We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children&#8217;s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+immunological+synapses.">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. u. p. f. e. r. H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers.">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li><li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces.">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li><li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time,+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins.">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers.">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution.">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-field+optical+nanoscopy.">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+(TIRF-STED-FCS).">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li><li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses.">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li><li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells.">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture.">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

החידוש במחקר הנוכחי הוא שהוא משלב טכניקת SLB עם STED ללמוד סינפסות תא NK. מחקרים קודמים צילמו bilayer השומנים עם TIRF ללמוד היווצרות תאי T סינפסה 8 וסחר במולקולת איתות על קרום הפלזמה 6. אחרים תארו הדמיה STED של סינפסות תא NK באמצעות שקופיות זכוכית מצופה נוגדן 13,14. השיטה ההיברידית המתוארות כאן עוד בונה על מאמצים אלה על ידי ההדמיה סינפסה תא NK עם הבהירות המשופרת המוענקת על ידי הדמיה ברזולוציה סופר על פני השטח bilayer שומנים בדם, אשר מודלים טובים יותר המשטח הדינמי של APC. למרות SLBs הוא ממברנות מלאכותיות חסרות של שלד תא, רפסודות שומנים בדם, וligands האחר שתאי יעד בפועל או נגמ&quot;שים בעלי, טכניקה זו יכולה לשחזר תכונות חשובות כגון הניידות והתמצאות של הליגנדים. הדבר זה מאפשר למערכת SLB לשמש כגישת הרדוקציוניסטית בt לנתחהוא התרומה של קולטנים וligands בודדים להיווצרות של IS והדינמיקה של IS. התכונה החשובה ביותר של SLBs היא שחוקרים יכולים לשלב טכניקה זו עם גישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה confocal וTIRF. כניסתה של מיקרוסקופיה STED עוד יותר מגדילה את היתרון הזה, מספק תובנות חסרות תקדים למחקר והיישומים הקליניים שלה. ביקורת פוטנציאלית אחד של מערכת זו היא שSLB לא כראוי לחקות את פני השטח המורכבים של APC, ובכך הוליד תכונות אנטומיים פוטנציאל הלא-פיסיולוגיות בסינפסות וכתוצאה מכך. אמנם נכון שהרפרטואר המוגבל של מולקולות פני השטח על SLB לא לשחזר את פני השטח מאוכלסים הטרוגני של APC באופן מלא, מגבלה זו יכולה להיות גם יתרון בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לקבוע את ההשפעה של אינטראקציות קולט ויגנד בודדות על היווצרות הסינפסה . Tהנה כמה צעדים מכריעים בתהליך. בין הקריטי ביותר הוא חמצון של יפוזומים למנוע באמצעות כל הזמן באמצעות ארגון לעקור את החמצן בצינור והפתרון, כמו בשלבים 1.10, 2.6, 2.11 ו. חמצון של השומנים יגרום ניידות שומנים ירד, שהקשתה על היכולת של חלבוני פני השטח כדי לנוע בחופשיות ולהשתתף בבניית הסינפטי כך. כמו כן, הוא גם חיוני כדי להסיר את כל כלורופורם בliposome על ידי lyophilization (שלב 1.2). בקביעת צפיפות חלבון בbilayer השומנים בדם, יש חשיבות לפיזור ראשון חרוזים סיליקון לתוך השעיה הומוגנית חופשית מאשכולות. במידת צורך, ניתן ליישם sonication של חרוזים. בהרכבת SLB, הצעדים המוקדמים (5.1-5.8) בה coverslips מנוקים, הטיפות ממוקמות, וcoverslip מודבק חיוניים. טעות בכל אחד מאלה יכול לחייב תחילת הניסוי מעל (מהרישה של הסעיף 5). מסיבה זו, זהתרגול טוב כדי לנקות יותר מאשר coverslips יהיה צורך כדי לחסוך זמן במקרה של תקלה. ללא אשכולות הוא הנושא השכיח ביותר בעבודה עם מערכת זו. אם, כאשר לדמיין את התאים בשלב האחרון, אחד לא מצליח למצוא שום סינפסות ניאון, יש כמה צעדים שניתן לנקוט. כתם נוסף לקולטן על פני קרום תאו המקור ניתן להוסיף לחדר כדי לוודא שהתא לא יצר סינפסה עם bilayer, בעוד תאים יכולים לדבוק הלא-במיוחד על פני השטח coverslip זכוכית או bilayer, חלבוני פני השטח synaptically-מעורבים צריכים מופיע אשכולות להבדיל במטוס של ממשק התא-bilayer, ואילו חלבוני פני השטח היה מעורבים בקרב אמורים להופיע כתמים מפוזרים כסביב ההיקף של התא. צריכה שיטה זו נכשלת, יש לבדוק התאים שלהם באמצעות זרימת cytometry כדי להבטיח שהסמן המסוים אחד מקווה ללמוד בא לידי ביטוי בשפע נאות על פני התא. הגנה של מחזור משטח מסויםידוע ins להיות למטה מוסדר מעל לטווח ארוך בתרבות vivo. בעוד פרטי פרוטוקול זה במפורש כיצד לחזות היווצרות הסינפסה תאי NK, מערכת SLB יכול לשמש כדי לחקור היווצרות הסינפסה בכל immunocyte ניתן להעלות על הדעת, פשוט על ידי החלפה של יגנד העיקרי בשלב 5.11. ligands מרובה גם ניתן להוסיף בו-זמנית. אחד גם לא צריך להשתמש במערכת streptavidin ביוטין לדבקות חלבוני פני השטח בתוך bilayer. ניקל-נ.ת.ע: אינטראקציות היסטידין גם בת-קיימא. עם זאת, בשל החוזק הגבוה והספציפיות של streptavidin: האינטראקציה ביוטין, המעבדה שלנו מעדיפה מערכת זו. אפשר גם לשנות את הריכוז של תאים הוסיפו על bilayer מהצפיפות שנקבעה בשלב 5.13, כמו גם את משך תקופת הדגירה לאחר מכן כדי לצפות סינפסות בשלבים שונים של התבגרות. זה אפילו יכול להתבצע בשידור חי, אם כי זה כמובן אינו כולל את האפשרות של הדמיה str תאיתuctures (אלא אם כן הם כבר מסומנים עם תג ניאון התמזגו; המעבדה שלנו משתמשת בכמה שורות תאים שהשתנו כאמור). בשל הרמה הגבוהה של התאמה אישית אפשרית בפרוטוקול זה, אחד יכול להשתמש בטכניקת SLB הבסיסית, יחד עם ההדמיה STED, כדי לטפל במגוון רחב מאוד של שאלות באימונולוגיה, ביולוגיה של תא, וביוכימיה, כולל דינמיקה בסיסית שומנים 15, היווצרות הסינפסה 16, גרורות איתות תאית 17, ותאים סרטניים 18.

סינפסה החיסונית (IS) נמצאת בצומת קריטית להפעלת תא ותפקוד 1. זה המדיום העיקרי שבאמצעותו מצגת אנטיגן וחסינות תא בתיווך מתבצעים. המחקרים המיקרוסקופיים המוקדמים של היווצרות הסינפסה מנוצלים מערכת המצומד תאי תאים 2. המגבלה העיקרית בגישה זו היא שרוב conjugates ייחשב &quot;בפרופיל&quot;, כפי שהוא היה, ובכך מגביל את מבטו של הצופה של המבנה הסינפטי עצמו. בשנת 1999, המעבדה דסטין התייחסה מגבלה זו על ידי שימוש בטכניקת bilayer שומנים נתמך זכוכית (SLB) 3, שהיה חלוצה קודם לכן על ידי 4,5 המעבדה McConnel. גישה זו מסולק תאי הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים) לטובת משטח שומנים מישוריים-נתמך זכוכית, שאליו יכולים להיות מצורפים חלבונים ולנוע בחופשיות בשני ממדים. באמצעות שיטה זו, דסטין ועמיתים הצליחו להציץ ישירות לתוך tהוא סינפסה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוה, ובפעם הראשונה לקבל מבט &quot;פנים אל פנים&quot; במבנה של IS. עם השימוש במערכת SLB, הפרטים שבה ניתן דמיינו IS הוגבל רק על ידי המגבלות של טכניקות הדמיה הנוכחיות 6-8. באמצעות שימוש בטכניקות תאורה סטנדרטית, הרזולוציה המינימלית (כלומר, מרחק מינימאלי בין שני עצמים נפרדים שבה הם יכולים להיות מכובדים) כבר &lt;200 ננומטר על בסיס הקריטריון של ריילי 9. מגבלה זו מעכבת את ההדמיה של מבנים המרכיבים את סינפסה יפים מאוד, בקנה מידה מולקולרית, ועד פיתוח טכניקות הדמיה ברזולוציה סופר 10-12, הדמיה של מבנים אלה הייתה מרותקת להדמיה של תאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. עם כניסתו האחרונה של מגוון רחב של טכניקות ברזולוציה סופר, כגון SIM (מיקרוסקופיה תאורה מובנה), PALM (מיקרוסקופיה photoactivated לוקליזציה), STORM (מיקרוסקופיה אופטית שחזור stochastical), וSTED 10-12, חוקרים יכולים ללמוד מבנים הסינפטי אלה בפירוט חסר תקדים, שבו יש בתורו סיפק הבנה הבהירה יותר ויותר של עכשיו. היתרונות של מיקרוסקופיה STED תוארו לפני 13. כאן אנו מתארים הדמיה ברזולוציה סופר עם מיקרוסקופיה STED מצויד בליזר דלדול 660 ננומטר החדש שפותח. בהשוואה לליזר דלדול 592 ננומטר הקונבנציונלי, לייזר 660 nm מאפשר מבחר רחב יותר של צבעי ניאון (ראה http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), במיוחד אלה fluorophores האדומה. פרסומים אחרים תארו ההדמיה STED של סינפסות תא NK בשקופיות זכוכית מצופה נוגדן 13,14. כאן, מערכת SLB בשילוב עם מיקרוסקופ STED ברזולוציה הסופר ללמוד סינפסה תא NK. טכניקה זו יש יתרון על פני antibody-שקופיות מצופים של להיות פסיפס נוזל, שבו חלבוני המשטח המשובצים יכולים לנוע בחופשיות במשטח שטוח דו-ממדי (מישור xy). זה נאמן יותר מחקה את פני השטח האורגניים וניידים של תא מטרה, וכתוצאה מכך יותר טוב משחזר את היווצרות סינפסה החיסונית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. המטרה של פרוטוקול זה היא לספק למשתמש הקצה עם תיאור מפורט של איך תמונת סינפסה החיסונית של תאי NK על ידי שילוב של מערכת SLB ומיקרוסקופיה STED ברזולוציה סופר. זה יספק למשתמש קצה עם את הצעדים דרושים כדי: להכין ליפוזומים, לבנות bilayers-משובץ חלבון, לקבוע את צפיפות החלבון על bilayers השומנים בדם, ולרכוש תמונות ברזולוציה סופר באמצעות מיקרוסקופ STED. טכניקות אלה אינן מוגבלים לתחום האימונולוגיה, ויכולות להיות מנוצלת באופן רחב על פני מגוון רחב של תחומים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1330">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:316px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:475px;">Purpose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:283px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">850375C</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">18:1 Biotinyl Cap PE 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">870273C&#160;</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Argon gas, compressed</td>
			<td style="width:256px;">Airgas&#160;</td>
			<td style="width:316px;">UN1006</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A lyophilizer</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">Freezone 7740020</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lyophilizer tubes</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">7540200</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Chromatography Columns</td>
			<td style="width:256px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:316px;">sc-205558</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1 M Tris pH 8.0</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9856</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9759</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">O1008</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:256px;"><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+Tubing;rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&#160;</a></td>
			<td style="width:316px;">132676</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">96-well V-bottom polystyrene plate (untreated)</td>
			<td style="width:256px;">Corning</td>
			<td style="width:316px;">3896</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Non-functionalized silica beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:316px;">SS06N</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:316px;">14-959-2A&#160;</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">QuantumTM MESF beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:316px;">Variable</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Casein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">C0875</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">HEPES buffered saline + 1% HSA</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:316px;">434301</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Fluorescently-labeled biotinylated protein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">80608</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">25x75 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">10812</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrogen peroxide (30%)</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientic&#160;</td>
			<td style="width:316px;">BP2633</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">258105</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:256px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:316px;">B20656</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lens paper</td>
			<td style="width:256px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:316px;">54826-001</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Type F Immersion Oil</td>
			<td style="width:256px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:316px;">11 513 859</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A Leica TCS STED microscope</td>
			<td style="width:256px;">Leica</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

איור 1 מציג את התוצאה של צפיפות הנוגדן על bilayer השומנים. העיקרון הוא להשתמש חרוזים סטנדרטיים כדי להפוך את עקומת התקן של MESF לעומת MFI באמצעות cytometry זרימה (א). MFI של סדרת המדגם הוסב לMESF באמצעות העקומה סטנדרטית. צפיפות הנוגדן על bilayer השומנים מתואם באופן ליניארי עם ריכוז הנוגדנים (B). איור תמונת STED המשולש הצבע 2 תכנית של סינפסה NK על bilayer שומנים מישוריים זכוכית תמיכה. נוגדן Anti-CD16 על bilayer השומנים מצטבר, מפעילה מערך F- אקטין ואת הקיטוב וחדירה של perforin דרך הרשת F- אקטין בלוח המוקד של סינפסה החיסונית בתאי NK. שימוש בגישה משולבת זו, ניתן לצפות בצורה נקיה microclusters של fluorescently שכותרתו אנטי-CD16 בתוך SLB, אשר ישירות משקף את האשכולות של CD16 על תא NK. בהשוואה לתמונת confocal הקונבנציונלית, מבנה CENTRA CD16אשכול l ניתן להבחין בקלות רבה יותר בתמונה STED בשל הקרינה הסביבה המדולדלת. יתר על כן, ultrastructure של cytoskeleton אקטין נתפס עם רזולוציה משופרת באופן משמעותי. עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות 16,17, גרגרי ממס perforin חיובי נראים ממוקמים מעל האזורים של צפיפות F- אקטין נמוכה בתמונה STED, פרט מכריע שרובו הולך לאיבוד בתמונה confocal. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> איור 1. צפיפות של נוגדן 3G8 על bilayer שומנים. () מתאם לינארי בין MESF וMFI לסדרה סטנדרטית. (ב) קשר לינארי בין צפיפות חלבון וריכוז סדרת דילול חלבון מדגם ל, המציגה את מספר המונומרים חלבון fluorescently שהכותרת ל יחידת שטח כפונקציה של ריכוז הולך וגובר על si מצופה שומניםחרוזים Lica. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> איור 2. ההדמיה STED של סינפסה NK על bilayer שומנים מישוריים. תאים הראשוניים NK היו מגורה על SLB מכיל biotinylated אנטי-CD16 (אדום) שכותרתו fluorescently, קבועים, permeabilized, ולאחר מכן מוכתם בphalloidin (כחול) ואנטי-F- אקטין (ירוק). תא יחיד היה צילם ראשון תחת הגדרת confocal הרגילה, ולאחר מכן הגדרת STED. תמונות Confocal וSTED היו deconvoluted באמצעות תוכנת הויגנס. סרגל, 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.2K Views.  Texas Children's Hospital. We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Video: Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

להקל על ניתוח נתונים החיסוני עם טכניקות Analytic חזותית

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, however, the lateral resolution of super-resolution imaging is only ~100 nm. The low resolution is mainly due to the high autofluorescence background of photosynthetic cells caused by high-intensity lasers that are required for super-resolution imaging, such as stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, we describe a photobleaching-assisted STORM method which was developed recently for imaging the marine picocyanobacterium Prochlorococcus. After photobleaching, the autofluorescence of Prochlorococcus is effectively reduced so that STORM can be performed with a lateral resolution of ~10 nm. Using this method, we acquire the in vivo three-dimensional (3-D) organization of the FtsZ protein and characterize four different FtsZ ring morphologies during the cell cycle of Prochlorococcus. The method we describe here might be adopted for the super-resolution imaging of other photosynthetic organisms.

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Here we describe a photobleaching method to reduce the autofluorescence of cyanobacteria. After photobleaching, stochastic optical reconstruction microscopy is used to obtain three-dimensional super-resolution images of the cyanobacterial FtsZ ring.

Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...