מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של NCI.

1. הכנת מניות מאסטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מניות ראשיים של התרכובות להיבדק בDMSO. הכן את המניות בריכוז סטנדרטי של 20 מ&quot;מ. הערה: כל ריכוז מעל 10 מ&quot;מ יכול לשמש. תרכובות שיכולים לשמש כביקורת חיובית כדי לאמת assay זה כוללים RAL, EVG, וDTG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו התרכובות מומסים DMSO ידי vortexing מספר הפעמים פתרונות ל15 שניות ודוגרים על RT במשך שעה 1. אחסן 20 פתרונות מניות מ&quot;מ בחושך ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> 2. הכנת צלחות 96 היטב להקרנת מתחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הקו הסלולרי להיבדק (למשל HOS או TZM-BL), וזרעים של תאים אלה 100 μl בצפיפות של 4 x 10 4 תאים / מיליליטר (4,000 תאים / טוב) בתקשורת (למשל בינוני שונה Dulbecco הנשר של או DMEM בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברי, 5% נסיוב עגל בן יומו, ופניצילין (50 יחידות / מיליליטר) בתוספת streptomycin). </li></ol> 3. דור של מניות וירוס לייצר VSV-G-pseudotyped-HIV על ידי transfecting 293 תאים (כפי שמוצג באיור 1, שלב 1) 32-34. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום לפני transfection, צלחת 293 תאים ב100 מנות בקוטר מ&quot;מ בצפיפות של 1.5 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של transfection, transfect 293 תאים עם 16 מיקרוגרם של סוג בר או איידס מוטציה (pNLNgoMIVR - ΔLUC) ו4 מיקרוגרם של VSV (pHCMV-g) בשיטת סידן זרחה 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 6 שעות לאחר משקע סידן זרחה הוא הוסיף, לשטוף 293 תאים פעמיים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ודגירה עם תקשורת טריות ל48 שעות. [DMEM בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברי, 5% נסיוב עגל בן יומו, ופניצילין (50 יחידות / מיליליטר) בתוספת סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הווירוס המכיל supernatants ידי הסרת התקשורת מקוטר 100 מ&quot;ממנות, להבהיר את supernatants ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה ב3,000 סל&quot;ד 10 דקות, לסנן את supernatants דרך מסנן 45 מזרק הגודל הנקבובית מיקרומטר, לטפל supernatants עם טורבו DNase ל30 דקות ב RT ולדלל את supernatants בתקשורת להכנה במבחני זיהום . אחסן את supernatants הנגיפי קפוא, בaliquots, ב -80 ° C. הערה: כמות p24 בsupernatant נקבעת באמצעות ערכת HIV-1 p24 צמוד אנזים immunosorbent assay. ריכוז p24 משמש לשליטה את כמות הנגיף במדגם. כ 500 ננוגרם של וירוס נוסף תאי HOS מצופים על צלחות בקוטר 60 מ&quot;מ בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים / תבשיל ביום לפני ההדבקה. לאחר שעה 48 של דגירה, התאים נקצרים, שנאספו על ידי צנטריפוגה, שטף, וresuspended בשל PBS 100 μl. מוסיף כמות שווה של מגיב assay גן כתב הארה ולמדוד את פעילות לוציפראז כמפורט בסעיפים 5.4.1 ו5.4.2. מכאן, דילול מתאים של הנגיף יכול להתבצע כאמור בשלב 4.6. </li></ol> 4. מתחם הקרנה בצלחות 96 היטב מסך בכל מתחם בשלושה עותקים ומחשבים את ממוצע התוצאות. הערה: ההשפעה של כל מתחם בשכפול נגיפי היא תיקנה על ידי נרמול לרמה של שכפול המתקבל בהעדר כל מתחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את טווח הריכוז האמפירי שיוקרנו. הערה: בדרך כלל, מסכי עם 11 דילולים סדרתי מבוצעים על ידי הוספת המתחם לעמודת הצלחת לפי עמודה ומסכים עם 7 דילולים סדרתי מבוצעות על ידי הוספת המתחם אחר שורה. שלושה עותקים סט אחד של בארות חייבים להיות שמורות לשליטה אין מתחם. בנוסף, עמודה או שורה אחת אחד חייבת להישאר ריקה לפעול כביקורת השלילית / רקע. לבסוף, בין אם מדובר בcytotoxicity סלולארי או assay infectivity יכתיב אם הוא הוסיף וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןדילולים סדרתי מפתרון מניות 20 מ&quot;מ. הריכוזים נבחרים בהתאם לטווח אמפירי הנחוש של ריכוזים להיבדק (כפי שמוצגים בטבלה 1). הכן את דילולים בתקשורת ב10x הריכוז הסופי הרצוי, כלומר אם הריכוז הסופי הולך להיות 100 מיקרומטר, להפוך את המניה עובדת 1 מ&quot;מ. הערה: תרכובות עם IC 50 של מעל 5-10 מיקרומטר אינן מועמדים טובים בדרך כלל לפיתוח תרופה. במבחנים הראשוניים אנו בוחנים את התרכובות רק נגד וקטור WT. תרכובות מבטיחות שיעילות לעכב את וקטור WT מכן נבדקו מול פנל של מוטציות עמידות לתרופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות 96 היטב מן האינקובטור ולהוסיף דילולים סדרתי של התרכובות להיבדק לבארות בשלושה עותקים (כפי שמוצג באיור 1, שלב 2). הערה: הנפח הוסיף לגם צריך להיות בריכוז הסופי 1/10 נפח. לפיכך, להוסיף 22 μl / טוב (עמ &#39;הנפח הסופיבנוסף וירוס OST הוא 220 μl) עבור מבחני infectivity. עבור מבחני cytotoxicity, להוסיף μl 11 / טוב (נפח סופי הוא 110 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את צלחות 96 היטב לחממה. למסך cytotoxicity הסלולרי, דגירה צלחות 96 היטב 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס ולא מניפולציות נוספות יש צורך בפרוטוקול 4: להמשיך לפרוטוקול 5 למבחני infectivity, תמשיך ביצוע ההנחיות בפרוטוקול 4.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחני Infectivity בלבד. הסר את הצלחות מן החממה לאחר מינימום של 3 שעות דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם התרכובות כדי להיות מנותחים. שים לב: זה מאפשר את המתחם שנלקח על ידי התאים לפני ההדבקה עם וקטור ה-HIV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דילול מניות של הנגיף 33, 34 (בדרך כלל כ 1:3) שיפיק אות לוציפראז בין .2-1.5 יחידות יחסי לוציפראז (RLUs) בתאים שלא טופלו. כל צלחת תיקח כ 10 מיליליטר של diluוירוס טד. הוספה של וירוס 100 μl לכל אחת מהבארות, או באמצעות pipettor רבת ערוצים 8 או 12. אל תוסיף וירוס לבארות ביקורת שלילי / רקע. החזר את הצלחות ל37 מעלות צלזיוס החממה ל48 שעות. הערה: דילול מניות 1:03 של הנגיף הוא דילול טיפוסי שיפיק אות לוציפראז בין 0.2 -1.5 RLUs מבוססת על assay p24 מראה כי הריכוז הנגיפי בsupernatant הוא כ 500 ng ב1.0 מיליליטר. </li></ol> 5. הכנה ומדידה של Cytotoxicity וInfectivity צלחות 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מהבארות (פנול האדום בתקשורת יכולה להפריע לאות לוציפראז). השתמש פיפטה זכוכית עם קצה פיפטה 200 μl מצורף בסוף. התחל בחלק העליון של התקשורת ועובד לאט לכיוון הפינה התחתונה של הבאר. אל תבזבזו יותר מדי זמן בתחתית הבאר, או תאים ניתן להסיר מהבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של PBS הוספה 100 μl בתוספת 0.5 מ &#39;M MgCl 2 היטב כל אחד. זה צריך להיעשות באופן מיידי לאחר שהתקשורת מוסרת, כך שהתאים לא יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק עבור מבחני cytotoxicity, מוסיף 5 מיליליטר של חיץ מצע מassay גילוי הארה ATP לכל בקבוקון של מגיב lyophilized שסופק. בקבוקון אחד מספיק לצלחת 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ תמוגה התא מassay גילוי הארה ATP היטב כל אחד. לנער את צלחת 96 היטב ב700 סל&quot;ד ב RT במשך 5 דקות באמצעות thermomixer קומפקטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של מגיב assay הגילוי מחדש הארה ATP לכל הבארות מלבד בארות שליטה / רקע השליליות. לנער ב700 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות באמצעות thermomixer קומפקטי. דגירה הצלחות ב RT עבור 20 דקות כדי לאפשר זמן לפיתוח אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את צלחת 96 היטב באמצעות luminometer microplate. הערה: פתח את תכנית luminometer microplate Pro SoftMax. ודא luminometer מוגדר למדוד לומיםnescence ברגישות של 5 קריאות / כן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק עבור מבחני infectivity, להוסיף 10 מיליליטר של חיץ מצע מassay גן כתב הארה לכל בקבוקון של מגיב lyophilized שסופק. בקבוקון אחד מספיק לכל צלחת 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של מגיב כתב הארה מחדש assay גן 100 μl היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לאפשר זמן לפיתוח אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את צלחת 96 היטב באמצעות luminometer microplate כפי שבוצע בסעיף 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. קביעת CC 50 וIC 50 ערכים לתרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את נתוני לוציפראז מluminometer microplate לתוך גיליון אלקטרוני Excel. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע שני נתונים לוציפראז בשלושה עותקים ונתונים אות רקע / שליטה. להחסיר אות רקע / שליטה הממוצעת של האות בשלושה עותקים בממוצע לטווח הריכוז כולו. </li> &lt;li&gt; נרמל הרקע תיקן אות ממוצעת לטווחי הריכוז נגד הפעילות, בין אם מדובר cytotoxicity או infectivity, בהעדר כל מתחם על מנת לקבוע את עיכוב אחוזים. הערה: עיכוב אחוזים מוגדר כפעילות לוציפראז בנוכחות הסמים מחולקת בפעילות לוציפראז בהעדר התרופה כפולה 100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת Kaleidagraph להשיג CC 50 וIC 50 ערכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שני טווח הריכוז באופן אמפירי נחוש ועיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז לKaleidagraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את הנתונים בטווח הריכוז על ציר x ועיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז על ציר y. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים assay מהיר, יעיל, ושחזור שניתן להשתמש בם לתרכובות מסך לcytotoxicity ויכולתם כדי לעכב את השכפול של שני WT וסמים עמידים HIV-1. היכולת לזהות במהירות תרכובות ובדיקת היעילות ורעילה לתאים שלהם היא קריטית בפיתוח של תרופות חדשות ומשופרות נגד HIV-1. ברגע שתרכובות עופרת מזוהות, אנלוגים של המתחם להוביל יכולים להיות מיוצרים ונבדקו תוך שימוש באותה assay. Assay הוא יחסית פשוט. ישנן שני בקרות חיוביות ושליליות המאפשרות למשתמש כדי לאבחן את הבעיות הנפוצות ביותר (תרכובות רעילות, בעיות עם מניית הווקטור). השימוש בסט שלושה עותקים של בארות ללא מתחם הוסיף מראה כי זיהום ויראלי התרחש. העובדה שcytotoxicity נמדד בassay עצמאי נמנעה פרשנות שגויה לירידה בלוציפראז נגרמת על ידי cytotoxicity כהשפעה ספציפית על שכפול נגיפי. השלבים הקריטייםבפרוטוקול מכינים את הצלחות, כך שהתאים מפוזרים באופן אחיד בבארות, שיש להם הבארות ריכוזים תקינים של התרכובות להיבדק, ומוסיף את אותה הכמות של וירוס לכל אחת מהבארות, ומדידת פעילות לוציפראז כדי לקבוע את CC 50 וIC 50 ערכים. Assay הוא בטוח, כמוני, ושחזור. Assay הוא בטוח כי הווקטור הוא שכפול פגום. Assay הוא כמוני ולשעתק משום שהיא מבוססת על וקטור אחד עגול שמבטא לוציפראז, אשר ניתן assayed במדויק ובנוחות. בassay שכפול נגיף עגול רב, IC נמדד 50 תלוי במספר מחזורי חיים נגיפיים; מדובר בבעיה מסוימת כאשר מבחני כרוכים בשני WT ווירוסים עמידים לתרופות שעשויות להיות יכולות שכפול שונות באופן משמעותי. יש כמה מבחני האנזימטית כבר דיווחו כי יכולים בעברלשמש מסך למעכבי IN. מבחני שכוללים טכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת כדי למדוד DNA המשולב דורשים חלבונים מטוהרים רקומביננטי (ים), והם, באופן כללי, הן יותר עבודה אינטנסיבית ויקר 36, 37. למרות שניתן להשתמש במבחנים האנזימטית כדי למדוד את ההשפעה של תרכובות על אנזימים האחרים נגיפיים (RT ופרוטאז), כל אנזים דורש מערכת assay משלו. Assay וקטור הסיבוב אחד, כפי שתואר, ניתן להשתמש בם, ללא שינוי, מסך עבור מעכבי RT. Assay דומה יכול לשמש מסך למעכבי פרוטאז; עם זאת, בassay מעכבי פרוטאז, התרכובות יש להוסיף לתאים המשמשים לייצור הווקטורים. Assay בנושא, תוך שימוש בתאים ווקטורים שונים, יכול גם לשמש מסך למעטפה (env) ומעכבי איחוי כניסת ה-HIV. לבסוף, ניתן להשתמש assay, בקנה מידה גדול יותר, עם מכשירי רובוטית אוטומטיים. לפיכך, assay יכול לשמש מסך ספריות גדולות של תרכובות נגד WT ומטרutant-HIV. עם זאת, העובדה assay יכול לזהות מעכבי של שכפול נגיף איידס שפועל בשלבים שונים של מחזור החיים נגיפיות נקודות להגבלה בפרשנות הנתונים. על ידי עצמו assay אינו מגדיר ששלב במחזור החיים חסום על ידי מתחם. אם שאלה זו מתעוררת, ניתן לפתור אותו על ידי שימוש בזמן של מבחני בנוסף 38, ועל ידי בדיקת המתחם נגד חלבונים נגיפיים רקומביננטי מטוהרים. למרבה הצער, למרות ההצלחה של תרופות נגד HIV, יש עדיין בעיות עם שניהם התנגדות ורעילות. בהיעדר חיסון ל-HIV אנטי יעיל, יש צורך לא רק לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות שתהיינה יעיל נגד מוטציות עמידות לתרופות הקיימות, אלא גם לפתח תרופות מונעות שיכול לצמצם את התפשטות הנגיף. אם שימוש מניעתי בתרופות נגד HIV incudes הטיפול של אנשים נגוע, גישה זו תציב את נטל מיוחד על פיתוח תרופות שיש little או ללא רעילות לטווח ארוך.

הזמינות של תרופות המכוונות כמה צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי HIV-1 הובילה לטיפול משולב תרופתי (נקרא טיפול אנטי retroviral פעיל מאוד, או HAART) ששפר את הטיפול ב-HIV-1 זיהומים, והישרדות לטווח הארוך מאוד של חולים. HAART, אשר בדרך כלל משתמש בשילובים של שני טרנסקריפטאז ההפוך נוקלאוזידים מעכבים (RT) וגם מעכבי פרוטאז או מעכבי RT נוקלאוזידים לא, יש עכשיו הוסב מחלה קטלנית למצב חיים ארוכים 1-5. עם זאת, למרות הצלחות רבות של HAART בדיכוי מתמשך של שכפול נגיפי, יש לו מגבלות. HAART לא למגר את האיידס, ולכן החולים אינם נרפא וטיפול הוא חיים ארוכים. יש בעיות עם רעילות תרופה ועם הופעתה של סמים זנים עמידים. התנגדות יכולה להתעורר לכל תרופות שאושרו נגד האיידס, כוללים תרופות שאושרו לאחרונה כי יעד אינטגראז HIV (IN). עמידות לתרופות סבירה מתעוררת becaשימוש במוטציות ספונטניות המתרחשות בעת שכפול נגיפי (שיעור שגיאה של 3 x 10 מחזור -5 מוטציות / בסיס / שכפול) 6. כאשר מוטציות להתעורר בקידוד גנים למטרות של תרופות אנטי רטרווירלי, קבוצה קטנה של מוטציות אלה תוביל לירידה ברגישות של הזן הנגיפי לסמים. כדי למנוע ההתפתחות של עמידות לתרופה, ריכוז תרופה חייב להישמר ברמות שלדכא את שכפול נגיף האיידס באופן מלא. דבקות עניים למשטר הטיפולי מחריפה את הבעיה, ויכולה להוביל להתפתחות המהירה של התנגדות 7-9. למרות שריכוזי תרופה יכולים להשתנות בחולים עקב ספיגה שונה, חילוף חומרים, הפצה, ורמות הפרשה, ריכוזי תרופה גבוהים יכולים להוביל לרעילות 10. מאז הטיפול ממשיך לחייו של המטופל, יש חששות בטיחות חמורים על הרעילות ארוכת הטווח של retrovirals אנטי. Retrovirals נגד שימוש נפוץ בHAART יכול להיות תופעות לוואיnd יש כבר מקרים שבהם תופעות הלוואי הייתה סכנת החיים 11-15. בעיות חולים נתקלים עם ההתפתחות של עמידות ורעיל בבסיס הצורך בפיתוח תרופות חדשות שיעילות לחסום את השכפול של הזנים הנפוצים התרופה עמידות של הנגיף עם רעילות ארוך טווח קטן או לא. לפיכך, יש צורך בassay שיכול להקרין לתרכובות לחסום צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי במהירות. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי להעריך את cytotoxicity של תרכובות והיכולת שלהם לחסום את השכפול של שני WT וזני HIV עמיד לתרופות במהירות וביעילות. Assay אנו משתמשים דומה לassay שפותח למסך בעמידות לתרופה בוירוס מבודד מהחולים 16-18. למרות assay ניתן להשתמש בם ללא שינוי למסך עבור תרכובות שיכולים לחסום שעתוק לאחור איידס, אנו descrIBE באמצעות assay להעריך במעכבים. IN הוא אנזים נגיפי חיוני שמוסיף את ה-DNA הנגיפי לתוך הגנום התאי 19. למרות מספר מבטיח במעכבים מפותחים, שחלקם כעת בתהליך של ניסויים קליניים, רק 20 Isentress, 21 (הידוע גם בRaltegravir או RAL) ולאחרונה, Elvitegravir (EVG) 22 וDolutegravir (DTG) 23 היו שאושר על ידי ה-FDA. תרכובות אלו הן פעילים נגד שני HIV B ו-B תת הלא בתרבית תאים ובחולים 24, 25. עם זאת, טיפול בRAL בוחר לעמידים לתרופות HIV-1 במוטציות, כולל Y143R, N155H, וG140S/Q148H 24, 26-31. N155H וG140S/Q148H גם להפחית את היעילות של EVG, המדגישה את הצורך לעצב ולפתח את הדור שני במעכבי העברת גדיל (INSTIs) כי הם יעילים נגד מוטציות עמידות אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

למרות מספר תרופות אנטי HIV אושרו, יש עדיין בעיות עם רעילות ועמידות לתרופה. זה מדגים את הצורך לזהות תרכובות חדשות שיכול לעכב זיהום על ידי זני HIV-1 הנפוץ בסמים עמידים עם רעילות מינימאלית. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי לקבוע את cytotoxicity ויעילות של מתחם כנגד זנים נגיפיים WT ומוטציה הסלולריים במהירות. שורת תאי המטרה הרצויה היא זורעים בצלחת 96 היטב, ולאחר דגירה 24 שעות, באופן סדרתי דילולים של התרכובות להיבדק מתווספים. אין מניפולציות נוספות נדרשות למבחני cytotoxicity הסלולרי; עבור אנטי HIV מבחני סכום קבוע מראש של או WT או וקטור HIV-1 עמיד בפני תרופה המבטא לוציפראז מתווסף לתאים. Cytotoxicity נמדד באמצעות assay ATP תלוי הארה ואת ההשפעה של התרכובות בinfectivity נמדד על ידי קביעת סכום lucifeRase בנוכחות או היעדר מעכבים המשוערים. assay הקרנה זה לוקח 4 ימים כדי להשלים ויכולים להיות מוקרן תרכובות מרובות במקביל. תרכובות מוקרנות בשלושה עותקים והנתונים מנורמלים לרמות infectivity / ATP בהעדר תרכובות יעד. טכניקה זו מספקת מדידה מהירה ומדויקת של היעילות ורעיל של תרכובות אנטי HIV פוטנציאליים.

אם assay (איור 1, על שלבים 1 ו -2) בוצע בהצלחה, ולאחר מכן את ערכי לוציפראז צריכים להיות דומים לנתונים המוצגים בטבלה 2 סריקה על פני טווח הריכוז.; מתחם פוטנציאל חזק יגלה הגברת פעילות לוציפראז משמאל לימין, והשליטה צריכה להיות פעילות לוציפראז הגבוהה ביותר. אם פעילות לוציפראז אינה עולה על 0.1 יחידות יחסית בלוציפראז (RLUs) על פני טווח הריכוז, זה בדרך כלל מצביע על כך שהמתחם הרג את התאים. אם נתוני לוציפראז הוא גדולים או שווה ל2.0 RLUs בכל דילולים סדרתי, ולאחר מכן את התרכובות לא היו מסוגלים לעכב HIV-1 זיהומים בריכוזים שנבדקו. זומם את הריכוז של התרכובות לעומת עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז בKaleidagraph (לוח 3, חלק א &#39;), לאחר ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית, יפיק תוצאות דומות לt<html> צינור שמוצג בטבלה 3, ב &#39;חלק <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. הכנה של HIV-1 מניות ויראלי וההתקנה של סלולארי Cytotoxicity ויחיד בסיבוב Infectivity מבחני. בשלב 1, תאי 293T הם transfected עם pNL4.3ΔEnv.LUC וVSV-G וטופחו במשך 48 שעות כדי לייצר וירוס 34 . הווירוס שנקטפו ואוחסן (הוקפא ב -80 מעלות צלזיוס בaliquots) עד שהוא השתמש במבחני infectivity. עבור שלב 2, תאי HOS הם זורעים בצלחת 96 היטב וטופחו במשך 24 שעות. לאחר מכן תאי preincubated עם דילולים סדרתי של התרכובות להיבדק במשך 3 שעות ולאחר מכן נגוע בוירוס (או WT או סמים עמידים). לאחר דגירה 48 שעות, פעילות לוציפראז נמדדת. &quot;Width =&quot; le1.jpg 300 &quot;/&gt; טבלת 1. תרופות הקרנת Prototype דילול סדרתי. הקרנה מחמירה יותר כרוכה 11 דילולים סדרתי אשר בדרך כלל מתחילים ב 10 מיקרומטר ויסתיימו ב0.0005 מיקרומטר. דילולים סדרה מוכנים 10x; יש תאי 100 μl ושל וירוס 100 μl בכל טוב). בכרך זה ולאחר חישובים אלה, דילולים סדרתי יהיו מספיק בשביל 3 שורות של צלחת 96 היטב כולו. מבחני cytotoxicity ערוכים באופן דומה; עם זאת 11 דילולים סדרתי להתחיל ב250 מיקרומטר ויסתיימו ב0.05 מיקרומטר. רק 11 μl של דילולים נוספים לבארות בצלחת המכילות תאי 100 μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלה 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; טבלה 2. Readout וקביעת עיכוב אחוז מבלוציפראז פעילות נתונים בלוציפראז איתותים. טבלת הנתונים מציגה סדרה טיפוסית של נתונים לוציפראז למתחם מוצלח. הטבלה מציגה גם את החישובים הנוספים דרושים על מנת לקבוע את עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז וCC 50 וIC 50 ערכים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלה 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> לוח 3. ינארית ניתוח רגרסיה טבלת נתונים. חלק א &#39;. גרפים טווח הריכוז בשימוש לעומת עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז בKaleidagraph יפיק את עקומות העיכוב המתאימות. חלק ב &#39;, עקומות העיכוב מוגדרות על ידי פרמטרית 3תפקוד ובכושר לנתונים על ידי רגרסיה ליניארית sigmoidal מנתח 18. טבלת נתונים זה משמש לאחר מכן בשיתוף עם Microsoft Excel כדי לחשב את ריכוזי התרופה הנדרשים כדי לעכב אינטגרציה וירוס וcytotoxicity הסלולרי ב -50%, למשל IC 50 וCC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Views.  National Cancer Institute.  כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1. 

Video: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.