחת טיפול ברוב המחלות, והכרחי במיוחד לאבחון וטיפול בסוגים רבים של הסרטן. הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש הן הדמיה שיטות כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), Positron פליטת טופוגרפיה (PET), וממוחשב טופוגרפיה (CT) והם אופטימליים להבנת המבנה הפיזי של המחלה, אך יכולות להתבצע רק פעם אחת בכל ארבעה עד שישה שבועות עקב השימוש של סוכני הדמיה ועלות כוללת. עם זה בחשבון, כמו ההתפתחות של &quot;נקודת הטיפול&quot; טכניקות, כגון חיישנים ביולוגיים, המעריכים את השלב של מחלה ו / או יעילות של טיפול במשרדו של המטפל ולעשות זאת מבעוד מועד, היה לחולל מהפכה פרוטוקולי טיפול. 1 אמצעי לחקר biosensors ferrocene מבוסס על זיהוי של מולקולות ביולוגיות רלוונטיות 2, שיטות פותחו כדי לייצר ביו-conjugates ferrocene ביוטין המתואר כאן. דו&quot;ח זה יתמקד במערכת ביוטין-ferrocene-ציסטאין שיכול להיות משותקת על משטח זהב.

הטופס מחויב השרף של 1 מוצג באיור 2. הקובץ המצורף קוולנטיים של רכיב ferrocene מוליד גוון כתום לחרוזי השרף שהוא עקשן עם שטיפה רציפה ומעיד על ברזל משותק מכיל מורכב בניגוד לספיגת ברזל על ידי מרכיב PEG של גרגרי השרף. הטופס ללא שרף של 1 הוא זהה בצבע לחרוז?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology at JoVE.com

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

מתודולוגיה סינתטית למערכות ביו-המצומד Asymmetric Ferrocene נגזרו באמצעות מתודולוגיה המבוססת על שרף שלב מוצקה

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

synthetic-methodology-for-asymmetric-ferrocene-derived-bio-conjugate

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.6K Views.  Texas Christian University. The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Video: Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as Ru(II), Pt(II), and Rh(III). The compound, named as a water-soluble metal-organic complex array (WSMOCA), is obtained through 1) the conventional solution-chemistry-based preparation of the corresponding metal complex monomers having a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protected amino acid moiety and 2) their sequential coupling together with other water-soluble organic building units on the surface-functionalized polymeric resin by following the procedures originally developed for the solid-phase synthesis of polypeptides, with proper modifications. Traces of reactions determined by mass spectrometric analysis at the representative coupling steps in stage 2 confirm the selective construction of a predetermined sequence of metal centers along with the peptide backbone. The WSMOCA cleaved from the resin at the end of stage 2 has a certain level of solubility in aqueous media dependent on the pH value and/or salt content, which is useful for the purification of the compound.

A potential general method for the synthesis of water-soluble multimetallic peptidic arrays containing a predetermined sequence of metal centers is presented.

סינתזה של מערך מורכב מתכת-אורגנית נמס במים

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

בניית Thioether/ויניל גופרתי-קשורה Hydrothiolation תיול-ene/yne הנוצרות על-ידי פפטידים הסליל באמצעות צילום

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of solid-phase synthesis, regenerating Michael (REM) linker strategies, and 1,3-dipolar cycloaddition, a library of structurally similar heterocycles, both with and without a spirocyclic center, can be constructed. The main advantages of the solid-support synthesis are as follows: first, each reaction step can be driven to completion using a large excess of reagents resulting in high yields; next, the use of commercially available starting materials and reagents keep the costs low; finally, the reaction steps are easy to purify via simple filtration. The REM linker strategy is attractive because of its recyclability and traceless nature. Once a reaction scheme is completed, the linker can be reused multiple times. In a typical solid-phase synthesis, the product contains either a part of or the whole linker, which can prove undesirable. The REM linker is &#34;traceless&#34; and the point of attachment between the product and the polymer is indistinguishable. The high diastereoselectivity of the intramolecular 1,3-dipolar cycloaddition is well documented. Limited by the insolubility of the solid support, the reaction progression can only be monitored by a change in the functional groups (if any) via infrared (IR) spectroscopy. Thus, the structural identification of intermediates cannot be characterized by conventional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Other limitations to this method stem from the compatibilities of the polymer/linker to the desired chemical reaction scheme. Herein we report a protocol that allows for the convenient production of spirocyclic heterocycles that, with simple modifications, can be automated with high-throughput techniques.

Here we present a protocol to demonstrate an efficient method for the synthesis of spirocyclic heterocycles. The five-step process utilizes solid-phase synthesis and regenerating Michael linker strategies. Generally difficult to synthesize, we present a customizable method for the synthesis of spirocyclic molecules otherwise inaccessible to other modern approaches.

מוצק-שלב הסינתזה של Oximes Spirocyclic [4.4]

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Biochemistry

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Biology

Solid Phase Synthesis

Source: Vy M. Dong and Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield&#39;s solid-phase synthesis is a Nobel Prize winning invention where a reactant molecule is bound on a solid support and undergoes successive chemical reactions to form a desired compound. When the molecules are bound to a solid support, excess reagents and byproducts can be removed by washing away the impurities, while the target compound remains bound to the resin. Specifically, we will showcase an example of solid-phase peptide synthesis (SPPS) to demonstrate this concept.

Solid Phase Synthesis: Principles, Peptide Synthesis

סינתזת פאזה מוצקה

Source: Vy M. Dong and Diane Le, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Merrifield&#39;s solid-phase synthesis is a Nobel Prize ...

מתודולוגיה סינתטית למערכות ביו-המצומד Asymmetric Ferrocene נגזרו באמצעות מתודולוגיה המבוססת על שרף שלב מוצקה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

סינתזה של חלבון Bioconjugates