We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.

1. הכנת כלי הזכוכית ומרכבי סינון <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם צוין אחרת, לעקר את כל כלי הזכוכית, המארזים ופתרונות הסינון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להבטיח סטריליות, לכסות את כל הפתחים או משטחים חשופים או עם רדיד אלומיניום או נייר מובטח קלטת לפני העיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מנגנון סינון על ידי הצמדת בית מסנן (קוטר 47 מ&quot;מ) לארלנמייר זרוע צד L 1. לאסוף מסננים הנדרשים: מסנני דיסק electropositive / אלקטרו-47 מ&quot;מ קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמצית 1 L של 1.5% בשר בקר (flocculating; מייצר חלקיקי floc כאשר pH של תמיסה הוא הוריד ל -3.5, או שאינו flocculating; שלא מצטבר ב- pH 3.5), עם 0.05 מ &#39;גליצין, על ידי המסת 15 גרם של תמצית בשר בקר ב 1 ליטר של מים deionized והוספת 3.75 גליצין g. הערה: תמציות בשר בקר ללא flocculating תדרוש תוספת של celite לפני ריכוז שלישוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף polyph נתרן תוסף elutionosphate לתמצית בשר בקר בריכוז 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון חומצה הידרוכלורית M 1, טיפה חכמה, לערבוב תמצית בשר בקר, פתרון pH לpH הרצוי. תמצית בשר בקר החיטוי במשך 15-30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 0.1 גרם של קנס, בינוני, או celite חלקיקים הגדול (לשימוש עם תמצית בשר בקר שאינו flocculating בלבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ואקום / יניקה על ידי הצמדת צינור תואם לבקבוק בצד זרוע Erlenmeyer ולשקע ואקום. </li></ol> 2. הכנת הפתרונות ומניות וירוס <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 של 1 M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PBS 1x (137 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 1.47 מ&quot;מ K 2 PO 4, ו -4.3 מ&quot;מ לאא 2 PO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של 1x PBS ל 9.0 באמצעות 1 M NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולדלל מניות וירוס עד 10 4 5 -10 מספר הסביר ביותר (MPN) מיליליטר -1 ידי ערבוב 1 מיליליטר של מניית וירוס עם 9 מיליליטר של PBS (pH7), כפי שתואר לעיל 8,13. חנות ב -80 ° C בaliquots 1 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מניות וירוס על ידי סינון מזרק (0.22 מיקרומטר גודל נקבובית) להסרת מזהמים פוטנציאליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechlorinated ברז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד 1 ליטר של מים ברז סטרילי באמצעות סטרילי סיים גליל ויוצקים לתוך מבחנה המכילה 2 ליטר בר מערבבים מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.7 גרם של נתרן תיוסולפט ומערבבים עד שגרגרים לפזר. התאם את ה- pH של מים ברז ל7-7.5 במידת הצורך באמצעות 1 M HCl או 1 פתרון M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק וירוס הפשרה (1 מיליליטר) ולהוסיף נפח שלם של ספייק לי 1 ליטר של מים ברז סטרילי dechlorinated. מערבבים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריק שיטה (מי ברז dechlorinated ללא אדנווירוס) עם כל ניסוי ותהליך באופן זהה למדגם ממוסמר. </li></ol></li></ol> 3. הכנת מכשירי סינון Millipore <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כיסוי סטרילי מעל בית מסנן. ודאהתאמה נכונה בין בית המסנן קערה עליונה ומסך מסנן נמוך כדי למנוע דליפה מדגם במהלך סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כיסוי סטרילי מבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. ודא שהפקק של יחידת המסנן מתאים בנוחות בפתח העליון של ארלנמייר, יצירת חותם טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קערה העליונה של יחידת מסנן מהמסך מסנן נמוך, ולמקם את מסנן electropositive דיסק 47 מ&quot;מ ישר מעל מסך עם מלקחיים סטרילית. צרף קערת בית מסנן למסך תחתון וננעלו במקומו על ידי סיבוב נגד כיוון השעון. </li></ol> 4. סינון מי ברז (ריכוז ראשי) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד של וירוס 100 מיליליטר זינק ברז מים באמצעות סטרילי סיים גליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים של וירוס 100 מיליליטר זינק ברז מים לבית מסנן המכיל גם 47 מ&quot;מ זכוכית קפלים / מסנן תאית או מסנן סיבי דיסק ננו-אלומינה / זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפשר למים לעבור באיטיות דרך מסנן. החל ואקום עדין להסרת שאריות שנותרו oמים ברז ו ממשטח מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות טיפול טריפסין, להוסיף 5 מיליליטר של טריפסין 0.25% לסינון שטח ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טריפסין ממשטח מסנן באמצעות 50 מיליליטר של מים סטריליים deionized. </li></ol> 5. Elution וירוס ממסנן <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בית מסנן מבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer, והנח על בקבוק 250 מיליליטר בצד זרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר באמצעות סיים גליל. לאט לאט לשפוך של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר לבית מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתמצית בשר בקר לשפוך דרך מסנן, לכידת תמצית בשר בקר ב( 250 מיליליטר) בקבוק קטן Erlenmeyer. החל ואקום למשוך באמצעות תמצית בשר בקר שייר ממסנן. </li></ol> 6. ריכוז משני Celite <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות העברה המכילות וירוסי eluted לצלחת ומערבבים. להוסיף בר סטרילי מגנטי מערבבים ומניחים על צלחת ומערבבים, ערבוב כדי ליצור מערבולת קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.1 גרם של celiteאבקה לתמצית בשר בקר 100 מיליליטר ולאפשר celite להתפזר. הנח בדיקה pH סטרילי לתוך תמצית בשר בקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף טיפה חכמה 1 M HCl לתמצית בשר בקר להשיג pH 4.0. לאפשר לערבב לאט במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 47 מ&quot;מ מראש מסנן על בית מסנן (כפי שתואר לעיל) באמצעות בקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מיליליטר תמצית בשר בקר / תערובת celite מעל לפני מסנן. לאפשר לתמצית בשר בקר לשפוך דרך. החל ואקום קל למשוך דרך לחלץ בשר שייר ממסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קליפ צינור מתכת בסוף זרבובית בית המסנן. צרף צינור איסוף פוליפרופילן סטרילי 15 מיליליטר לקליפ צינור מתכת. הנח בית מסנן בחזרה לארלנמייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של חיץ 1x PBS, pH 9.0 מעל celite נאסף על קדם-מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר PBS לטפטף דרך קדם-מסנן. החל ואקום קל למשוך דרך PBS שייר ל -15 מיליליטר צינור איסוף. </li></ol> ריכוז משני הפתתה אורגנית 7. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">העבר את הכוסות המכילות את נגיף eluted לצלחת ומערבבים. להוסיף בר ומערבב מגנטי סטרילי של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר ומערבבים כדי ליצור מערבולת קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בדיקה pH סטרילי לתוך תמצית בשר בקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 טיפת M HCl חכמה תמצית בשר בקר ולהתאים את ה- pH 3.5. לערבב למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את eluate לתוך 250 מיליליטר צינורות חרוטי צנטריפוגה ו צנטריפוגות ב 2500 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את טיפול לקיחת supernatant לא לא לשבש את גלולה. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר של 1x PBS, pH 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב 4000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH ל7-7.5, מסנן לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 8. ויראלי חומצות גרעין Extraction <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ חומצות גרעין נגיפיות באמצעות ערכה מסחרית מתאימה בהתאם להוראות יצרן. </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 9. עו&quot;ד 40/41 qPCR <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצבעי יסוד ובדיקות, כמו גם תערובת תגובה ופרופילי רכיבה תרמית כפי שפורסם 8,13. הערה: מגבלה משוערת של גילוי עבור assay היא כ 5 יחידות qPCR לכל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מרכיבי תערובות ההגברה PCR בריכוזים כדלקמן: 10 מ&quot;מ טריס (pH 8.3), 50 מ&quot;מ KCl, 4.5 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מ&quot;מ dNTPs, 10 מיקרומטר פריימרים ובדיקת 1 מיקרומטר ו 0.5 μl של פולימראז כך שכמויות סופיות של 45 ניתן להוסיף μl למספר מתאים של בארות בצלחת תגובת 96-גם PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 45 μl של תערובת ההגברה PCR היטב כל אחד המתאים של 96-היטב, תגובה מהירה צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של DNA שחולץ מדגם לבארות מתאימות של צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי צלחת עם כיסוי עמיד חותם חום, לסובב את הצלחת לעבור כל טיפות לתחתית בארות צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזורי הגברה PCR קבעו כfollOWS: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחרי 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. </li></ol> 10. ניתוח נתונים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מדידות בשלושה עותקים של דילולים פי 5 הסידוריים של הדגימות פורש 1: 5 ל -1: טווח 625 דילול כדי לקבוע את המספר הסביר ביותר (MPN) של החלקיקים הנגיפיים, כפי שתואר בעבר 8,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דילולים פי 5 סידוריים של קוצים ניסיוניים אדנווירוס פורש 1: 5 ל -1: מגוון 15625 דילול כדי לקבוע את המספר הסביר ביותר (MPN) של החלקיקים הנגיפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחשבון EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), להתאים את המחשבון לחשבון לסוג של דילול (1: 5 או 1:10), מספר דילולים ביצע, ומספר לשכפל דגימות סדרת דילול ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כניסה 10 טרנספורמציה של הנתונים, ואחריו נרמול ליחידת הנפח (מיליליטר לדוגמא, 1, 100 מיליליטר, וכו &#39; </em&gt;). לחשב החלמה לניסוי נתון על ידי חלוקת מספר החלקיקים נגיפיים נוכחים במדגם מתרכז עם מספר החלקיקים הנגיפיים נוכחים בקוצים ניסיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ההשפעה של המשתנים הניסיוניים השונים (למשל, סוגים שונים celite, טווחי pH, סוגים שונים של מסנן וטכניקות ריכוז משניים שונות) על החלמה עו&quot;ד על ידי ביצוע בדיקות סטטיסטיות פרמטרית או אי-פרמטרית (למשל, מבחן t מזווג, אחד או שתיים -way ANOVA) בהתאם להתפלגות של הנתונים ועיצוב ניסיוני. </li></ol>

<ol>
	<li>Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+in+recreational+water-borne+disease+outbreaks:+a+review.">Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).</li><li>Westrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+outbreaks+linked+to+oyster+consumption+in+the+United+Kingdom.">Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.</a> Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).</li><li>Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+enteric+viruses+for+fecal+pollution+source+tracking+in+environmental+waters.">Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters.</a> Environment International. 45, 151-164 (2012).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).</li><li>McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+celite+secondary+concentration+procedure+and+an+alternate+elution+buffer+for+the+recovery+of+enteric+adenoviruses+40+and+41.">Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41.</a> Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).</li><li>Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+flocculation:+an+efficient+second-step+concentration+method+for+the+detection+of+viruses+in+tap+water.">Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas.">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47, 2797-2810 (2013).</li><li>McMinn, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adenovirus+40+and+41+recovery+from+tap+water+using+small+disk+filters.">Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).</li><li>Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+using+celite+to+concentrate+norovirus,+adenovirus+and+enterovirus+from+wastewater.">Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater.</a> Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).</li><li>Albinsson, B., Kidd, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+41+lacks+an+RGD+alpha(v)-integrin+binding+motif+on+the+penton+base+and+undergoes+delayed+uptake+in+A549+cells.">Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells.</a> Virus Research. 64, 125-136 (1999).</li><li>He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+structures+and+hydrogen+bond+network+of+high-density+and+very+high-density+amorphous+ices.">Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nine-year+study+of+the+occurrence+of+culturable+viruses+in+source+water+for+two+drinking+water+treatment+plants+and+the+influent+and+effluent+of+a+Wastewater+Treatment+Plant+in+Milwaukee,+Wisconsin.">Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin.</a> 71, 1042-1050 (2005).</li><li>Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+poliovirus+concentration+and+recovery+from+treated+wastewater+by+two+electropositive+filter+methods.">Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods.</a> Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).</li><li>Haramoto, E., Katayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+acidic+elution+to+virus+concentration+using+electropositive+filters.">Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters.</a> Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).</li><li>Hill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants.">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).</li><li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water.">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).</li><li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from+water.">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water.</a> Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).</li><li>Melnick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+robin+investigation+of+methods+for+the+recovery+of+poliovirus+from+drinking+water.">Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).</li><li>Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+purification+of+beef+extract+mock+eluates+from+water+samples+for+the+detection+of+enteroviruses,+hepatitis+A+virus,+and+Norwalk+virus+by+reverse+transcription-PCR.">Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).</li></ol>

No competing financial interests. 
The views expressed in this article are those of the authors and do not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Environmental Protection Agency. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

מסנני electropositive שימושיים בריכוז וירוסים ממים; עם זאת מסננים אלה יכולים להיות שונים במבנה שלהם ובהרכב אשר בתורו יכול לשנות את האפקטיביות שלהם. ההרכבה בעיה זו, מבני קפסיד וחיובים משתנים בין זני וירוס הדורשים טכניקות ריכוז להיות מותאמות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית ...

וירוסי enteric אדם הם סוכני סיבה חשובים של מחלות המועברות במי 1-3, אבל הם בדרך כלל נוכחים במספרים נמוכים במים המזוהמים סביבתיים, מה שהופך את איתורם קשה בלי ריכוז. נהלים המשמשים להתרכז וירוסים כוללים בדרך כלל שלב סינון, ואחריו elution מסנן, וריכוז המשני של eluate המסנן. הליך סינון נפוץ מסתמך על שימוש בממברנות טעונות כגון מסנני electropositive (נבדקו לאחרונה 4,5). מסננים אלה מסתמכים על לכידת וירוסים תלויים במים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין משטח המסנן (מטען חשמלי חיובי) וחלקיקי נגיף ממוקדים (מטען שלילי). שני מסננים electropositive כי הם זמינים באופן מסחרי להסתמך על טכנולוגיה זו, מסנני זכוכית / תאית וננו-אלומינה / סיבי זכוכית. עלויות פילטר זכוכית / תאית הן עד 10 פעמים כי ננו-אלומינה / סיבי הזכוכית, המגבילות את השימוש בזכוכית / ceמסנני llulose לניטור וירוס שיגרתי. מחקרים שנעשו לאחרונה הגיעו למסקנה הבדלים הם נומינליים בין שני מסננים אלה בהתאוששות של enteroviruses מ6,7 מים הסביבה, המצדיקים את השימוש בחלופה זולה יותר מסנן. אפשרויות סינון נוספות כגון מסנני אלקטרו וזכוכית צמר נחקרו, לעומת זאת, הם גם דורשים הטיפול המקדים של מים מקור (מסנני אלקטרו) או אינם זמינים באופן מסחרי (מסנני זכוכית צמר). הפיתוח של נהלי ריכוז וירוס בעיקר התמקד אופטימיזציה טכניקות ריכוז עיקריות (מסננים) על מנת לשפר את ההחלמה וירוס ממים. עם זאת, הליכי ריכוז משניים, המקטין את הנפח של eluant בדרך כלל מL 1 למיליליטר כרכים, יכולים גם להיות השפעה משמעותית על החלמה וירוס 8. ריכוז המשני של וירוסי enteric בדרך כלל מסתמך על סוכן flocculating כגון סוגים מסוימים של תמצית בשר בקר (floccu האורגניlation) או הפתתה חלב דל שומן 9-12 להסיר חלקיקי נגיף ממשטחי מסנן. לאחרונה, עוד הליך ריכוז המשני באמצעות תמצית בשר יחד עם התוספת של celite (חלקיקים קטנים) הראה הבטחה לשחזור אדנווירוס, enterovirus, וnorovirus 8,13,14. עבודות ריכוז Celite תחת עקרונות דומים לזה של שיטת הפתתה האורגנית שבחלקיקי הווירוס לצרף ולמשתחררות מחלקיקים (floc או celite) על ידי שינוי pH של תמיסת ההשעיה. השוואות בין שתי טכניקות ריכוז המשניות אלה הוערכו בהתאוששות של אדנווירוס ממוסמר סוגים (עו&quot;ד) 40 ו -41 8. מחקר זה הגיע למסקנה כי שתי טכניקות הריכוז המשניות היו סטטיסטיים דומות בהתאוששות של אדנו-וירוסים. עם זאת, שיטת הפתתה האורגנית דורשת 30 דקות. דגירה ב- pH 3.5, ואילו טכניקת celite דורשת דגירה קצרה יותר (10 דקות) ב- pH 4.0. Flocculat האורגנייון מחייב גם שימוש בציוד יקר מעבדה (צנטריפוגות) כדי לאסוף חלקיקי floc במהלך ריכוז שלישוני, טכניקת celite בניגוד משתמשת בציוד בסיסי בלבד מעבדה (סינון ואקום) כדי להפריד בין חלקיקי celite מהשעיה. שילובים מסוימים של מסננים וטכניקות elution המשניות יכולים להשפיע גם על החלמה וירוס. מחקר אחד למסקנה כי שילובים מסוימים של (מסנני electropositive) ראשוניים ומשניות טכניקות ריכוז (celite או הפתתה אורגנית) היו השפעה משמעותית של התאוששות של אדנו-וירוס 13. ממצאים אלה מראים כי אופטימיזציה נדרשת על מנת להתאושש בצורה אופטימלית וירוס יעד ממטריצת מים שניתנו בעת השימוש בטכניקות אלה. אופטימיזציה היא זמן רב, חוקרים רבים תהליך מפרך באופן פעיל להימנע מאז משתנים רבים יוערכו (סוג המסנן / מותג, פתרון elution pH, celite / הפתתה אורגנית). לשם כך זהTudy, הליך פותח כדי לזהות תנאים אופטימליים לריכוז וירוס ממים באמצעות אדנווירוס אדם ממוסמר זני 40 ו 41. יש להניח, שכן כל סוג וירוס מציג מורפולוגיה קפסיד ייחודית ותשלום קפסיד ספציפי, פרוטוקולי ריכוז עשויים צריכים להיות מותאמים לכל וירוס היעד כדי להשיג התאוששות ויראלי אופטימלית. מחקר זה מספק גישה לעו&quot;ד 40 ו -41 על ידי ריכוז: 1) הערכת החלמה וירוס במים ברז באמצעות תקליטורי electropositive מסנן ואחריו 2) הערכה של שיטת הפתתה אורגנית הוקמה לעומת טכניקת celite כריכוז משנית, ו 3) הערכה מאגרי elution לריכוז שלישוני.

<table><tbody><tr><td>Adenovirus 40 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus 41 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Prefilter 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td>AP2004700</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Polyphosphate</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Difco Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 Real-time PCR system</td><td>ABI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Filter Housing</td><td>Millipore Corp.</td><td>XX2004720</td><td></td></tr><tr><td>Blood DNA Extraction Kit</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr><td>EPA MPN Calculator</td><td></td><td></td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

a small volume procedure for viral concentration from water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

<html> בחירת Celite שלושה סוגים שונים של celite נבדקו לפני הבחירה של גרסת הביצועים הטובה ביותר. Celites עם קנס לחלקיקים בגודל בינוני המיוצר על ההחלמה אדנווירוס הגבוהה ביותר. השימוש בcelites הגדול הביא להחלמה נמוכה יותר עבור שניהם AdV40 ו -41 (טווח של ...

Watch this Scientific Journal Video about A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water at JoVE.com

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

a-small-volume-procedure-for-viral-concentration-from-water

Research

JoVE Journal

Environment

10.0K Views.  U.S. EPA. An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation. 

Video: A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Immunology and Infection

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס ​​- מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

צמר זכוכית מסננים וירוסים waterborne ריכוז פתוגנים zoonotic חקלאיים

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The recovery of microbial fractions, including viruses, bacteria, and microeukaryotes from wastewater and environmental water samples&#160;is one of the challenging steps in these approaches. In this study, we focused on the recovery efficiency of sequential ultrafiltration and skimmed milk flocculation (SMF) methods using Armored RNA as a test virus, which is also used as a control by some other studies. Prefiltration with 0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m membrane disc filters were applied to eliminate solid particles before ultrafiltration to prevent the clogging of ultrafiltration devices. Test samples, processed with the sequential ultrafiltration method, were centrifuged at two different speeds. An increased speed resulted in lower recovery and positivity rates of Armored RNA.&#160;On the other hand, SMF resulted in relatively consistent recovery and positivity rates of Armored RNA. Additional tests conducted with environmental water samples demonstrated the utility of SMF to concentrate other microbial fractions. The partitioning of viruses into solid particles might have an impact on the overall recovery rates, considering the prefiltration step applied before the ultrafiltration of wastewater samples. SMF with prefiltration performed better when applied to environmental water samples&#160;due to lower solid concentrations in the samples and thus lower partitioning rates to solids. In the present study, the idea of using a sequential ultrafiltration method arose from the necessity to decrease the final volume of the viral concentrates during the COVID-19 pandemic, when the supply of the commonly used ultrafiltration devices was limited, and there was a need for the development of alternative viral concentration methods.

Virus concentration from environmental water and wastewater samples is a challenging task, carried out primarily for the identification and quantification of viruses. While several virus concentration methods have been developed and tested, we demonstrate here the effectiveness of ultrafiltration and skimmed milk flocculation for RNA viruses with different sample types.

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Lentivirus הפקה

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

Biology

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס - מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה"כ

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

צמר זכוכית מסננים וירוסים waterborne ריכוז פתוגנים zoonotic חקלאיים

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

Lentivirus הפקה

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס ​​- מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה"כ

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

צמר זכוכית מסננים וירוסים waterborne ריכוז פתוגנים zoonotic חקלאיים

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

Lentivirus הפקה

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס - מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה