אנו מודים לד&quot;ר א Ashery על המתנה של NPY-mRFP cDNA. אנו מודים בני הזוג. MJ Kofron, ל &#39;מיטלמן, מ&#39; שרבני, וי &#39;זילברשטיין לסיוע לא יסולא בפז עם מיקרוסקופ ותמונת ניתוחים. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר יוסף אורלי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע, שנוסד על ידי האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים (1139-1112 לRS-E.).

1. הכנת Cell RBL תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 500 מיליליטר של המדיום של הנשר שונה של גלוקוז הנמוך Dulbecco (DMEM) עם 56 מיליליטר של סרום שור עוברי (זה עושה 10% FBS), ולאחר מכן להוסיף 5.5 מיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין (זה עושה דברה ~ 1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התקשורת באמצעות מסנני אבק בקבוק למעלה 500-1,000 מיליליטר עם גודל הנקבובית 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. תרבות של תאי RBL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי RBL באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס בשתי צלחות או צלוחיות. תאי RBL שגדלים בצלחות 10 סנטימטר צריכים להיות בתוספת 10 מיליליטר בינוני וליצור monolayer ומחוברות של ~ 10 7 תאים / צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שכבת התאים מתקרבת מפגש, replate התרבות בצפיפות נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק בעזרת פיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed (37מעלות צלזיוס) 0.25% טריפסין / EDTA המכסה את כל monolayer (הנפח תלוי בגודל של צלחת התרבות / בקבוק; 2 מיליליטר במשך 10 צלחת סנטימטרים). זה לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשטוף את monolayer התא עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), להסיר את PBS ולהוסיף (37 ° C) טריפסין prewarmed / EDTA. צעד זה מנתק את התאים מהירים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ האופטי כדי לבדוק אם הם מנותקים. אם התאים לא לנתק אחרי 10 דקות, לטפוח בעדינות על הצלחת / הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של המדיום צריך להיות לפחות פי 2 יותר גדולים מהנפח של פתרון טריפסין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 גרם ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בינוניים. לדלל את התאים על ידי 01:10 וזרע בצלחת התרבות חדשה. דגירה התאים במשך 48-72 שעות, עד שהם reacמפגש כ -90% h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך (סעיף 2.2.1-2.2.8) לתקופה של עד 3 חודשים (30 קטעים). </li></ol></li></ol> 3. הכנת Transfection מדיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 100 מ&quot;מ של K-צינורות pH 7, 1 פתרון מ&quot;מ של אצטט Ca 2 + ו -100 מ&quot;מ פתרון של אצטט Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון של pH K-צינורות 7 מ&quot;מ 100 ל -20 מ&quot;מ באמצעות תקשורת DMEM, להוסיף את פתרון 1 מ&quot;מ של אצטט Ca 2 + לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו -100 מ&quot;מ פתרון של אצטט Mg 2 + לריכוז סופי של 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל גלוטמט אשלגן ולהוסיף לפתרון לריכוז סופי של 128 מ&quot;מ, ומערבב היטב ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. שמור את הפתרונות שנותרו (כלומר., K-צינורות, Ca 2 + אצטט, Mg 2 + אצטט) ב -20 ° C. </li></ol> 4. Transfection של תאי RBL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק באמצעותפיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed טריפסין (37 מעלות צלזיוס) / EDTA צריך שמכסה את כל השכבה. מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות). בדקו אם התאים יש מנותקים באמצעות מיקרוסקופ האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של התקשורת צריך להיות לפחות 2-גדולים יותר מאשר הנפח של פתרון טריפסין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1.5 × 10 7 תאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 XG ב 25 ° C. מחק את supernatants ולהוסיף 280 μl של מדיום transfection. העבר את תערובת התגובה ל -4 קובט מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מיקרוגרם של פלסמיד NPY-mRFP וגם 30 מיקרוגרם של פלסמיד הריק שליטה או פלסמיד נבדק. הנפח הסופי של תערובת התגובה צריך להיות 300 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מניח על קרח במשך 10 דקות. נגב את קובט ממים וp שיירroceed לelectroporation ב 300 V ל9 msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות של exocytosis, replate התאים באופן מיידי ב -24 מנות בתרבית רקמה המכילות גם 300 בינוני μl. הוסף 8 μl של תערובת התגובה (4 × 10 5 תאים) זה טוב. להוסיף תאי transfected 4 שאינם × 10 5 לבארות נוספות לשליטה. הכן מספיק בארות ליש לפחות לשכפל בארות עבור כל טיפול לכל transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה זמן לשגות, replate התאים באופן מיידי במערכת coverglass הקאמרית ורוסיליקט 8-היטב המכילה 80 בינוני μl. להוסיף 1.5 μl של תערובת התגובה (7.5 × 10 4 תאים) לכל תא. (נסה להימנע משימוש בתאי בקצה coverglass, התאים במרכז coverglass קלים יותר לתמונה). הערה: חשוב לציין, שלא כל תאי תגובה להדק ולעתים מיקרוסקופיה הזמן לשגות היא בטלה כתוצאה מאובדן המיקוד וסחיפה של borosi קאמרי 8 היטבמערכת coverglass licate. לכן, להכין לפחות 8 תאים עבור כל טיפול לכל transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרגישות התאים להפעלה בתיווך FcεRI, להוסיף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של DNP העכבר חד שבטי ספציפיים IgE לתקשורת (דגירה התאים עם IgE לפחות 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18-24 שעות להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהתאים להביע פלסמידים. אורכי גל העירור ופליטה של ​​הקרינה mRFP הם: 584 λEx, λEm 607 ננומטר. NPY-mRFP אמורה להופיע במבני לפוחי שהמתאימים לSGS. אם הגן השני של עניין הוא התמזגה לתג פלורסנט להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את שיתוף הביטוי של שני פלסמידים באותו התאים. לדוגמא, אם הגן נבדק התמזג GFP, אורכי גל העירור ופליטה של ​​הקרינה GFP הם: 488 λEx, λEm 507 ננומטר. חלבון GFP מתויג אמור להופיע באותו תאים המבטאים NPY-mRFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות exocytosis להמשיך to שלב 5 ולמיקרוסקופיה הזמן לשגות, המשך לשלב 6. </li></ol> 5. מדידת NPY-mRFP Exocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיץ Tyrode: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 54 מ&quot;מ KCl, 20 מ&quot;מ MgCl 2, 2.74 M NaCl ו -8 מ&quot;מ לאא 2 PO 4 בDDW. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה נועד להכנת 20x חיץ Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 20 מ&quot;מ Hepes pH 7, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, גלוקוז 5.6 מ&quot;מ ו1 עד 20 דילול של Tyrode 20x בDDW ומערבבים היטב. צעד זה נועד להכנת מאגר 1x Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot מאגר 1x Tyrode ולאחסן ב -20 ° C. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מהצלחת גם 24 ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode. הכן תאי unstimulated ידי הוספת חיץ Tyrode 200 μl לשלוט בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 μl / טוב של 20X מרוכז הפעלה מגיב [(למשל 1,000 ng / DNP-BSA מיליליטר או DNP-HSA (Ag), 200 ionophore 2 + מיקרומטר Ca (למשל A23187), ושילוב של 20 מיקרומטר Ca 2 + ionophore ו1,000 ננומטר tetradecanoylphorbol-13-אצטט 12-O- (TPA)]. אם ריאגנטים מאוחסנים בDMSO, לדלל את ריאגנטים ל20x ריכוז במאגר Tyrode המכיל 1% DMSO. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants של כל טוב בזהירות לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור. (Supernatants מכיל פפטיד chimeric NPY-mRFP ששוחרר מהתאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl חיץ Tyrode המכיל 0.5% Triton X-100 זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (שלב זה חשוב להכנת lysates תא המכיל את שנותר מNPY-mRFP שלא שוחרר מהתאים). לאסוף lysates התא ולהעביר לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקרינה של supernatants התא וlysates תא באמצעות fluorescקורא צלחת ence, באמצעות 590-, 20 ננומטר רוחב פס עירור מסנן ו635-, מסנן פליטת רוחב פס 35 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז NPY-mRFP שוחרר: הערה: מדד הקרינה קורא יחידות הקרינה שרירותית (עפו). ערכים עפו תלויים במכונה ואת הרגישות שלו ואת יעילות transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את autofluorescence של תאי RBL nontransfected ריקים. מחלקים את עפו של כל supernatant לקרינה הכוללת (עפו של supernatants + עפו של lysate המקביל) ולהכפיל ב -100. </li></ol></li></ol> 6. זמן לשגות מיקרוסקופית של Exocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 7.5 × 10 4 תאים / תא transfected במערכת coverglass קאמרי ורוסיליקט 8 היטב. לאחר 18-24 שעות, להסיר את מדיום התרבות מהתאים ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 72 μl של חיץ Tyrode לכל תא. לדלל את ריאגנטים הפעלה במאגר Tyrode ל10x ריכוז. </li> &lt;li&gt; השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal מצויד בחדר מחומם (37 מעלות צלזיוס) ו- CO 2 בקר (4.8%) ואובייקטיבי 40X או 63X. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. ודא שהחדר המחומם הוא בטמפרטורה הנכונה לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר בחדר המחומם ולוודא כי התא מותקן בצורה נכונה ויציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את אור פלואורסצנטי לפי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנה וcytotoxicity. חשוב שהתחום זה יכיל כ 2-3 תאי transfected. תאי transfected צריכים להתפשט גם, אבל לא נוגעים זה בזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את כוח הלייזר (תלוי במיקרוסקופ) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעילות, ולהגדיר את הרווח לקזז לשנות את יחס האות לרעש. סריקה מהירה באו<html> der כדי למזער את משך חשיפת לייזר (ממוצע 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את גודל חריר למקסימום, זה מאפשר להקטין את כוח הלייזר ולשמור תמונות ממוקדות לתקופה ארוכה של זמן. אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z לשחזר את התמונה בשלוש ממדי סריקה, להתאים את גודל חריר ליחידה אוורירית 1 (AU) שנותן את האות הטוב ביותר יחס רעש ולרכוש רצופה של פרוסות אופטיות confocal דו-ממדיות ב -axes z עם פרוסות אופטיות ≤0.7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את זמן ההפסקה בין כל רכישה 15-30 שניות ומשך הרכישה כוללת של 15 דקות ולהתחיל לרכוש תמונות. לאחר 5 דקות של רכישה להשהות את סדרת הזמן. הוסף 8 μl של ההדק 10x ולהמשיך הרכישה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונות, לבצע deconvolution באמצעות תוכנת deconvolution ולשחזר את הערימות לשלוש תמונות ממדיות ולסרט באמצעות תוכנת Imaris. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא נתונים מתמונות סדרת זמן deconvoluted שהתקבלו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לתוכנת Imaris. תוכנה זו קוראת יותר מ -40 קבצי מיקרוסקופיה. אם התוכנה לא יכולה לקרוא את הקבצים; להמיר את הקבצים לקבצים ויבוא tif. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף נקודות זמן לסיום עריכה לחץ על Set נתונים פתוח -&gt; הוסף נקודות זמן ולייבא את הנתונים החדשים שנקבעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור פני השטח של ערוץ mRFP שימוש באפשרות אשף פני השטח. בחר אלגוריתם ברירת המחדל. בחר הערוץ של NPY-mRFP. סמן את אפשרות ההחלקה כדי להפחית את הרעש. כדי למנוע אובדן של פרטים קטנים להפחית את רמת פירוט אזור 0.05 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף העצמה. משטח אפור חדש יוצג. עבור אל &quot;הגדרות&quot; ולעבור את הסגנון מ&quot; נקודת מרכז &quot;עד&quot; Surface &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לכרטיסיית נתון במאפיינים של אובייקט שנבחר, בחר בכרטיסייה מפורטת וsuc הערך הספציפיh כעוצמת הקרינה, נפח וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקור את הנתונים ולוודא שהערכים תואמים לתמונות. לדוגמא, שתיים או יותר גרגרים סמוכים עשויים להימדד כגרגיר אחד גדול. לכימות גודל הגרגר הממוצע לחלק את גודל הגרגרים הממוזגים למספר האמיתי של גרגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את ערכות נתונים הרצויות לקבצי Excel ולנתח את הנתונים. </li></ol> f

<ol>
	<li>Abonia, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mast+cells+in+eosinophilic+esophagitis.">Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+allergy+and+infection:+versatile+effector+and+regulatory+cells+in+innate+and+adaptive+immunity.">Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity.</a> Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).</li><li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+controversial+role+of+mast+cells+in+tumor+growth.">The controversial role of mast cells in tumor growth.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).</li><li>Ribatti, D., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells,+angiogenesis+and+cancer.">Mast cells, angiogenesis and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).</li><li>Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+immunoregulation/immunomodulation.">Mast cells and immunoregulation/immunomodulation.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).</li><li>Vries, V. C., Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators+in+tolerance.">Mast cell mediators in tolerance.</a> Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).</li><li>Kirshenbaum, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+human+mast+cells+arise+from+a+progenitor+cell+population+that+is+CD34(+),+c-kit(+),+and+expresses+aminopeptidase+N+(CD13).">Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13).</a> Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).</li><li>Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells.">Mast cells.</a> Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).</li><li>Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+biology:+introduction+and+overview.">Mast cell biology: introduction and overview.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).</li><li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+mast+cell+activation.">Molecular regulation of mast cell activation.</a> J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).</li><li>Rivera, J., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+mast+cell+activation.">Molecular regulation of mast cell activation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).</li><li>Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agents+that+release+histamine+from+mast+cells.">Agents that release histamine from mast cells.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).</li><li>Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-dependent+down-regulation+of+antigen-specific+immune+responses+by+mosquito+bites.">Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites.</a> J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).</li><li>Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+evades+the+extracellular+antimicrobial+activity+of+mast+cells+by+promoting+its+own+uptake.">Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake.</a> J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).</li><li>Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+Toll-like+receptor+4+and+mast+cell-dependent+innate+immunity+responses.">Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses.</a> IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).</li><li>Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin+E-Toll-like+receptor+network.">The immunoglobulin E-Toll-like receptor network.</a> Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).</li><li>Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+adenosine+receptors+function:+a+focus+on+the+a3+adenosine+receptor+and+inflammation.">Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation.</a> Front Immunol. 3, 134 (2012).</li><li>Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+mast+cell+mediators+and+the+pathogenesis+of+inflammation.">Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation.</a> Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).</li><li>Caughey, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+proteases+as+protective+and+inflammatory+mediators.">Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).</li><li>Lundequist, A., Pejler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+preformed+mast+cell+mediators.">Biological implications of preformed mast cell mediators.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).</li><li>Metz, M., Maurer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells--key+effector+cells+in+immune+responses.">Mast cells--key effector cells in immune responses.</a> Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).</li><li>Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+a+source+of+multifunctional+cytokines.">Mast cells as a source of multifunctional cytokines.</a> Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).</li><li>Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+regulation+of+mast+cell+exocytosis+by+networks+of+Rab+GTPases.">Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases.</a> J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).</li><li>Stenmark, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rab5+GTPase+activity+stimulates+membrane+fusion+in+endocytosis.">Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis.</a> EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).</li><li>Azouz, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab5+is+a+novel+regulator+of+mast+cell+secretory+granules:+impact+on+size,+cargo,+and+exocytosis.">Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis.</a> J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית המשלבת כימות של exocytosis המנחים וארבעה (x, y, z, t) quantifications ממד על ידי הדמיה תלת-ממדית-פקע זמן של SGS בתאים חיים באמצעות גן מדווח לexocytosis. טכניקה זו מאפשרת הקרנה של משפחות של חלבונים להשפעתם על תפקוד MC כגון SGS הניטור מתחילות כבר ביציאתם מGolgi דרך התבגרו...

תאי פיטום (MC) הם תאים חיסוניים שידועות כי הם הטובים ביותר על מעורבותם בתגובות אלרגיות ודלקתיות כגון דלקת פרקים, אסטמה, דלקת ושט אאוזינופילית, דלקת עור כרונית והלם אנפילקטי 1,2 כמו גם פתולוגיות אחרות, כוללים מחלת לב כלילית 3.5 ו סרטן 3,4. בנוסף, מנחים ממלאים תפקידים חשובים בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות, גם בהגנת מארחת נגד חיידקים וטפילים ועל ידי דיכוי של מערכת חיסונית, למשל גרימת סובלנות שתל 5,6. מנחי מקורן מח העצם, מתפתח מתאי CD34 pluripotent + / CD117 + 7. אבות MC מח עצם מחויב משתחררים לזרם הדם ונודדים לרקמות היקפי לוקליזציה בעיקר בתוך רקמות חיבור ומשטחי אפיתל 8. הבשלה והתמיינות מסוף מושגות סופו של דבר תחת השפעת of ציטוקינים בתוך 8,9 הסביבה שמסביב. יכולים להיות מופעלים על ידי מנחים אלרגן (אנטיגן, Ag), מפגש שהסתיים בדור של E אימונוגלובולינים (IgE) הקלד נוגדנים. כריכה של IgE כזה לקולטנים FcεRI של MC, ואחריו cross-linking של תא קשור IgE על חשיפה מחדש לאותו Ag, תוצאות בצבירת FcεRI וייזום מפל איתות שמגיע לשיאו בdegranulation תא [שנסקרו ב10,11] . מנחים גם הופעלו, באופן בלתי תלוי IgE, על ידי נוירו 5,12, רעלי 13, חיידקים ואנטיגנים נגיפיים 14,15, מספר פפטידים בעלי מטען חשמלי חיוביים המכונים ביחד secretagogues הבסיסי, תאים וציטוקינים 5,13,12,16 חיסוניים , 17. מנחים גם מופעלים על ידי רב של המתווכים שלהם שוחררו, אשר עוד להגביר את התגובה הדלקתית. מנחים הם ארוזים עם גרגירי הפרשה (SGS) המכילים חיסונימתווכי רגולציה, כוללים אמינים vasoactive, כגון היסטמין וסרוטונין (במכרסמים), proteoglycans, פרוטאזות, כגון chymase וtryptase, גורם גדילה של אנדותל כלי דם וכמה ציטוקינים וכמוקינים 8,9. מתווכים אלה הם &quot;מוכנים ללכת&quot; ופעם אחת MCs מופעל על ידי גירוי מתאים, מתווכים אלה משתחררים מהתאים על ידי exocytosis המוסדר (degranulation) בעניין של שניות עד דקות 18,19. אירוע ראשוני זה ואחריו סינתזת דה נובו ושחרורו של מגוון רחב של חומרים ביולוגיים חזקים, כוללים מטבוליטים הארכידונית חומצה, ציטוקינים מרובים וכמוקינים 20,21,22. שחרור של מוצרים מסונתזים חדש מתרחש באופן עצמאי של שחרור SG. באופן קולקטיבי, מתווכים אלה ליזום מוקדמים ושלב מאוחר דלקתי ואלרגי תגובות. לכן, הבנת המנגנונים המהווים הפעלת MC וdegranulation שניהם של שד תיאורטי וקליניortance. הקושי לתמרן גנטי MCs הראשוני והתרבותי שהקשה על הניסיונות להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס degranulation MC, שנשאר גרוע נפתר. מנחים כדי להתגבר על בעיה זו פיתחנו מבוסס assay כתב ידי, לוקמיה basophilic עכברוש קו תא פיטום ברירית transfecting-שיתוף (RBL) -2H3 (המכונים במסמך זה כלRBL) או מח עצם נגזרים (BMMCs) 30 עם גן של עניין ו Neuropeptide Y (NPY) התמזג RFP monomeric (mRFP), ככתב SG. NPY הוצג בעבר לשחזר את התנהגותם של סמני SG אנדוגני במערכות אחרות. יתר על כן, מכיוון שקרינת mRFP הוא pH רגיש, ביטוי של NPY-mRFP מאפשר הדמיה של SGS חומציים כמו גם הערכה כמותית של exocytosis באמצעות 96-גם צלחות וקורא צלחת הקרינה. הראינו כי NPY-mRFP מועבר לSGS חומצי של תאי RBL וBMMCs והוא שוחרר מהתאיםבאופן מוסדר לצד מטען SG אנדוגני (כלומר, β-hexosaminidase וסרוטונין) 30, 32. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה המבוססת על הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת גני הקרנה של עניין לפנוטיפי שלהם והשפעה תפקודית על מאפייני SG וdegranulation בתאי RBL 32. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת של MC SGS וכימות של האזור שלהם או גודל נפח, מספרם, קינטיקה של הרכבה, תנועתם לאורך שלד תא התא וההיתוך האולטימטיבי שלהם עם קרום הפלזמה בתנאים שונים. לדוגמא, רגישות התאים עם DNP-הספציפי IgE ומפעיל את התאים עם Ag רב-ערכי (אלבומין בסרום מצומדות DNP) תחת הפרעות שונות (כלומר, מציאה של גנים של עניין, על ביטוי של גני WT או מוטציה, או מניפולציות תרופתיות) ו השוואה לשלוט תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

תאי פיטום (MC) הם תאי הפרשה של המערכת החיסונית שלהשיג פונקציות הפיזיולוגיות ופתולוגיים שלהם על ידי שחרור מתווכים אלרגיים, דלקת וimmunoregulatory מראש יצר ומסונתזים חדש. המתווכים &#39;MCs משפיעים על רקמות ואיברים מרובים שהגיעו לשיא בתגובות אלרגיות וחיסוניות. הסינתזה, האחסון והשחרור של מתווכי MC קבוע בתקנות. המתווכים מראש יצר עמוסים בגרגירי cytoplasmic הפרשה (SG) שלהתמזג עם קרום הפלזמה ולשחרר את התוכן שלהם על ידי exocytosis המוסדר. אנו מציגים פרוטוקול, המבוסס על שיתוף הביטוי של גן של עניין עם גן כתב כי הוא ממוקד לSGS והוא שוחרר באופן מוסדר לצד מתווכי SG אנדוגני. הפרוטוקול מאפשר רזולוציה גבוהה ארבעה confocal ממדי ניתוחים של SGS MC וניטור ציר זמנם מbiogenesis לexocytosis מופעל. לפיכך, שימוש בפרוטוקול זה לסינון גנים של היתרest להשפעה פנוטיפי והפונקציונלית שלהם מאפשר פענוח המנגנונים המולקולריים השולטים בbiogenesis וexocytosis של SGS MC וזיהוי הרגולטורים מעורבים. וכך, תובנות נוספות המנגנונים התאיים שמהווים פונקצית MCs בבריאות ובמחלה צריכה להינתן.

בגלל יעילות transfection הנמוכה של MCS, מניפולציות גנטיות צפויים לעזוב השפעה על קריאות של הפרשה ממוצעת שנמדדו על ידי מתווכי SGS אנדוגני. אף על פי כן, על ידי הקמת שיתוף ביטוי מלא של גן הכתב NPY-mRFP ופלסמיד שיתוף transfected באותו התאים, ניטור של תוצאות NPY-mRFP בניטור באופן בלעדי אוכלוסיית ?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis at JoVE.com

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Views.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה. 

Video: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

חזותי exocytosis ללא ממס של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em&gt; מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.