Name: nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors at JoVE.com

This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol>
	<li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity.">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li><li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+functions,+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li><li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes.">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li><li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features,+processing+states,+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function.">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleation,+reverse+annealing,+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer.">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li><li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription.">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li><li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA.">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li><li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li><li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li><li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1.">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li><li>Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA/DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li><li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization,+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis.">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+Protein:+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1.">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , .</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors.">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li><li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones:+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives.">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li><li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element.">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li><li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+RNA+chaperone+proteins:+from+functions+to+disease.">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li><li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates.">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li><li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution.">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li><li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides.">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li><li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

NAME הוא assay המאפשר להעריך את העיכוב של פעילות המלווה של חלבון nucleocapsid של HIV-1, יעד מעניין בחיפוש של תרופות נגד HIV רומן במהירות. NC anneals מהיר ובחומצות גרעין טמפרטורת חדר שיציבה מתקפל אחרת דורש denaturation התרמי בטמפרטורה גבוהה ואחרי חישול זהיר. Assay יכול להתבצע עם או באורך מלא NC או עם המקוצץ (12-55) NC: בשני המקרים שתי חומצות גרעין (RNA ועותק DNA משלים) הן מרותקים במהירות. זה עולה בקנה אחד עם תצפית ספרות עם פפטיד NC הקטוע: חישול הוא ביוזמת ההיתוך היעילה של הגזע של cTAR אחרי אינטראקציה של הלולאה שלה משלימה הפסגה, שהוא אתר NC חלש מחייב, עם הרצף המשלים של לולאת פסגת TAR, ובסופו דרך כמה ביניים יציבים להוארך היברידי המרותק. 21 NC הוא prot יציב מאודעין וכמה בעיות בעת ביצוע NAME יכולים להתרחש. זה מאוד חשוב עם זאת להוסיף SDS טרי בטעינת ג&#39;ל המאגר משמש כדי לעצור את התגובה: אם זה לא יושג, ג&#39;ל לא יציג את להקות חומצות גרעין בעמדות הנכונות. למעשה, NC הוא חלבון חומצת גרעין מחייב, כך שכדי לחזות בצורה נכונה TAR / heteroduplex cTAR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה SDS חייב להיות נוכח בטעינת ג&#39;ל המאגר לפגל החלבון ולשחרר אותו מהמתחם ההדוק שלה עם חומצות הגרעין. זהו גם פתרון בעיות אפשריות של הניסוי, כלומר ההיווצרות של להקות השתנו בזמן ריצת ג&#39;ל. השפעה זו בולטת במיוחד כאשר באורך המלא NC הועסק, כמו באיור 2, והוא צמוד לנוכחות של הזנב N-terminal הבסיסי ביותר, שיש לו השפעה חזקה על צבירת חומצות גרעין. הנוכחות של הזנב הבסיסי המסוף הופכת את תגובת חישול יותר קשה להיות מעוכבת, כתכניתn באיור 3 מתחם באמצעות 1, intercalator השחלה נציג, כלומר intercalator יעיל במיוחד בייצוב מבני גזע הלולאה של TAR ושל cTAR. למעשה, זה סוג של אינטראקציה עם חומצות גרעין הוא מועדף כאשר בליטות ולולאות לקטוע את רצף הסליל הכפול, המאפשרים להשחלה קלה יותר של מתמירים מגושמים לזוגות הבסיסים. ייצוב של TAR וcTAR ידי קלסרים חומצות גרעין אלה נותח בעבר על ידי קביעת העלייה בטמפרטורת ההתכה של שני oligonucleotides. 14 יתר על כן, העלייה בטמפרטורת התכה בקורלציה עם העיכוב של חישול זרז על ידי HIV-1 NC, הבא להקמתה המופחתת של TAR / cTAR heteroduplex ומצביע על כך שintercalators השחלה היא כיתה מעניינת של קלסרים עבור מבנים דינמיים של RNA כגון אלמנט TAR. 14 מנגנון פעולה מופעל על compo אלהunds ניתן תוקף נוסף על ידי ביצוע assay NAME בפורמטים חלופיים שונים, כפי שמוצג באיור 4: במקרה של intercalators העיכוב של heteroduplex המרותק מוגבר כאשר התרופה הודגרו עם שני oligos המקופל. תרכובות הפועלות במנגנון פעולה שונה, כגון קלסרים ישירים של חלבון NC, תהיה מושפעות פחות מהמצב preincubation שונה. assay שם מבוצע בשתי השיטות ולכן יכול לשמש מסך ספריות של תרכובות לזיהוי מעכבי NC, וגם להעריך את המנגנון המשוער של פעולה של הלהיטים החיוביים תוך חיפוש התרופות נגד HIV הממוקדים בNC. ברור, השימוש בטכניקות אלה לבד כאשר הטענה למנגנון ספציפי של פעולה של מעכבי NC מזוהים אינו מספיק, ויש צורך במבחנים ביוכימיים מתאימים אחרים כדי לקיים את נחת העבודה. 14 לבסוף, יש להדגיש כי שם משתמש ביותראנזימים מטוהרים, או רקומביננטי או סינטטיים, מתן מידע יקר על עיכוב &quot;במבחנה&quot; של NC על ידי התרכובות נבדקו. זהו &quot;הכוח והחולשה&quot; של assay: שם יכול גם להשלים הקרנה וירטואלית והדמיה מולקולרית מתקרבת בצעדים הראשוניים של תוכניות גילוי תרופות, המאפשרת לבנות במהירות ולנתח מערכות יחסים מבנה-פעילות וסופו של דבר הפניית עיצוב הסינתזה וסמים. עם זאת, כפי שמבחני ביוכימיים אחרים המשמשים בפרויקטים לפיתוח תרופות בHIV, NAME לא נותן מידע על ההשפעות של מעכבים משוערים בתאים נגועים בנגיף.

חלבון nucleocapsid NCp7 (NC) מסוג וירוס הכשל החיסוני אנושי 1 (HIV-1) הוא חלבון קטן, בסיסי הקשור באופן הדוק עם RNA הגנומי בווירוס המדבק הבוגר, ששיחק תפקיד מרכזי בתרבות נגיף כקו-פקטור בשעתוק לאחור , הכרת הגנום, ואריזה. 1-3 NC פועל כמלווה חומצות גרעין מזרזות היציבות של מבני חומצות גרעין יציבים והחישול של רצפים משלימים. פעילות חומצות גרעין צבירתה מתגוררת בעיקר בחומצות אמינו 11 תחום N-terminal תוך פעילות ערעור יציבות דופלקס כבר ממופות למבנים שלה אבץ אצבע (12-55 פפטיד). 4 החלבונים הטעונים חיובי מוריד את המחסום אלקטרוסטטי של תגובת חישול ו מגביר את הקצב שבו שני רצפים משלימים נפרדים לבוא ביחד. חומצות גרעין המקופלות בקונפורמציה היציבה דורשות פעילות המלווה של NC לfacilitatדואר חישולם 5 הדבר חשוב במיוחד בשעתוק לאחור, שבי NC הוא קריטי באירועי העברת גדיל:. בהעברת גדיל מינוס, DNA תחנת גדיל מינוס, רק retrotranscribed, יש להעביר ומרותק לרצף משלים באזור R בסוף 3 &#39;של הגנום RNA תבנית. 6 למרות שהעדיפו thermodynamically, תגובה זו אינה מתרחשת באופן נרחב בהעדר NC בשל נוכחותם של המבנה היציב של האזור מגיב הפעלת טרנס RNA (TAR) באזורי R, שחייב להיות משויך לעותק ה- DNA שלו (cTAR DNA). 7 אזורי cTAR וTAR הם, למעשה, מובנים מאוד עם קונפורמציה גזע לולאה אופיינית. חלבון NC denatures סיכות אלה, ומקדם העברת מינוס גדיל על ידי הגדלת שיעור חישול מולקולאריים בין גדילי חומצות גרעין המשלימים. המנגנון של חישול NC של TAR וcTAR נחקר ביסודיות ודהscribed כassay חישול TAR בכמה עבודות מחקר והתכנית המוצעות מתוארת בביקורות מצוינות. 8-11 בסיכום, NC מערער את המבנה השניוני של רנ&quot;א היציב כמו TAR-RNA, מערער את המבנה המשני של הרצף משלים, cTAR-DNA שלה , ומקדם את תגובת חישול של RNA / DNA הובילה לTAR / היווצרות heteroduplex cTAR. 10,11 כתוצאה מכך, צעד גדיל-העברה בעת שכפול HIV הוא מועדף. 12 NC הוא יעד אטרקטיבי לפיתוחם של חומרים חדשים מאז ההפרעה האפשרית הנגרמת על ידי מולקולות קטנות לכיוון צפון קרוליינה הייתה לגרום לירידה של השעתוק לאחור של הגנום הנגיפי כתוצאה מפעילות NC התפשרה. 2,13 יכלו גישה זו סופו של דבר להוביל לפיתוח של תרופות אנטי-HIV מוצלחים. במהלך הקרנה לNC מעכבי 14 פיתחנו assay להסתמך על התכונות הידועותשל nucleocapsid לערער את היציבות ביעילות ובoligonucleotides המשלים לחשל. 10,11 אנחנו קראנו לזה N ucleocapsid M nnealing- ediated lectrophoresis assay E (שם). assay NAME משתמש NC לתווך בין חישול עותקים ביציבות מובנה של חומצות גרעין משלימות, במקרה של oligonucleotide המתאים לחלק הפסגה של רצף TAR-RNA עם הרצף שלה משלים DNA (cTAR) להניב TAR ההיברידי / heteroduplex cTAR . הניתוח של TAR / תגובת חישול cTAR בנוכחות NC יכול להיחקר על ידי אלקטרופורזה יליד ג&#39;ל polyacrylamide (עמוד). פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע assay שם כדי לחשל במהירות בטמפרטורת חדר oligonucleotides המקופל במבני סיכת ראש יציבים, כיצד לנתח את התוצאה של התגובה ופתרון בעיות אפשריות של הניסוי. תיוג הרדיואקטיבי של חומצות גרעין לא ביקש, וdetectiעל להקות oligonucleotide יכול להתבצע על ידי שיטות צביעה קונבנציונליות. Assay, שמעסיק גם את החלבון באורך מלא רקומביננטי או גרסה סינתטית קטועה של NC, מאפשר זיהוי של intercalators השחלה עיכוב NC, פעילות במיתאם עם חזק מחייב לRNA ו- DNA. 14

<table><tbody><tr><td>cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock&amp;nbsp; solution at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock aliquot at -80 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55)NC peptide</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>Store the stock solution at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>0.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 2-20 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Perchlorate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>Store the 1&amp;nbsp;M solution at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>Prepare the 10% solution freshly before use</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td><td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td></tr><tr><td>Tris ultrapure</td><td>Applichem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS spectrometer Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA Gel Staining</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C for two weeks.</td></tr><tr><td>Geliance 600 Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

RNA או DNA המקופל בקיפול tridimensional היציב הם מטרות מעניינות בפיתוח אנטי-סרטני או תרופות אנטי. במקרה של HIV-1, חלבונים נגיפיים המעורבים בוויסות של פעילות הווירוס מזהים כמה חומצות גרעין. חלבון nucleocapsid NCp7 (NC) הוא חלבון עיקרי המסדיר כמה תהליכים בעת שכפול וירוס. NC הוא למעשה מלווה לערער את יציבות מבנים משניים של RNA ו- DNA והקלת חישולם. איון של NC הוא גישה חדשה ומעניין ליעד טיפול אנטי HIV. N ucleocapsid M nnealing- ediated lectrophoresis E assay (שם) פותח כדי לזהות מולקולות מסוגלת לעכב את ההיתוך וצריפה של RNA ו- DNA המקופל בתצורות tridimensional יציבים thermodynamically, כגון מבני סיכת ראש של TAR ואלמנטי cTAR של HIV, על ידי חלבון nucleocapsid של HIV-1. הבדיקה החדשה מעסיקה או מחדשcombinant או החלבון הסינתטי, וoligonucleotides ללא הצורך בתיוגם הקודם. ניתוח התוצאות מושגת על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית ג&#39;ל polyacrylamide (עמוד) ואחריו מכתים חומצות גרעין קונבנציונלי. הפרוטוקול דיווח בעבודה זו מתאר כיצד לבצע assay שם עם החלבון באורך מלא או הגרסה המקוצצת שלה חסרת תחום N-terminal הבסיסי, שני מוסמכים כמלווי גרעין חומצות, וכיצד להעריך את העיכוב של פעילות מלווה NC על ידי השחלה intercalator. יתר על כן, שם יכול להתבצע בשני מצבים שונים, שימושי כדי לקבל אינדיקציות על המנגנון המשוער של פעולה של מעכבי NC המזוהים.

איור 1 מציג תוצאת נציג assay Nucleocapsid חישול המתווכת אלקטרופורזה (שם), שבוצע i) עם חלבון רקומביננטי באורך מלא, ii) ללא חלבון, כלומר ערבוב cTAR + TAR ודוגר עד השעה 1 בRT, וiii ) אותו assay הופיע עם (12-55) NC, פפטיד סינטטי חסר 11 חומצות אמינו של תחום N-terminal. (נתיבים מרכזיים TAR-מקופל מראש וcTAR היו מעורבים והיווצרות של TAR heteroduplex המרותק / cTAR הייתה פיקוח בנוכחות NC רקומביננטי באורך מלא (נתיבים שמאליים של איור 1), בהעדר החלבון באיור 1 ), ובנוכחות של (12-55 פפטיד NC) (הנתיבים הנכונים מקוצצים באיור 1). פקדים: מקופלים cTAR, מקופל TAR, ומרותק היברידיים (TAR / cTAR), שהושגו באמצעות denaturation התרמי של המבנים המקופלים ביציבות של TAR לcTAR אחרי annealin האיטי שלהםז. 14 היכולת של NC לפגל שני רצפי חומצות גרעין יציבים לסליל heteroduplex האריך בבירור: חלבון NC באורך מלא מוביל מייד להיווצרות של TAR / היברידי cTAR: 0 &#39;מציין את הזמן המינימלי שעובר בין תוספת של NC ל דוגמאות ותוספת של חיץ טעינת ג&#39;ל, אשר עוצר את התגובה; היווצרות מלאה כבר הושגה לאחר 15 זמן דגירה &quot;. העלייה בעוצמת heteroduplex המרותקת מקבילה לירידה בעוצמת oligonucleotides cTAR וTAR המקופל. היווצרות heteroduplex מושגת גם בנוכחות של הצורה קטועה, כלומר (12-55) NC, המאשרת את הפעילות הביולוגית של פפטיד הסינתטי. בהעדרו של החלבון או של הפפטיד היווצרות heteroduplex לא נצפה, וTAR וoligonucleotides cTAR לא לחשל בטמפרטורת חדר לheteroduplex (איור 1). בכל הניסויים, ההיווצרות מהירה של חומרי ביניים לא יציבים (&quot;מתחמי ביניים&quot; באיור 1) שירידה לאורך הזמן הוא ציין, באופן עקבי עם המנגנון המוצע של חילופי גדיל באמצעות סיכות הראש של cTAR וTAR עד חומצות גרעין הנכונות מתקפלות. 17 פתרון בעיות אפשריות של הניסוי הוא חוסר SDS במאגר טעינת ג&#39;ל. בהעדר SDS בGLB התוצאה של התגובה מוצגת באיור 2 והשוואה לתוצאה עם GLB + SDS. TAR-מקופל מראש וcTAR היו מעורבים וטופחו במשך 3 שעות בRT של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם חלבון NC באורך מלא רקומביננטי. לאחר הדגירה הדגימות פוצלו לשתיים: למאגר טעינת המחצית ג&#39;ל אחד ללא SDS (GLB) נוספו, ואילו למחצית אחרת GLB היה עם SDS (GLB SDS). דוגמאות הועמסו על הג&#39;ל, ואת המיקום של להקות חומצות גרעין היה דמיין אחרי ג&#39;ל המנוהל על ידיכתמי צבע. כאשר NC היה נוכח אבל הדגימות עמוסות GLB, כל להקות חומצות הגרעין הוזזו עד: זה צפוי ומציינת חזק מחייב בין החלבון וחומצות גרעין. התוצאות עם GLB SDS מוצגות בימין הקיצוני של ג&#39;ל: התוספת של SDS denatures החלבון ומשחררת חומצות גרעין מהמתחם היציב עם החלבון, המאפשר השוואה עם קבוצת הביקורת. Assay השם משמש כדי להעריך את היכולת של השחלה intercalators לייצב מבני חומצות גרעין דינמיים ומעכבים את פעילות NC מלווה. 14 intercalators Threading הם מולקולות ריחניות מישוריים הוחלפו על ידי שרשרות צד מגושמות הממוקמים באתרים נגדיים של מערכת הטבעת, כגון anthraquinone ניתן לראות באיור 3 א. 18 intercalators אלה מסוגלים להשחיל דרך הסליל הכפול של חומצות גרעין, לבסוף איתור הרשתות בצד שלהם בכל חריץ של כפולסליל. 19,20 איור 3 מציג את התוצאה של assay שם בנוכחות המתחם 1, intercalator השחלה ידועה, 18 בנוכחות באורך מלא NC או של הפפטיד הקטוע. בשני המקרים, היווצרות ההיברידית TAR / cTAR על ידי NC היא מופחתת על ידי הגדלת הריכוז של intercalator, ואילו, באותו הזמן, בסך של TAR החופשי ועליית cTAR. הצורה קטועה של החלבון חסר זנב N-terminal (12-55NC) היא יותר רגישה לעיכוב פעילותו: הבדל זה אומת עם כל התרכובות שנבדקו עד כה. Assay השם יכול להתבצע בשתי דרכים, או על ידי מראש דוגרים מתחם הבדיקה עם NC, ואחריו תוספת של oligonucleotides המקופל (מצב NC-preincubation), או על ידי preincubating מתחם המבחן במשך 15 דקות עם מצעי חומצות גרעין המקופלים , ואחריו תוספת של NC ודגירה נוספת במשך 15 דקות (אוליגו-PRמצב eincubation). למרות זמן הדגירה הכללי הוא זהה בשני מצבים שונים, preincubation עם oligonucleotides המקופל לפני תוספת של NC מאפשר יותר זמן לשחלה של intercalators לחומצות גרעין המקופל. התוצאה היא ייצוב חזק של המבנים הדינמיים שלהם ולעיכוב קל של פעילויות מלווה NC. הניתוח של assay שם בשני המצבים ולכן משפר את ההבדלים במנגנון פעולה של מעכבי NC, כפי שמוצג באיור 4: כאשר מתחם 1 נותח בשמו במצב אוליגו-preincubation (איור 4, נתיבים משמאל) זה מראה עיכוב חזק של חישול בתיווך NC, ואילו עיכוב הרבה יותר נמוך נצפה במצב NC-preincubation (איור 4, נתיבים מימין). אנא שים לב כי לקביעת ריכוזים מעכבים בזמן הקרנת סטים של תרכובות הקשורות עם assay זה ובתנאים אלה, כל התנסותment חייב להתבצע לפחות בשלושה עותקי שימוש בריכוזים צפופים (במיוחד סביב ערך IC 50). 14 <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> איור 1:. Assay שם עם באורך מלא NC ועם (12-55) NC TAR המקוצץ המקופל וcTAR, כל 1 מיקרומטר, הודגרו עם NC רקומביננטי או עם (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) ל0 דקות, 15 דקות, 30 דקות ושעה 1. TAR וcTAR מודגרות בהיעדר החלבון (0 דקות, 15 דקות, 30 דקות ושעה 1) שמשו כביקורת שלילית. TAR המקופל, cTAR המקופל וTAR ההיברידי / cTAR מתקבלים לאחר denaturation התרמית ואחריו במבחנה חישול שמשו כקבוצת ביקורת. התגובות אז היו הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג&#39;ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. <html><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> איור 2:. אפקט של SDS במאגר טעינת ג&#39;ל (GLB) בעת ניתוח TAR / cTAR חישול על ידי NC TAR וcTAR, prefolded בTNMg 1x, הודגרו עם אורך מלא רקומביננטי NC (oligos / NC = 1/8) במשך 3 שעה בטמפרטורת חדר או על 37 מעלות צלזיוס. GLB או GLB SDS נוספו לאחר מכן לדגימות מודגרות עם NC. בקרות: TAR, cTAR וTAR ההיברידי המרותק / cTAR (כל 1 מיקרומטר). אלקטרופורזה בוצעה באמצעות 12% ג&#39;ל polyacrylamide בTBE 1x; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. נתון זה שונה מאיור S4 של:. Sosic, א &#39;ואח&#39; עיצוב, סינתזה והערכה ביולוגית של TAR וקלסרים cTAR כHIV-1 מעכבי nucleocapsid 4 MedChemComm, 1,388-1,393, doi:. 10.1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> איור 3: (א) מבנה כימי של intercalator השחלה 1. (B) השפעה של השחלה intercalator 1 הוערך על ידי assay NAME. מקופל TAR וcTAR, כל 1 מיקרומטר, הודגרו בנוכחות הריכוזים מצויינים של המתחם 1 עם האורך מלא NC או עם (12-55) NC, כל 8 מיקרומטר. TAR המקופל, מקופל cTAR וTAR heteroduplex המורחב / cTAR שימש כקבוצת ביקורת. התגובות אז היו הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג&#39;ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> איור 4: אוליגו-preincubation לעומת מצבי NC-preincubation: השפעות על assay NAME mod אוליגו-preincubation.דואר: TAR מקופל ומקופל cTAR, כל 1 מיקרומטר, היו preincubated עם הריכוזים מצויינים של intercalator השחלה 1 במשך 15 דקות, ולאחר מכן במשך 15 דקות נוספות בנוכחות באורך המלא NC (8 מיקרומטר) NC-preincubation. מצב: ריכוזים המצוינות של intercalator השחלה 1 היה preincubated עם האורך המלא NC (8 מיקרומטר) במשך 15 דקות, ולאחר מכן במשך 15 דקות נוספות בנוכחותו של TAR המקופל ומקופל cTAR, כל 1 מיקרומטר. TAR המקופל, מקופל cTAR וTAR heteroduplex המורחב / cTAR שימש כקבוצת ביקורת. כל התגובות לבסוף הפסיקו להשתמש GLB SDS. דגימות נפתרו על 12% ג&#39;ל polyacrylamide ב1x TBE; לאחר חומצות גרעין אלקטרופורזה בג&#39;ל הוכתמו וזוהה על transilluminator.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors at JoVE.com

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.9K Views.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Video: Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Genetics

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video