מטרת השיטה היא ליצור סינפסה אימונולוגית שהיא דוגמה להטיית תא לתא שנוצרה על ידי תא מציג אנטיגן ולימפוציטים עוזרי T. המטרה שלנו היא לתעד את השלבים הראשונים של היווצרות הסינפסה החיסונית ולתקליט את אירועי הסחר המתרחשים בלימפוציטים T-helper. אלה יובילו בסופו של דבר להפרשה מקוטבת בסינאפסה החיסונית.
הגישה המוצגת כאן כרוכה בהטיה מתא לתא, רכישת זמן לשגות, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית שדה רחב, ועיבוד תמונה לאחר מכן. זה משפר את יחס האות לרעש של התמונות, משפר את הרזולוציה הזמנית, ומאפשר רכישה בו זמנית של מספר פלואורוכרומים בהטיות סינפטיות מתפתחות ומפחית הלבנת פלואורסצנטיות. בנוסף, הפרוטוקול תואם לפרוטוקולי קיבוע תאי קצה שיאפשרו כתמים וניתוח של כשל חיסוני.
פרוטוקול זה תואם גם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לסריקת לייזר ולטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות אחרות. הדגימה של ההליך תהיה אנה בלו, סטודנטית לתואר שני, אלחנדרו גארידו, טכנאי, וסולאנג' מורנו, סטודנטית לתואר שני. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף 150 microliters של פיברונקטין לכל באר של שקופית תא מיקרווול שמונה הדגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד שעה אחת.
לאחר תקופת הדגירה, שאפו את הפיברונקטין ושטפו כל באר עם 200 מיקרוליטרים של PVS במשך שתי דקות ברעידות עדינות. חזור על לשטוף את זה שוב ולהשאיר את לשטוף השני היטב. להעביר 10 מיליליטר של תרבות מוקדמת של תאי ראג'י לצינור V-תחתון 15 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו בעדינות את גלולת התא במדיום חם ושלם בריכוז של מיליון תאים למיליליטר. כדי לתייג את תאי הראג'י, העבר את מספר התאים הנדרש בתאים בינוניים לתרבות לצינור של שני מיליליטר.
עבור השקופית תא מיקרווול שמונה, סך של 1.6 מיליליטר של השעיית תא נדרש. הוסף כחול מעקב תא לריכוז סופי של 10 מיקרומולר. תן שימוש חוזר בתאים מוכתמים בכחול של עוקב התאים והעבר 200 מיקרוליטרים של מתלי התא לכל באר של שקופיות התא המוכנות מצופות הפיברונאטין.
דגירה להחליק התא ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 30 דקות עד שעה אחת. לאחר מכן, לנער בעדינות את שקופיות התא על המיקרוסקופ כדי להבטיח כי תאי ראג'י הם דבקים. לשטוף כל היטב בזהירות עם חם, תאים שלמים תרבות בינונית כדי למנוע עודף תא גשש כחול.
ודא שתאי הראג'י נדבקים לתחתית הלוחות, והם מציגים פערים זה מזה והם אינם תואמים. 50-60% ממהתכנסות התאים מתאימים. ראשית, להוסיף סטפילוקוקל Enterotoxin E בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר לכל באר.
ודא כי תאי ראג'י הם פעום עם סופראנטיג'ן אחרת קולטן תא T מתאי Jurkat לא יזהה את SCE הסינפסה לא ייווצר. דגירה להחליק התא ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני לפחות 30 דקות. לאחר מכן, להשיג תרבות גדלה בעבר של תאי Jurkat בריכוז בין 1 ל 2 מיליון תאים למילימטר.
שימו לב לתאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור V-bottom 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו בעדינות את התאים במדיום תרבותי חם ושלם בריכוז של מיליון תאים למיליליטר.
לאחר מכן לשמור על תאי Jurkat בתרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזים פחמן דו חמצני עד מוכן לשימוש. אחזר את שקופיות התא המכילות את גשש התאים עם התווית הכחולה סטפילוקוקוס Enterotoxin E פעמו דבק ראג'י תאים מהאינקובטור. בזהירות שאף את מדיום התרבות מכל באר אחד אחד עם פיפטה להציב בפינה של הבאר.
מיד להחליף את המדיום עם 200 microliters של תאי Jurkat resuspended במדיום תרבות התא. אם מתבצעת מעידת זמן, המשך במהירות למיקרוסקופ. אתר את השקופית התאית במלצר האחסון הזמני של המיקרוסקופ ובחר כמה שדות מתאימים.
מכינים את המיקרוסקופ ואת תא הדגירה לפני ההדמיה. לאחר שתאי Jurkat נוספו לכל באר המכילה את תאי הראג'י, אתר במהירות את השקופית התאית microwelled על החממה מבוים מיקרוסקופ שחומם מראש ובחר כמה עמדות XY. אם רק מתוכנן ניסוי נקודת קצה, הדגירה את השקופית התאית ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שעה עד שעתיים.
לאחר תקופת התרבות, בדוק אם יש היווצרות חידה ולאחר מכן תקן את ההצמתות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לתקן את התאים, להוסיף RPMI חם ללא FCS בעדינות לנער. שאפו את ה- RMPI והוסיפו 200 מיקרוליטרים של PFA או אצטון לפני ההיכל לכל באר.
דגירה להחליק התא בטמפרטורת החדר או על קרח במשך 20 דקות. לאחר מכן לשטוף כל טוב פעמיים עם PVS ולהוסיף 200 microliters של פתרון מרווה. במחקר זה נוצרים סינפסות חיסוניות של Jurkat-Raji, ואת השלבים המוקדמים של היווצרות סינפסה אימונולוגית הם בתמונה כראוי.
אסטרטגיה זו גורמת להיווצרות הסינפסה האימונולוגית ובו זמנית מבצעת את הדמיית זמן הכשל. נציג סינפטית Jurkat-ראג'י conjugates המתקבלים טכניקה זו מוצגים כאן, כולל תמונה של ערוץ המשדר, הערוץ הכחול גשש התא, ושני ערוצים אלה התמזגו. ניתן לראות כמה תאובות סינפטיות, כולל אלה המורכבות מתא ג'ורקאט אחד בלבד ומספר תאי ראג'י, שהם תאובות מורכבות.
הפחתת ריכוזי התאים תקיף את היווצרותם של תותביים תאיים מורכבים, אך לא תספק מספיק תחבורות תאים לניתוח הבא של תנועה מקוטבת, אשר בתורו יקטין את הסיכויים למצוא ולדמיין קונג'ות סינפטיות מתפתחות. פירוק של תמונות ערוץ הפלואורסצנטי GFP-CD63 מתבצע עם תוכנת deconvolution מתאימה באמצעות אפשרות אופטית שדה רחב ואת הפרמטרים האופטיים הנכונים. ערוץ מנוון זה מוזג לאחר מכן לערוץ הרחב הכחול של עוקב התאים.
יש שיפור הן ביחס האות לרעש והן החדות. ערימת Z מייצגת של תקציר סינפסה אימונולוגי קבוע מוצגת כאן. Immunofluorescence מבוצע באמצעות פאלודין כדי לדמיין את F-actin, אנטי CD63 כדי לדמיין את MVB, ואנטי גמא-tubulin כדי לדמיין MTOC בעוד גשש התא כחול שכותרתו תאי ראג'י.
ההטרנספיקציה האופציונלית של תאי היורקאט תאפשר הדמיה של תעבורת גרגירי הפרשה בתאים חיים. לדוגמה, כאשר GFP-CD63 מבוטא, ניתן להקליט את התנועה של ורי הווסיקים המעוטרים ב- GFP-CD63. הפרוטוקול תואם לפרוטוקולי קיבוע נקודת קצה שיאפשרו פרוטוקולי כתם וניתוחים נוספים של כשל חיסוני.
קיימים מודלים ניסיוניים של פרודוקטיביות שעשויים לפשט את ההדמיה בסינפסה החיסונית, אך מודלים אלה אינם מחקים את המשטח המורכב והבלתי סדיר על תאי מציג האנטיגן שעשויים לייצר אינטראקציות לא פיזיולוגיות בסינפסה החיסונית. הגישה המתוארת כאן מתאימה להתרבות ולאשר כמה מורכבויות ביולוגיות המתרחשות בסינאפסה החיסונית. Superantigen הוא רעלן מסוכן אז אנא הקפד ללבוש כפפות, ולשחרר את הקצה בשימוש על הקופסה המסוכנת.
