LMW וRHK נתמכים על ידי בית הספר למוסמכים של UMaine של מדע והנדסה (GSBSE) ביו רפואית; RHK נתמכה גם על ידי החקלאית מיין ותחנת ניסוי יער. מימון נוסף מסופק על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה כללי (NIH P20-GM103423), מיין והחקלאי תחנת ניסוי יער (גרנט מספר ME08004-10, פצ&quot;ר), אוניברסיטת ADVANCE מיין Rising Tide מרכז (NSF גרנט # 1,008,498) , ומענק מחקר Starter בפרמקולוגיה / טוקסיקולוגיה מן היסוד PhRMA (פצ&quot;ר). אנו מודים בני הזוג. דוד Holowka וברברה ביירד לאנטיגן ותאים. אנו אסירי תודה לחינה Hashmi, אלחנדרו ולז, ואנדרו Abovian לעזרה עם ציוד והזמנות. זה מיין חקלאי &amp; יער מספר פרסום תחנת ניסוי 3311.

יש לנו מה למסור.

בשנת 2004, Naal et al. 1 פיתחה biosensor תא תורן לבדיקת תפוקה גבוהה של degranulation. זה assay חזק שיש לנו להתאים ללימודי TCS ומפורט בסרטון זה. לפני Naal et al. Assay 1, degranulation תא תורן היה להעריך באופן שגרתי באמצעות 59-61 β-hexosaminidase, אבל השיטות המוקדמות אלה מנוצלים fluorometers שבדגימה אחת היי...

תאי פיטום הם מאוד מגורענים מפעיל תאים חיסוניים המשמשים כמתווכים עיקריים באסטמה, אלרגיות, טפילים והגנת 13-16 היווצרות הסרטן. הם מתגוררים כמעט בכל רקמת vascularized 15, שבו הם בבטחה לאחסן מתווכים אלרגיים ודלקתיים בגרגרי cytoplasmic עד הופעלו לdegranulate. Degranulation הוא exocytosis של גרגרי קרום נכנסים, מה שגורם לשחרור של מתווכים פעילים פרמקולוגית כגון היסטמין, tryptase, ולאוקוטריאנים 15. תוצאות תהליך זה בתחילתו של הסוג אני תגובות רגישות יתר שהם קריטיים בהגנה מפני טפילי הרכבה, כמו גם ייזום תגובות אלרגיות, אסתמה, ומסרטנות 15. תאי מאסט ובזופילים לבטא קולטנים FcεRI, הקולטנים גבוהה הזיקה לאימונוגלובולין E (IgE) 17. חשיפה לאלרגן או אנטיגן גורמת לצבירה של קולטנים FcεRI IgE בכריכות מרובים 17, וזה של זהO-נקרא &quot;crosslinking&quot; של קולטני Fc IgE בכריכות שיוזמת את תהליך degranulation: מפל של אירועי טירוזין זרחון, ההפעלה של פוספוליפאז C, זרימת הסידן מהחנויות פנימיות, וזרם של סידן לתוך התא 18. זרימת סידן זה היא הכרחי עבור degranulation, ועוד יותר, מאותתת היתוך גרגיר עם הקרום לפני גרימת exocytosis גרגר 15. בניסוי, ionophore סידן יכול לשמש לסיד מעבורת ישירות על פני קרום תא 19, שלמעשה עוקף את כל התמרה אות שלבים לפני שלב זרימת סידן 20, המאפשר את זיהוי של יעד על ידי מסלול toxicant כמו להיות במעלה הזרם או במורד הזרם של סידן איתות 20. Degranulation ניתן למדוד במהירות וביעילות על ידי ניטור שחרורו של β-hexosaminidase לsupernatant התא, אשר שוחרר לינארית מהגרגרים לצד היסטמין 6, אבל אניזה הרבה יותר קל לזהות באמצעות תגובת אנזים-מצע וקורא microplate פשוט assay מוצר הניאון. assay microplate זה, כמפורט בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה שפותחה במקור על ידי חזקה Naal et al. 1, אשר מכמתת את המחשוף של מצע fluorogenic 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-β-D-β-glucosaminide ידי hexosaminidase. יש לנו שונה assay להשפעות של תרופות ובדיקת toxicants, עם triclosan מודגש כאן. שיטה זו אמינה מכמתת degranulation, הוא אלטרנטיבה זולה, למשל, שיטות זיהוי 21 המבוססים על תזרים cytometric, ויש לו הפוטנציאל להשאיל את עצמה יפה להקרנת תפוקה גבוהה של מגוון רחב של תרופות לטיפול באלרגיה, כמו גם immunotoxic או כימיקלים אלרגניים. הנקודה אחרונה זו חשובה במיוחד לאור בדיקת רעילות &quot;2007 דו&quot;ח המועצה הלאומי למחקר במאה ה -21: חזון וstrategy <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">&quot;(http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970),</a> הפועל למען הפיתוח של בדיקות רעלים תפוקה גבוהה המנצלות תרבית תאים כדי להקטין את השימוש יקר של חיות מעבדה מסורתיות כגון עכברים. פרוטוקול degranulation שפותח על ידי Naal et al. 1 והותאם על ידינו 2, מנצל את שורת תאי RBL-2H3, שהוא מודל מקובל היטב הומולוגית לתאי פיטום ריריים אדם או בזופילים 3-5. (שיטות לתאי RBL-2H3 culturing מפורטות באצ&#39;ינסון ואח&#39;. 22). assay זה סביר יכול להיות מותאם לכל סוג תא תורן מצורף. Triclosan (TCS) הוא מיקרוביאלית ספקטרום הרחב שהיה בשימוש כבר יותר מ -30 שנים בבתי חולים, מוצרי טיפוח, ומוצרים צריכה 23,24. אופן פעולה אופייני למיקרוביאלית של TCS הוא העיכוב של סינתזת חומצות שומן, ככל הנראה על ידי עיכוב enoyl-acylרדוקטאז מנשא חלבון 25,26. הוא נמצא בעולם במגוון רחב של מוצרים צריכה, כגון ג&#39;ל רחצה, קרם ידי, משחת שיניים, מי פה, וסבונים ביד בריכוזים של עד 0.3% או 10 מ&quot;מ 24. שימוש נרחב של TCS הביא רמות לגילוי בבני אדם וב27-29 נהרות ונחלים 30. מחקר שנעשה על ידי Allmyr et al. הוכיח כי 27 TCS ומטבוליטים שלה נמצאים גם הפלזמה וחלב מאמהות מיניקות. חשוב לציין, TCS נספג בקלות אל תוך העור 31-37. Queckenberg et al. ~ 37 מצאו קליטת 10% מ~ 70 מ&quot;מ TCS קרם לעור אנושי בתוך 12 שעות, וכתוצאה מכך הריכוז משמעותי בעור, שבו תאי פיטום מתגוררים. TCS הוכח קליני כדי לנהל את מחלת עור אלרגית אנושית 7-11, אבל המנגנון שבאמצעותו TCS מקל על מחלות עור אלרגיות כבר ידוע 38. שימוש detaile assay microplate הניאוןד בסרטון הזה, אנחנו לאחרונה הוכיחו כי TCS, בריכוזים נמוכים כמו 2 מיקרומטר, פוגם באופן משמעותי את תפקוד תא תורן וdegranulation, מתן הסבר פוטנציאל לנתונים קליניים אלה 2. בנוסף למתן הסבר לנתונים קליניים אלה, הממצאים שלנו בפאלמר et al. 2 מציעים לי TCS מטרות מולקולות איתות במורד הזרם של זרימת סידן. , TCS עלול להיות בשל חשיבותו של הסידן באיתות חיסונית רבים ותהליכים ביולוגיים אחרים השפעות שליליות על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים הדרושים. למעשה, Udoji et al. הראו כי 39 TCS מדכא פעילות תאי רוצח טבעית אנושית ממס, תפקוד מערכת החיסון מולדים חשוב נוסף. מעבר לפוטנציאל שלה ככלי עזר טיפולי במחלת עור אלרגית (או, לחלופין, כimmunotoxicant), TCS יכול להיות גם האנדוקרינית משבש 40-49. לפיכך, נוהל ברור על איך להכין כימיקל זה בפתרון אנישל עניין לtoxicologists. בגלל TCS הוא מולקולה הידרופובי קטנה, כלי רכב אורגניים משמשים לעתים קרובות כדי להפוך אותו ליותר מסיס במים. ברוב המחקרים רעילות שבו TCS כבר נבדקו, הכנה כרוכה בפירוק במים בעזרת ממס אורגני כגון אתנול, אצטון, או שמן 2,50,51. עם זאת, לעתים קרובות פעמים ממסים אלה הן פעילים מבחינה ביולוגית את עצמם, ובכך סבכו את הפרשנות של הבדיקה כימי נתונים 51. למעשה, על פי Rufli et al. 52 ואחרים 53, מומלץ שפתרונות בדיקה לניסויים רעילות מים מוכנים באמצעות שיטות פיסיות על פני שיטות כימיות, בשל הפוטנציאל של ממסים כימיים כדי ליצור חפצים רעילות. יש לנו הראינו בעבר כי TCS מומס באתנול / מים (כרך / כרך) 0.24% וsonicated למשך 30 דקות dampens degranulation תא תורן RBL 2. אתנול בריכוזים גבוהים יותר מאשר 0.24% הוכח לצנן degra תא תורןnulation 54,55-דוגמאות להשפעות שעלולים להיות המבלבלות של ממסים אורגניים על מחקרים רעילות. לא רק שזה חשוב להביא בחשבון את ההשפעה של ממסים על האורגניזם או תאים המשמשים למחקר, אבל גם זה חשוב לעקוב אחר ההשפעה של ממס בכימי המבחן עצמו. לדוגמה, Skaare et al. מצאו כי 51 המסת TCS בפוליאתילן גליקול (נפוץ במשחות שיניים ושטיפת פה) נחלשו השפעות אנטי בקטריאלי ואנטי פלאק בנשים נשיות בריאים בזמן פירוק בשמנים נגרם אובדן תפקוד מלא. לכן, היכולת של ממסים שונים כדי לווסת toxicant וסמים, כולל TCS, אפקטים יש לשקול בעיצוב assay. שימוש בשמנים או תוספי טעם עלול להפריע את ההשפעות של TCS במוצרים שונים 50,51. במאמץ למנוע את הצורך בשימוש בממסים אורגניים, שיפרנו על השיטה שלנו להמסת TCS 2 על ידי ביטול השימוש בסול אורגנילפרוק. בפרוטוקול הנוכחי, אנו לפזר גרגרי TCS ישירות לתוך המאגר מימית עם חום (≤ 50 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לוודא את הריכוז של מניית TCS זה על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis. שיפורים אלו אפשריים כי TCS הוא מסיס במים עד 40 מיקרומטר <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">(http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf)</a> והוכח להתנגד השפלה כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">(http:/ / Oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf)</a> 56,57. יש לנו גם יתרון נוסף של ספקטרופוטומטריה UV-Vis, כמו TCS ידוע גם לקלוט חום ב280 ננומטר 58 עם מקדם הכחדה טוחנת של 4,200 ליטר / מול / 12 ס&quot;מ. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, אך יעילה לפזר גרגרי TCS למאגר ללא סיוע של ממס אורגני, ובכלל זה בעלות נמוכה ואימות מהירהריכוז, ומתאר assay microplate ניאון רב עוצמה למעקב אחר השפעות כימיות על degranulation תא תורן.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

תאי פיטום ממלאים תפקידים חשובים במחל אלרגיות והגנה חיסונית נגד טפילים. לאחר הפעלה (למשל, על ידי אלרגן), הם degranulate, תהליך שתוצאת exocytosis של מתווכים אלרגיים. אפנון של degranulation תא תורן על ידי תרופות וtoxicants עשוי להיות השפעה חיובית או שלילית על בריאות אדם. תפקוד תא תורן כבר גזור בפירוט עם השימוש בתאי פיטום לוקמיה basophilic עכברוש (RBL-2H3), מודל מקובל של תא פיטום אדם רירי 3-5. מרכיב תורן תא גרגר והמתווך אלרגי β-hexosaminidase, אשר שוחרר לינארית בד בבד עם היסטמין מתאי פיטום 6, ניתן למדוד בקלות ובאופן אמין באמצעות תגובה עם מצע fluorogenic, מניב למדידה עוצמת הקרינה בassay microplate שניתן ל מחקרי תפוקה גבוהה 1. פורסם במקור על ידי Naal et al. 1, יש לנו להתאים assay degranulation זה להקרנה Oתרופות F ו toxicants ומדגים את השימוש בו כאן. Triclosan הוא סוכן ספקטרום רחב נגד חיידקים שנמצא במוצרים צריכה רבים וכבר מצא להיות סיוע טיפולי במחלת עור אלרגית אנושית 7-11, למרות שהמנגנון להשפעה זו אינה ידוע. כאן אנו מדגימים assay להשפעת על triclosan degranulation תא תורן. לאחרונה הראו כי triclosan מאוד משפיע על תפקוד תא תורן 2. במאמץ להימנע משימוש בממס אורגני, triclosan מתמוסס ישירות לתוך המאגר מימית עם חום וערבוב, וריכוז כתוצאה הוא אישר שימוש בספקטרופוטומטריה UV-Vis (באמצעות ε 280 = 4200 L / M / ס&quot;מ) 12. פרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של חומרים כימיים כדי לקבוע את ההשפעות שלהם על degranulation תא תורן, ובאופן רחב יותר, פוטנציאל אלרגי שלהם.

כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, את ספקטרום ספיגת UV-Vis לTCS מייצר עקומה חזקה, חלק בין ~ 260 ו 300 ננומטר, עם שיא ב 280 ננומטר, כפי שמוצגת באיור 1. ספקטרופוטומטריה UV-Vis היא, אפוא, כלי חשוב שיכול להיות מנוצל לחישוב ריכוז, שכן מקדם הקליטה הטוחנת שפורסם ב 280 ננומטר הוא 4,200 ליטר / מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות 1 להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan 2.

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Views.  University of Maine, Orono.  degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות 1 להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan 2. 

Video: A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

ההשפעות של חשיפה של פורמלדהיד מודל עכברוש של אטופיק דרמטיטיס המושרה על ידי קפסאיצין Neonatal טיפול

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...