תואר שני נתמכה על ידי מענק של שרדינגר קרן המדע האוסטרי (FWF, J3086-B11) ותודה מקס פלנק-החברה לתמיכה כספית ומנהלית. GS נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS13-030). JH נתמכה על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS14-031).

<ol>
	<li>Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do-it-yourself+guide:+how+to+use+the+modern+single-molecule+toolkit.">Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit.</a> Nat Methods. 5, 475-489 (2008).</li><li>Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+with+single+molecules.">Super-resolution fluorescence imaging with single molecules.</a> Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).</li><li>Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+mapping+of+mast+cell+membranes+reveals+primary+and+secondary+domains+of+Fc(epsilon)RI+and+LAT.">High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT.</a> The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).</li><li>Lillemeier, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+and+Lat+are+expressed+on+separate+protein+islands+on+T+cell+membranes+and+concatenate+during+activation.">TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation.</a> Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).</li><li>Woof, J. M., Burton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-Fc+receptor+interactions+illuminated+by+crystal+structures.">Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures.</a> Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7:+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy.">(Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).</li><li>Huang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms.">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).</li><li>Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence.">Total Internal Reflection Fluorescence.</a> Ann. Rev. Biophys. Bioeng.. 13, 247-268 (1984).</li><li>Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispers+and+the+kiss+of+death:+directional+secretion+in+T+cells.">Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells.</a> Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies.">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).</li><li>Sherman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+nanoscale+organization+of+signaling+molecules+downstream+of+the+T+cell+antigen+receptor.">Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor.</a> Immunity. 35, 705-720 (2011).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li><li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+TCR-pMHC+binding+using+a+FRET-based+microscopy+assay.">Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Natkanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+mechanical+energy+to+discriminate+antigen+affinities.">B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities.</a> Science. 340, 1587-1590 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת מספקת הזדמנות הייחודית ללמוד את ההתנהגות של חלבונים בסביבה הסלולרית האם שלהם. הדמיה מולקולרית הופכת אטרקטיבית יותר ויותר ולכן לקהילה מדעית רחבה, עדיין מדעני חיים רבים עדיין נרתעים מההשקעה הראשונית בטכנולוגיה ומומחיות. היתרון העיקרי הנובע מהרכבת מערכת ההדמיה של האדם עצמו הוא שזה יכול להיות מותאם בקלות לצורך הספציפי של כל אחד. ניסויים כפי שהוצע במסמך זה אינו TIRF קרן עירור יכולה להיות מיושמת בקלות, בנוסף לנתיב TIRF אור הקיים, אם צילום הלבנת מהירה ומוגדרת (או -activation) של fluorophores וligands היא רצויה, למשל בעת ביצוע FRAP או יגנד משחררות רפרוף 14 . המבוא של מפצל קרן פליטה מאפשר הקלטה בו זמנית של לפחות שני ובמקרים מסוימים עד ארבעה ערוצי ניאון. הרשימה של סיומות היא במהות מוגבלת רק על ידידמיונו של אחד. לדוגמא, יישום גלגל מסנן פליטה ממונע בנתיב הפליטה מאפשר מיתוג מהיר בין עד עשרה ערוצי ניאון שונים. כאשר שילוב של שני גלגלי מסנן פליטה ממונעים (כל מצויד בחריצים 10 מסנן) בסדרה, עד 18 ערוצי ניאון ניתן לקרוא את. הדמיה מבוססת TIRF יכולה להיות כהשלמה עם מדידות גיוס סידן והשתקפות הפרעות מיקרוסקופית (IRM) לאחר האינטגרציה של נתיב מנורת קסנון עירור או מרקורי. IRM הוא השיטה של ​​בחירה כדי להמחיש את המידה שבה תאים מחוברים למשטח הזכוכית או SLB ולכן יכולים לספק מידע קריטי כאשר לפרש נתונים הדמיה מבוסס TIRF. הקמת קרן עירור התרחבה בשימוש במראה dichroic פשוט וליזר נוסף של 405 ננומטר מאפשר ביצוע מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (PALM) או מיקרוסקופי שיקום אופטי סטוכסטיים (סערה), כלומר, שתי superresolutמתודולוגיות יון עם דיוק מיקום מתחת לגבול ההשתברות של 15,16 אור הנראה. עם זאת, הצלחת ניסוי היא לא רק עניין של חומרה מתאימה. לקחת את מלוא יתרונות של הדמיה מבוססת TIRF מופחת רעש, תאים צריכים ליצור קשר למשטח באופן שאינו מטיל מגבלות על פני התא או שמפריע לפיסיולוגיה של קרום הפלזמה שלהם. SLBs פונקציונליות עם החלבונים מתאימים להדבקת התא עולים גם מתאימים למטרה זו, כי כל ligands המשובץ-SLB הם רוחבי ניידים ולשנות את המיקום לרוחבם בתוך bilayer בתגובה לקולט דינמיקה מחייבת והפרדה. כדי לייצר SLBs באופנה לשחזור, עדיף להתחיל עם רכבי שטח של טוהר גבוה. כפי שתואר במסמך זה, זה כך קריטי להסרת שלפוחית ​​multilamellar, שמיוצרים גם במהלך sonication, בשני שלבי ultracentrifugation כמו שאני אלהnterfere עם הקמתה של SLBs הרציף הכולל גבוהות נזילות. SLBs של צורה באיכות גבוהה רק על משטחי זכוכית נקיים. ברגע שיש להשתמש בשקופיות זכוכית לנקות באופן מיידי או מאוחסנות בואקום. חשוב לציין, SLBs לא חייב להיות חשוף לאוויר כמו זה יוביל לשיבושם. שטיפת SLB כרוכה, כפי שמוצג, חיץ שטיפה עם השימוש בפיפטה סרולוגיות, כמו זה הוא לא רק אבל גם הליך-חיסכון בזמן שמירה. במהלך קציר וטיהור של חלבוני SLB-תושב יש להימנע בשימוש בחומרי ניקוי. סיבה לכך הוא חומר הניקוי יפחית באופן משמעותי את הניידות חלבון גם כאשר קיימים בכמויות זעירות. כדי לעקוף את הצורך בחומרי ניקוי כולם יחד, ביטוי מסיס של ligands מצויד תג polyhistidine מופרש מומלץ בתאי יונקים או חרקים. אם מקפל מגופי הכללת E.coli נדרש, זהירות חייבת להיות מיושמת כדי להסיר חומרי ניקוי ביעילות מהגופים ההכללה לפני בלתי ומקפל. יתרון עיקרי של העסקת תוצאות SLBs מהטבע מודולרית וreconstitutive, המאפשר לנתח את התפקיד של אינטראקציה קולטן ליגנד ניתנה להפעלת תא והידבקות תא ספציפי. בהקשר זה חשוב להזכיר כי DGS נת&quot;ע-Ni צריך להיות נוכח ב 10% בתוך SLB כדי למנוע חלבונים המתחרים על אתרי קישור נת&quot;ע-NI. כאשר העסקת SLBs מחסה רק 1% או 2% DGS נת&quot;ע-ניקל, ירידה בעמותה של מיני חלבון מתויג polyhistidine נתון יכול להיות לב, במיוחד כאשר שיתוף דוגרים הגדלת כמויות של מיני חלבון polyhistidine מתויג שני (שלא פורסם תצפית). תופעה זו לא נצפתה בעת העבודה עם SLBs הכולל 10% DGS נת&quot;ע-ניקל. בעוד שמעולם לא נצפו הלא ספציפי מחייב כל חלבון polyhistidine מתויג נבדק לSLBs מכיל DGS נת&quot;ע-ניקל, אפשרות זו צריכה להיבדק בעת השקת חלבון בפעם הראשונה,לשם כך אנו ממליצים על השימוש בSLBs נטול DGS נת&quot;ע-ניקל (החלבון לא צריך לקשור). שנית, בעת השימוש בSLB מכיל DGS נת&quot;ע-ניקל, החלבון צריך לבוא לגמרי לאחר שטיפת SLB עם PBS המכיל 300 מ&quot;מ imidazole. יתרון משמעותי נוסף של העסקת SLBs הוא שאינטראקציות חולפות ואירועי איתות יכולות להיות במעקב עם הרזולוציה spatiotemporal המשופרת 17-19. זה לפחות בחלקו, כי תהליך מחייב שלושה ממדים מצטמצם בעצם לשני ממדי הדמיה, במיוחד בעת הקלטה במצב TIRF רעש-מוחלש. השימוש בSLBs תואם זיהוי אות מולקולה בודדת, תנאי מוקדם למיקרוסקופיה מופעלת תמונה לוקליזציה (PALM) או סטוכסטיים מיקרוסקופיה שיקום האופטית (סערה), כלומר מיקרוסקופיה superresolution עם רזולוציה מתחת לגבול ההשתברות 15,16. שיטות הדמיה מיוחדות אלה מאפשרים מולקולה בודדת פורסטר תהודת האנרגיה Traניסויי nsfer נועדו להמחיש אינטראקציות חלבון-חלבון בודדים בסביבה הסינפטי 20. גישה זו מוסברת בפירוט רב בפרסום יופיטר נקרא &quot;מדידת TCR-pMHC מחייב באמצעות assay מיקרוסקופיה מבוסס סריג&quot; 21. כאשר לפרש ניסויים מבוססי SLB אחד תמיד צריך לזכור שלא כל התכונות של קרום פלזמה של תא חי הם הוצגו על ידי SLBs, וכי חלק מהתכונות חסרות עלול להשפיע על הפיסיולוגיה תחת חקירה. אחרי הכל, חלבונים משובצים-SLB באופן חופשי לשדר ואינו מאורגנים בmicrodomains קרום כמו רוב העמיתים הסלולריים שלהם הם 5,6,22. גיליונות קרום פלזמה משותקת נגזרים מהתאים חסיד, אשר לחסוך בארכיטקטורת קרום פלזמה של תאי חיים במידה מסוימת, כבר מועסקים בהצלחה ללמוד את הספיגה מאנטיגנים-מוטבע קרום על ידי B-23 לימפוציטים. עם זאת, גם כזהקרומים לא אינטראקציה עם שלד תא דינמי מאוד וכוללים לא גמישות כפי שהם נתמכים על ידי משטח זכוכית נוקשה. לאור פערים אלה קיימים באופן ברור צורך בSLBs הנדסה, אשר מציעים אמצעים למדר חלבונים באופן מוגדר ואשר נתמכים על ידי משטחים של גמישות להתאמה או על ידי משטחים המשנים הקשיחות שלהם בתגובה להבזקי אור מיושמים באופן מקומי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ml round bottom flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-1357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50:50 beam splitter cubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BS013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>-</td>
			<td>only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>489-1312</td>
			<td>or any other heat-stable sticky tabe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>alternative to the bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator QSONICA Q700</td>
			<td>QSONICA</td>
			<td>Q700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beam splitter</td>
			<td>Cairn</td>
			<td>P280/210/MLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;chi rotary evaporator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>531-0837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td>see manuscript text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentarted hydrogenperoxide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9683.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X944.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epoxy glue</td>
			<td>Uhu</td>
			<td>45705</td>
			<td>Uhu plus sofortfest 2min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter wheel</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek chambers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser&#160;</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>-</td>
			<td>different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens</td>
			<td>Thorlabs, Newport</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGS NTA-Ni (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>790404C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical filters</td>
			<td>AHF, Chroma, Semrock</td>
			<td>-</td>
			<td>filter sets are available for many different combinations of dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>BK Precision&#160;</td>
			<td>2120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>degas before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periscope</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picodent twinsil 22</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13001000</td>
			<td>alternative to the epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power meter Lasermate-Q</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>-</td>
			<td>any powermeter sensitive in the used spectral range will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse generator</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SRS DG535&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatial filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KT310/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440782-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloromethane/chloroform</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3313.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>45237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RC M150GX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S120-AT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer Nanodrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0248</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

הארכיטקטורה של מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדת מתוארת בפירוט רב באיור 2. חלקים בודדים כגון רכיבים אופטיים ורכיבי חומרה אחרים מוסברים במבוא. נתיבי קרן עירור האופטיים, אשר להצמיח באופן מוגדר לTIRF ולא TIRF תאורה, מוצגים והסבירו באיורים 3 עד 5. שימו לב למיקום של מפצל 50:50 הקורה מול מראה פריסקופ הראשון ממוקם ב שלב מיקרומטר לתרגום (איור 5). מפצל קרן זו כופה את קרן TIRF משמשת להדמיה (מסומנת בירוק) והקרן שאינו TIRF (מסומנת באדום) המשמש להלבנה או הפעלה מוגדרת צמצם מקומי בתיווך אור מדגם (כמתואר באיור 3). השבילים בשילוב האור (איור 5, הצביעו בכתום) משתקפים דרך מראה פריסקופ השני ליציאה האחורית של MICR ההפוךoscope. כפי שהוסבר באיור 4 ומתואר באיור 2, היישום של שתיים או שלוש עדשות קמורות מתרחב פרופילי קרן לייזר ומתמקד קרן הלייזר על גבי מישור המוקד האחורי של המטרה להצמיח שתי אלומות collimated מאיר את המדגם בTIRF ו , בהתאמה, שבאינו TIRF. דוגמא לערכים שנמדדו בעוצמה הנדרשת לחישוב צפיפות ההספק בדגימה מוצגת באיור 6. אות הרקע הממוצעת לתופחת מעוצמות שנמדדו באזור המואר ומרכזי (המשמש להדמיה), נקבעה באזור בתוך שדה הראייה, שאינו מוארת בקרן הלייזר (כאן 7089 ספירה). העוצמות מתוקנות הרקע הממוצעת של המואר (1,684 ספירה) ואזור המרכז (4830 ספירה) לאחר מכן מוכפלים בגדלי האזור המקביל ללהצמיח עוצמות משולבות (1.471x 10 8 סעיפים לאזור המואר ו3.424 x 10 7 סעיפים לאזור המרכז). היחס של העוצמות משולבות בתוך האזורים המרכזיים ומוארים מניב את החלק היחסי של הכח הכולל המאיר את האזור המרכזי (0.23 או 23%). כפי שניתן לראות בסרט, את הכח הכללי צריך להיות נחוש במטרה בשימוש במד כוח במצב תאורה שאינו TIRF. בדוגמא שלנו זה מותאם ל5 mW, ובכך נותן לעליית כוחה של 5 mW x 0.23 = 1.15 mW באזור המרכז. מאז סכום 41.5 פיקסלים בדוגמא שלנו ל1 מיקרומטר 2, יש האזור המרכזי גודל של 7089 פיקסלים /41.5 פיקסלים x מיקרומטר 2 = 170.8 מיקרומטר 2. חלוקת כוחו של האור המאיר את האזור המרכזי (1.15 mW) על ידי אזור זה (170.8 מיקרומטר 2) מניבה כוח ממוצעצפיפות של 0.7 קילוואט / 2 סנטימטר באזור המרכז. איור 7 כולל תמונות ותוצאות עוצמת המקבילה fluorophores היחידה שנרכשה ברצף מהיר (לשנייה 100 מסגרות, כלומר עם מסגרת של 10 מילים-שני זמן). כדי לכמת את עוצמת האות של אזור מלבני של שבע הממוצעת על ידי שבעה (= 49) פיקסלים, המכסה את אות הקרינה, נקבעה. יתר על כן האות הממוצעת של הרקע נקבעה בתוך אזור מלבני של שבעה שבעה פיקסלים בסמיכות של אות המולקולה בודדת. האות הממוצעת מתוקן הרקע מוכפלת במספר הפיקסלים באזור (= 49) ללהצמיח אות אחת מולקולה (מסומנת באותיות מודגשות). ניסוי FRAP נציג נועד להעריך את הניידות של חלבונים שכותרתו הקרינה קשורים-SLB מוצג באיור 8. הערה באיור 8 א repetiשימוש tive של קרן התרחבה בעצימות נמוכות הדמיה ולייחד שנייה יותר צר וצמצם מוגדר קרן בעוצמה גבוהה לאבלציה fluorochrome המהירה בנקודת הזמן השנייה אפס. עוצמות ממוצעת מופחת רקע בתוך העיגול הצהוב, שכבר מנורמל על ידי ערך העצמה הממוצע הראשוני לפני דופק אקונומיקה, הם זממו באיור 8B נגד הזמן כדי להקליט את המהירות ואת המידה שבה הקרינה התאוששה. כפי שניתן לראות, יותר מ -90% (מסומנים בקו הירוק) של עוצמת bilayer הראשונית התאושש בתוך 75 שניות הבאות אבלציה fluorochrome. כתוצאה מכך פחות מ -10% מהחלבונים המשובצים בSLB המוצג הם נייחים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> איור 1. מתווה סכמטי של מערכת SLB. SLBs () עשוי POPC (90-99%) והשומנים סינטטיים DGS נת&quot;ע-Nאני (1-10%). הם יוצרים באופן ספונטני כאשר משטחי זכוכית נקיים נזקפים עם רכבי שטח בהיקף של השומנים המתאימים. (ב) לאחר שנוצר, יכול להיות מעוטר SLBs אלה בקלות עם חלבונים מסיסים מורחבים או עם C- אחד או תג N- מסוף המכיל עשר histidines (12H, ל הדימרים ICAM-1) או חלבון מולקולת שיתוף גירוי B7-1 ומולקולת הידבקות דוגמא מורחב עם שני תגים המכילים שש histidines כל (2x6H, למשל דימר αβMHC הכיתה השני). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> איור 2. סקירה כללית של נתיבי העירור ופליטת קרן. לייזרי יון גז (למשל Ar + או Kr +) יכול להיות מופעל לסגירת מהירה עם השימוש של מו האופטי acousto<html> dulators. דיודות לייזר זמינות כיום באורכי גל רבים ומייצגות אלטרנטיבה מצוינת כפי שהם יכולים להיות מווסת באופן אלקטרוני במייקרו-הזעם. שים לב שקרן לייזר יכולה להיות מותאמת בקלות עם שתי מראות (dichroic) ופיצול ושילוב עם השימוש במפצלי אלומה פשוט להצמיח שני נתיבים או יותר קורה. בדוגמא זו קרן TIRF הדמיה (לפקח על אירועים) וקרן אקונומיקה (לאו fluorophores אקונומיקה או צילום להפעיל מולקולות בכלוב באופן מוגדר צמצם) משמשות. יכולים להיות מופעלים בשני נתיבי העירור בנפרד זו מזו באמצעות השימוש בתריסים נוספים. פריסקופ מאפשר לתרגום קרן הלייזר הממוקדת במישור המוקד האחורי של המטרה ליצור תאורת TIRF של המדגם. תמונת הניאון ניתן לפצל spectrally עם השימוש במפצל קרן פליטה לפני רכישה עם השימוש במצלמה אולטרה-רגיש (למשל EM-CCD או CMOS מצלמה מדעית).קבצים / ftp_upload / 53,158 53158fig2large.jpg &quot;target =&quot; .com / / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> איור 3. התאמת תאורת TIRF ידי תרגום הקרן הממוקדת במישור המוקד האחורי של המטרה. כפי שניתן לראות נקודה של קרן לייזר המוקד מוסט בתוך מישור המוקד האחורי של המטרה מהמרכז לפריפריה באמצעות טרנסלוקציה של הקרן (באמצעות הסדר מראה פריסקופ). כתוצאה מכך אלומה מקבילה עוזבת את המטרה בתאורה מוטה עד לזווית קריטית שבו השתקפות פנימית מוחלטת קורה. שדה חלוף נוצר בממשק זכוכית התקשורת שבו השתקפות כוללת מתרחשת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה</a><html> דמות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> 4. מערכות אופטיות פשוטות איור להתמקד קרן הלייזר למישור המוקד האחורי של המטרה. כך או שלוש או שתי עדשות יש צורך להרחיב את קרן הלייזר ולהפנות אותו למישור המוקד האחורי של מטרת TIRF. שתי מערכות עדשה מכילות שגיאות הקשורים עדשה פחות משלוש מערכות עדשה ועשויות להיות מתאים יותר ליצירת קרן TIRF ההדמיה. שלוש עדשות עשויות להיות עדיפות כשמכוונות להרחבת קרן מוגדרת ונקודת תאורה עם קצוות חדים, כפי שניתן היה דרושות ללימודי העסקת צילום הפעלה או -bleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. מבואר תצלום של נתיב הקרן בחלק האחורי של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שכבר תואר באיור 2 מקל אחד בקלות ליישם שתי אלומות עירור, אחד בTIRF (מסומן בירוק) האחר במצב-TIRF שאינו (שצוין ב אדום). אלה הפכו מעולף עם השימוש במפצל 50:50 אלומה (BS). עדשות קמורות (L1 ו- L2) ממוקמות בקורה בהתאמה להתמקד על מישור המוקד האחורי של המטרה (לא מוצג). פריסקופ המורכב משתי מראות (M1 ו- M2) מנחה שני הקורות דרך נמל הכניסה למיקרוסקופ. המראה הראשון (M1) ניתן להעביר לשימוש בשלב תרגום (TS) (על ידי סיבוב בורג מיקרומטר כפי שצוין) להעביר אחד של קורות למצב TIRF. ברגע שTIRF כבר נקבע, הקרן השנייה (המשמשת לצילום הלבנת או -activation, כאן הצביעה באדום) יכולה להיות מותאמת באופן עצמאי של קרן TIRF לעזוב את המטרה שבאינו TIRFמצב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> איור 6. מדידת הכח בשטח של נקודת התאורה המרכזי. כמצוין בחר אזורים המתאימים של עניין, המשקפים רקע, האזור כולו המואר (IA) ואזור המרכז (CA), שבו אירועים יהיו מאוחר יותר יירשמו. לחסר ערכי רקע מאלו שנרשמו לIA ו- CA ולשלב את העוצמות על ידי הכפלת עוצמות ממוצעת מתוקנות עם מספר הפיקסלים הנוכחיים בתוך כל אזור (= עוצמות משולבות). מחלקים את עוצמת המשולבת של CA על ידי זה של IA להגיע לשיעור של כוח הקרן מאיר את CA (בדוגמא זו: 23%). לקבוע את כוחו של האור המאיר את CA על ידי הכפלת כוח הקרן הכוללת (כאן: 5 מ &#39;W) עם השיעור מאיר את CA (כאן: 0.23). כדי לקבוע את גודלו של האזור המרכזי להכפיל את השטח (כאן: 7089 פיקסל) עם גורם פיקסל לאזור המרת גודל (כאן: 1 / 41.5 מיקרומטר 2 -1 פיקסל). כדי להגיע לצפיפות ההספק הממוצעת של אור העירור מאיר את CA, לחלק את הכח (כאן: 1.15 mW) על ידי הגודל של CA. (כאן: 170.8 מיקרומטר 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> איור 7. Quantitation של אותות מולקולה בודדים. () כמובן זמן של fluorophores אחת על SLB. אזור בגודל 7 x 7 פיקסל של עניין (ROI, צהוב) ממוקם סביב האות לכימות. רקע נקבע מ7 x 7 פיקסלים שכניםהחזר על השקעה (ירוק). (ב) לכמת בעוצמות פיקסל ממוצעת רשומות. כדי לקבוע את אות המולקולה בודדת, ערכי רקע (ROI הירוק) מופחתים ערכי אות (ROI הצהוב) ומוכפלים 49. (ג) בעוצמות מולקולה יחידה של fluorophore אחד הם זממו נגד זמן. שים לב, כי נקודת זמן msec 90 מושמטת כfluorophore נמצא בתהליך של הלבנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> איור שחזור הקרינה 8. לאחר photobleaching ניתוח (FRAP) כדי לקבוע את היושרה של SLB. () FRAP בוצע על bilayer ביצוע IEK / MCC-אלקסה פלואוריד 647. תמונה 10 כל הניסוי מוצגת. (ב) quantitation FRAP של הניסוי שמוצג ב(). ערכים מצביעים על עוצמות ממוצעת (I) בהחזר על ההשקעה הצהובה מוצג ב() מחולקות בעצמה הראשונית (אני O) לפני ההלבנה. נקודות נתונים אדומות מוצגות ב(), הקו הירוק מציין 0.9 התאוששות של עוצמות מקוריות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Views.  Vienna University of Technology. Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution. 

Video: Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...