ביצי עוף מופרות של GFP סופקו על ידי פרופ' הלן סאנג, מכון רוזלין ואוניברסיטת אדינבורו, בריטניה. מתקן העוף הטרנסגני רוזלין ממומן על ידי קרן Wellcome ועל ידי המועצה לחקר הביוטכנולוגיה והמדעים הביולוגיים (BBSRC). העבודה מומנה בחלקה, ו- NT נתמך על ידי בית החולים גרייט אורמונד סטריט צדקה לילדים, לונדון, בריטניה. המחברים מודים לבן יוונס, מכון UCL לבריאות הילד, על העזרה בהכנת עוברים להשתלה.

1. הכנת מיקרו אזמל עבור אבלציות צינור עצבי
<ol><li>לעצב מיקרו אזמל ממחט תפירה פלדה זמין מסחרית.<ol>
<li>ראשית לשטח את המחט משני הצדדים באמצעות גלגל שחיקה רכוב על מטחנת ספסל מופעל.</li>
		<li>התחל לעצב את האזמל, תחילה על אבן ארקנסו בדרגה גסה באמצעות תנועה מעגלית מבוקרת, בכיוונים חלופיים, משני צידי המחט.</li>
		<li>המשיכו באותן תנועות חידוד על אבן ארקנסו משובחת במיוחד כדי לעצב מיקרו-אזמל עדין במיוחד, עם חוד החנית המוגדר היטב(איור 1A, B). הערה: חלופות לאאזמל מיקרו יכול להיות מחטים חידוד אלקטרוליטי, מחטי טונגסטן זמין מסחרית, או משך מחטי זכוכית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. דגירה סוג בר וביצים GFP לשלב הרצוי
<ol><li>לאחסן ביצי עוף מופרות וביצי עוף GFP מהונדסות באינקובטור מקורר ב 14 - 15 מעלות צלזיוס לפני הדגירה כמו הפיתוח נעצר בטמפרטורה זו. לאחסן ביצים במשך כמה ימים, עד שבוע.</li>
	<li>כדי להתחיל בפיתוח, מניחים סוג פראי וביצים GFP על מגש אופקית דגירה בו זמנית לח (58 - 60%) אינקובטור ב 37.5 מעלות צלזיוס, כך העוברים נמצאים בשלבים תואמים עבור השתלת צינור עצבי.</li>
	<li>כדי להשיג עוברים בשלב 10 - 12 סומיט של פיתוח לביצוע השתלת צינור עצבי vagal, ביצי דגירה במשך 1.5 ימים (33 - 38 שעות) ועוברי שלב על פי שולחנות הפיתוח של המבורגר המילטון21.</li>
</ol>3. הכנת ביצים לחלון והשתלה
<ol><li>מעבירים ביצה אחת בכל פעם למחזיק ביצים בהתאמה אישית לחלון. לעשות חור קטן בקליפת הביצה על ידי הקשה חוזרת ונשנית, עם מספריים ישרים, על המשטח העליון של הקצה המחודד של הביצה.</li>
	<li>הסר 2 - 3 מ"ל של אלבומין מהביצה עם מחט 181/2 G hypodermic ו 5 מזרק מיליליטר. הסרת האלבומין מורידה את החלמון בתוך הביצה ומאפשרת חלון לאחר מכן מבלי לגרום נזק לעובר.<ol>
<li>השלך את האלבום. לאטום את החור עם רצועה קטנה של סרט שקוף לחתוך לגודל עם מספריים בסדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות מספריים מעוגלות, הקש על חור נוסף במשטח העליון של קליפת הביצה. הכנס את קצה המספריים לתוך החור, ולשמור את המספריים במקביל לספסל, לעבוד בתנועה מעגלית לחתוך חלון בקוטר ~ 2 ס"מ על גבי הקליפה.<ol>
<li>שמור את המספריים במצב נייח ולסובב את הביצה. השלך את הדיסק שהוסר של קליפת ביצה. ב E1.5, העובר מזוהה כדיסק צהוב כהה יותר על גבי החלמון.</li>
		<li>הסר את כל פסולת פגז שנפל בתוך הביצה באמצעות פינצטה. השלך את כל הביצים לא מופרות (מזוהה על ידי נקודה לבנה קטנה על גבי חלמון צהוב בהיר אחרת).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכינו את העובר המארח לקבלת רקמה מושתלת
<ol><li>כוונן את הסטריאו-מיקרוסקופ לגובה העיניים ומטב את הכיוון של מקור אור אווז כדי להאיר כראוי את העובר מבלי לגרום להשתקפויות.</li>
	<li>כדי לדמיין את העובר הנכון, להזריק כמות קטנה של דיו הודי מתחת למרכז הדיסק הצהוב כהה, באמצעות צינור הפה מיקרו פיפטה זכוכית משך(איור 1C, Oii).<ol>
<li>הכן את הדיו 50:50 עם PBS המכיל פניצילין / סטרפטומיצין ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי. הכנס את המיקרו-פיפטה דרך קרום החלמון מחוץ להיקף של blastoderm ואז בזהירות זווית הקצה שלה ישירות מתחת לעובר.</li>
		<li>לספק דיו מתחת לעובר על ידי נושבת על צינור הפה. אם צינור הפה אינו מותר, השתמש במזרק 1 מ"ל במקום. היזהר לא להציג כל בועות אוויר מתחת לעובר, אשר יכול להוביל לזיהום, ואז להסיר בזהירות את מיקרו פיפטה זכוכית. זהו צעד עדין שיכול להוביל למותו של העובר אם לא נעשה בדייקנות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מביים את העובר בהתייחסו להמבורגר והמילטון21 ומתעד את הבמה בספר מעבדה.</li>
	<li>באמצעות מיקרו אזמל בהתאמה אישית (או מחט טונגסטן בסדר) רכוב על מחזיק מחט, לעשות חתך קטן מאוד בקרום vitelline, ליד האזור שבו המיקרו ניתוח יבוצע.<ol>
<li>בזהירות להחיל 2 - 3 טיפות של PBS על קרע הממברנה (באמצעות מיקרו פיפטה זכוכית צינור הפה) כדי ליצור רווח בין העובר לבין הממברנה. חותכים חלון גדול יותר בקרום כדי לחשוף את האזור כולו שבו המיקרו-ניתוח יתקיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את אזור הצינור העצבי של עניין באמצעות אזמל מיקרו, החל חתכים רוחביים rostral ו caudal על פני הצינור העצבי הגבי כולו (ברמה של סומיט 1 עד 7 בסרטון).<ol>
<li>חותכים דו-צדדית בין הצינור העצבי לבין הסומיטים כדי להפריד את הצינור העצבי מהרקמות שמסביב, מבלי לפגוע בסומיטים.</li>
		<li>בעדינות רבה להפריד את הצינור העצבי מן notochord הבסיסית, אשר צריך להישאר שלם. שימו לב כי כריתה מוצלחת של צינור עצבי תשאיר את כל הרקמות שמסביב שלמות לחלוטין (איור 2).</li>
		<li>הסר את הצינור העצבי שנכרת על ידי שאיפתו לתוך מיקרו פיפטה זכוכית, ולאחר מכן להשליך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רשום את רמת אבלציה של צינור עצבי בספר מעבדה. העובר המארח מוכן כעת לקבל את הצינור העצבי התורם.</li>
</ol>5. הכינו את רקמת השתל התורמת
<ol><li>בחר עובר GFP עם חלונות התואמים לבמה על-ידי הצגה תחת מיקרוסקופ סטריאו-מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITC. פלואורסצנטיות GFP מקלה מאוד לדמיין את הסומיטים ולביים את העובר.</li>
	<li>לאחר שזוהה עובר תואם שלב, הסר את העובר מהביצה על-ידי ביצוע 4 חתכים, עם מספריים אביביים של Pascheff-Wolff (איור 1C, l)בצורת מלבן סביב העובר ולאחר מכן הרים אותו בעדינות עם כף עובר.</li>
	<li>מניחים את העובר בזכוכית שעון מרובעת עם בסיס פולימר sylgard. בעדינות לנער את העובר עם דומונט #5 פינצטה כדי להסיר כל חלמון מצורף. הסר את קרום הויטליין והצמד את העובר לבסיס הפולימר באמצעות סיכות מינוטין אל-חלד(איור 1C).</li>
	<li>באמצעות מספריים האביב, לעשות 4 חתכים בצורה מלבנית סביב הצינור העצבי ואת הסומיטים שמסביב, באותו אזור שהוסר מן העובר המארח.</li>
	<li>באמצעות פיפטה העברת פלסטיק, להעביר את הצינור העצבי ורקמות סומייט מעובר GFP התורם לתוך שעון המכיל 0.2% לבלב בעט / סטרפטוקוקוס PBS.</li>
	<li>אפשר עיכול אנזימטי להמשיך במשך 10 דקות ב RT כדי לעזור להפריד את הרקמות. לאחר הדגירה באנזים, השתמש סיכות מינוטין אל חלד רכוב על ידית כדי להפריד באופן ידני את הצינור העצבי מכל הרקמות הסמוכות.</li>
	<li>באמצעות מיקרו פיפטה זכוכית, להעביר את הצינור העצבי מנותק לזכוכית שעון אחרת המכילה DMEM + 10% סרום(למשל,עז, סוס או עגל עוברי) על קרח, כדי לשטוף את הלבלב עודף ולהפסיק עיכול אנזימטי. לאחר 5 דקות, הצינור העצבי המנותח מוכן להשתלה אורתוטופית למארח הגוזל(איור 2 ו-S1).</li>
</ol>6. השתלת הרקמה
<ol><li>באמצעות מיקרו-פיפטה מזכוכית, העבר בזהירות את הצינור העצבי המנותח מזכוכית השעון לעובר המארח. מקם את הצינור העצבי בכיוון האחורי-אחורי הנכון ולדחוף בעדינות את explant סמוך לאזור מגורש של מארח הגוזל באמצעות המיקרו אזמל. השאירו שבר קטן של אקטודרם מחובר, או על ידי חיתוך חתך קטן פנימה, משטח הגב כדי לזהות את הכיוון של הצינור העצבי.<ol>
<li>במידת הצורך, השתמש במיקרו-אזמל כדי לחתוך את ההסבר לגודל המדויק של האזור שנכרת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להנחות בעדינות את הצינור העצבי לתוך האזור ablated ולמקם אותו כך הצד הגבי הוא מוכוון כראוי. השתמש מיקרו פיפטה זכוכית, רכוב על צינור הפה, כדי להסיר PBS ו / או נוזל המקיף את השתל. זה עוזר לתורם ולרקמות המארחות לדבוק והשתל להתבסס.</li>
	<li>לאטום את החלון כולו עם סרט 24 מ"מ רחב ברור כדי למנוע התייבשות וזיהום.</li>
	<li>תייג את העובר הכימרי על ידי סימון בעיפרון על קליפת הביצה ותקליט את מספרו בספר המעבדה. החזירו את הביצה לאינקובטור להמשך פיתוח.</li>
</ol>7. להזריק DiI לתוך כלי הדם של עובר מארח
<ol><li>בנקודת הזמן הניסיונית הרצויה (כאן, 3 - 10 ימים מאוחר יותר), לאחזר את העובר הכימרי מן האינקובטור ולהסיר את הסרט הצלול באמצעות מספריים ישר כדי לקבל גישה לעובר בתוך הביצה.</li>
	<li>במידת הצורך, הגדל את החלון במעטפת באמצעות המספריים. היזהר לא לפגוע בקרום chorioallantoic אם הוא מחובר הקליפה, אשר יגרום לדימום ולסכן את תיוג כלי הדם.</li>
	<li>בחר וריד נגיש על החלמון מוודא שזרימת הדם מופנית כלפי העובר. בחרו נקודת הסתעפות של אחד הורידים הויטליניים (איור 3B, C). הערה: ב E6.5 - E7.5, קרום chorioallantoic ייתכן שיהיה צורך להזיז בעדינות הצידה עם פינצטה כדי לגשת לוורידים חלמון. לאחר E8.5, האפשרות היחידה היא להזריק לתוך אחד ורידים קרום chorioallantoic מאז, בשלב זה, קרום chorioallantoic מכסה באופן מלא את העובר.</li>
	<li>הסר את קרום ויטלין מעל נקודת ההזרקה שנבחרה באמצעות שני פינצטה דומונט #5 על ידי קרע בכיוונים מנוגדים.</li>
	<li>לשבור מחט זכוכית משוך באמצעות דומונט #5 ולהתאים את קוטרו לגודל המשוער של הווריד לפני טעינה עם CellTracker CM-DiI. הפוך את פתרון מלאי DiI ב 40 מיקרוגרם / μl ב DMSO ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הכן את פתרון העבודה ב 0.3 M סוכרוז / PBS בריכוז של 4 מיקרוגרם / μl.<ol>
<li>לשאוף בין 5 - 10 μl של DiI ב 0.3 M סוכרוז / PBS לתוך המחט באמצעות יניקה עם צינור הפה. עוברים מבוגרים יותר עשויים לדרוש עד 25 μl או יותר. מ- E8.5, לעוברים יש ורידים גדולים ושריריים יותר, אשר ייתכן שיהיה צורך להחזיק בעמדה עם דומונט #5 לפני דקירה עם מחט זכוכית טעון DiI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במהירות להכניס את המחט לתוך הווריד ולפוצץ בהתמדה עם צינור הפה כדי לאפשר DiI להצטרף לזרימת הדם לאט מבלי ליצור קריש. לחלופין, השתמש במזרק לחץ למסירת DiI.</li>
</ol>8. קציר עוברים עבור סעיף או בדיקה Wholemount
<ol><li>כדי לשמור על כמה שיותר DiI בתוך העובר ככל האפשר, לקצור את העובר מיד לאחר ההזרקה על ידי גורף אותו על כף מחוררת חיתוך כלי הדם ורקמות חיבור עם זוג מספריים ישרים, כדי לשחרר את העובר מן החלמון.</li>
	<li>הסר את כל הקרומים רופפים לנתח את האיברים של עניין(כלומר,הריאות ואת מערכת העיכול במדריך זה), מקפיד מאוד לא לדחוס את הרקמה, אשר יוצר דיפוזיה של DiI. מיד לתקן את הרקמות על ידי טבילה 4% PFA עבור 1 - 2 שעות ב RT.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה במשך 5 דקות PBS, ולאחר מכן 15 דקות PBS המכיל 5 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI. הר את הדגימות על שקופית מיקרוסקופ גישור לבדיקה הר כולו או להטביע אותם עבור קריו-חתך.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biological+cell+labeling+technique+and+its+use+in+expermental+embryology.">A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology.</a> Developmental Biology. 30, 217-222 (1973).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 97, 305-318 (1999).</li><li>Garcia-Castro, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+differentiation+of+the+neural+crest.+Current+Opinion+In.">Induction and differentiation of the neural crest. Current Opinion In.</a> Cell Biology. 11, 695-698 (1999).</li><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+switches+in+Mammalian+neural+crest+cell+differentiation.">Signals and switches in Mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, (2013).</li><li>Burns, A. J., Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sacral+neural+crest+contributes+neurons+and+glia+to+the+post-umbilical+gut:+spatiotemporal+analysis+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system.">The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system.</a> Development. 125, 4335-4347 (1998).</li><li>Burns, A. J., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development:+analysis+of+the+selective+developmental+potentialities+of+vagal+and+sacral+neural+crest+cells+using+quail-chick+chimeras.">Enteric nervous system development: analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras.</a> The Anatomical Record. 262, 16-28 (2001).</li><li>Burns, A. J., Delalande, J. M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+transplantation+of+enteric+nervous+system+precursors+from+vagal+to+sacral+neural+crest+results+in+extensive+hindgut+colonisation.">In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation.</a> Development. 129, 2785-2796 (2002).</li><li>Burns, A. J., Champeval, D., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacral+neural+crest+cells+colonise+aganglionic+hindgut+in+vivo+but+fail+to+compensate+for+lack+of+enteric+ganglia.">Sacral neural crest cells colonise aganglionic hindgut in vivo but fail to compensate for lack of enteric ganglia.</a> Developmental Biology. 219, 30-43 (1006).</li><li>Wang, X., Chan, A. K., Sham, M. H., Burns, A. J., Chan, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+sacral+neural+crest+cell+contribution+to+the+hindgut+enteric+nervous+system+in+the+mouse+embryo.">Analysis of the sacral neural crest cell contribution to the hindgut enteric nervous system in the mouse embryo.</a> Gastroenterology. 141, 992-1002 (2011).</li><li>Goldstein, A. M., Hofstra, R. M., Burns, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+brain+in+the+gut:+development+of+the+enteric+nervous+system.">Building a brain in the gut: development of the enteric nervous system.</a> Clinical Genetics. 83, 307-316 (1111).</li><li>Delalande, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularisation+is+not+necessary+for+gut+colonisation+by+enteric+neural+crest+cells.">Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385, 220-229 (2014).</li><li>Anderson, R. B., Stewart, A. L., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypes+of+neural-crest-derived+cells+in+vagal+and+sacral+pathways.">Phenotypes of neural-crest-derived cells in vagal and sacral pathways.</a> Cell And Tissue Research. 323, 11-25 (2006).</li><li>Takase, Y., Tadokoro, R., Takahashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost+labeling+with+highlighter+ink+efficiently+visualizes+developing+blood+vessels+in+avian+and+mouse+embryos.">Low cost labeling with highlighter ink efficiently visualizes developing blood vessels in avian and mouse embryos.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55, 792-801 (2013).</li><li>Bates, D., Taylor, G. I., Newgreen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neurovascular+development+in+the+forelimb+of+the+quail+embryo.">The pattern of neurovascular development in the forelimb of the quail embryo.</a> Developmental Biology. 249, 300-320 (2002).</li><li>Mayes, P., Dicker, D., Liu, Y., El-Deiry, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+vascular+imaging+in+fluorescent+tumors+using+multispectral+unmixing.">Noninvasive vascular imaging in fluorescent tumors using multispectral unmixing.</a> BioTechniques. 45, 459-460 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li><li>Eichmann, A., Thomas, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+parallels+between+neural+and+vascular+development.">Molecular parallels between neural and vascular development.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Medicine. 3, a006551 (2013).</li><li>Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessels+and+nerves:+marching+to+the+same+tune.">Vessels and nerves: marching to the same tune.</a> Cell. 120, 299-302 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring.">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436, 193-200 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Senut, M. C., Alvarado-Mallart, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytodifferentiation+of+quail+tectal+primordium+transplanted+homotopically+into+the+chick+embryo.">Cytodifferentiation of quail tectal primordium transplanted homotopically into the chick embryo.</a> Brain Research. 429, 187-205 (1987).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+grafting+caused+extensive+and+heritable+alterations+of+DNA+methylation+in+Solanaceae+plants.">Inter-species grafting caused extensive and heritable alterations of DNA methylation in Solanaceae plants.</a> PLoS One. 8, e61995 (2013).</li><li>Freem, L. J., Delalande, J. M., Campbell, A. M., Thapar, N., Burns, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+organ+specific+commitment+of+vagal+neural+crest+cell+derivatives+as+shown+by+back-transplantation+of+GFP+chicken+tissues.">Lack of organ specific commitment of vagal neural crest cell derivatives as shown by back-transplantation of GFP chicken tissues.</a> The International Journal Of Developmental Biology. 56, 245-254 (2012).</li><li>Delalande, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+tyrosine+kinase+RET+regulates+hindgut+colonization+by+sacral+neural+crest+cells.">The receptor tyrosine kinase RET regulates hindgut colonization by sacral neural crest cells.</a> Developmental Biology. 313, 279-292 (2008).</li><li>Freem, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre;YFP+reporter+mice.">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> Journal of Anatomy. 217, 651-664 (2010).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PloS One. 5, e12674 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה של השתלת צינור עצבי intraspecies, בשילוב עם תיוג כלי דם המתוארים כאן, מנצלת במלואה את קלות הגישה של עובר העופות בתוך הביצית (בהשוואה לעוברים אחרים של בעלי חוליות) כדי לחקור את ההתפתחות המשותפת של אלמנט של מערכת העצבים האוטונומית (ENS) ומערכת כלי הדם.
עבור תיוג נגזרות NCC, שיטת השתלת אפרוחיםGFP-אפרוחים פנים-מין שאנו מתארים יש מספר יתרונות על פני שיטת כימרה קלאסית שליו אפרוח שהוקם לפני למעלה מ -40 שנה1-3. ראשית, תחת אור FITC, פלואורסצנטיות GFP היא בהירה ביותר, במידה שתאי GFP+ ניתנים להבחנה בקלות בעוברים כימריים חיים. זה מאפשר את ההצלחה של השתל להיבדק ovo, ואילו השתלת אפרוחי שליו דורש העובר להיהרג, מעובד immunostained באמצעות QCPN, לפני ההצלחה של השתל ניתן לברר2. שנית, ביטוי GFPב- GFP אפרוח מהונדס הוא ציטופלסמי, ולכן זה לא רק מתייג גופי תאים, אלא גם מאפשר את ההקרנות של התאים המושתלים להיות דמיינו22. זה מאפשר רשתות עצביות מורכבות להיות שנצפו ברזולוציה גבוהה (שים לב כי תחזיות עדינות הם דמיינו בצורה הטובה ביותר כאשר המדגם הוא immunostained עם נוגדן נגד GFP). כמו תיוג QCPN מוגבל גרעין התא שליו, רשתות כאלה אינם נחשפים באמצעות כימרות שליו-חומוס. שלישית, השתלת intraspecies מבטלת את כל ההבדלים המינים הפוטנציאליים בין תאים בתוך העובר הכימרי. מאז עוברי שליו יש תקופת דגירה קצרה יותר מאשר אפרוח (19 ימים לעומת 21 ימים) הוצע כי תאים שליו יש שיעור התפשטות גבוה יותר מאשר תאי אפרוח, אשר עלול להשפיע על התפתחות הרקמות הכימריות23. מעניין גם, הוכח בצמחים כי השתלת interspecies יכול לייצר שינויים נרחבים בדפוסי מתילציה DNA המארח 24. רביעית,אפרוח GFP מקל על ניסויים השתלת גב כדי לטפל בנושאים כגון גורל NCC ומחויבות התא25. החמישית,GFP אפרוח מהונדס שימושי גם עבור טכניקות רבות אחרות, כולל מיון FACS של תת-אוכלוסייה של תא GFP + , תרבות organotypic של איברים המכילים GFP + תאים, מניפולציה גנטית של GFP + רקמה מושתלת באמצעות electroporation של פלסמידים ביטוי26, וטכנולוגיות הדמיה אחרות כגון טומוגרפיה הקרנהאופטית 27.
ניתן לשנות את גישת השתלת הצינור העצבי על ידי החלפה מיקרוכירורגית של כמויות קצרות יותר של צינור עצבי. על ידי שימוש במקטעים קטנים יותר של צינור עצבי המיקרוכירורגיה עלולה להיות פחות מזיקה לעובר וניתן לשפר את ההישרדות. עם זאת, החיסרון של השתלת צינור עצבי פחות הוא כי המספרים של GFP + NCC במארח יופחת. משתמשים יכולים לנסות ולהשיג איזון בין כמות הצינור העצבי מושתל לתת הישרדות אופטימלית של עוברים, ואת המספרים של GFP + NCC בתוך המעי המארח מספיק כדי לתת תוצאות אינפורמטיביות.
עבור ציור כלי שיט, ל- DiI יש את היתרון שהפלואורסצנטיות שלו בהירה וחזקה מאוד. כמו כן, יש לו את היכולת להתפזר במהלך קיבעון הבטחת כתמים של נימים פתוחים הטובים ביותר. מכיוון שמדובר בצבע חיוני, עוברים יכולים לשרוד את הליך ההזרקה ולהמשיך להתפתח עם מערכת כלי דם מוכתמת (עד 24 שעות בידיים שלנו, אם כי הכתם הופך להיות יותר נוקב לאורך זמן, ראה איור 3E). השילוב של השתלתGFP אפרוח עם ציור כלי דם DiI ולכן תואם הדמיה חיה. מלבד כל היתרונות הללו, חשוב לציין כי הזרקת כלי דם רק מתייגת כלי זוהר ולכן אינה מזהה נימים שלא נפתחו, תאי קצה אנדותל או תאי אנדותל מבודדים. עם זאת, התקדמות נוספת transgenesis העופות יכול לספק דרכים חדשות לעקוף נושאים כאלה, כפי שמדגים ניסויים באמצעות Tg(עניבה1:H2B-eYFP) שליו עוברים ללמוד מורפוגנזה כלידם 28. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא, עבור תיוג כלי יעיל בעוברים ב E7.5 ומעבר, כמויות גדולות יותר של צבע צריך להיות מוזרק, אשר יכול להפוך ניסויים יקרים. עם זאת, שינוי של הטכניקה יכול לכלול עלות נמוכה כלי דם תיוג סימון דיו14, אם כי גישה זו לא נוסתה בידיים שלנו.
שלבים קריטיים של ההליכים כוללים את תהליך הדמיית העובר על ידי הזרקת דיו מתחת לבצק. אם הממברנה המכסה את החלמון נקרעת על ידי המחט המלאה בדיו בשלב זה אז הישרדות העובר נפגעת קשות. כמו כן, חשוב, בעת הכנת צינור עצבי תורם, כי הרקמה לא נשאר במשך זמן רב מדי בלבלב (לשקול כ 10 דקות כמקסימום). חשיפה ממושכת ללבלב פוגעת ברקמה והצינור העצבי קשה לאחר מכן לטפל בו והוא לא ישלב היטב במארח. צובר ניסיון של טכניקת הזרקת DiI על עוברים מסוג בר הוא חיוני לפני הזרקת עוברים כימריים, כמו רק ניסיון אחד בהזרקה אפשרי בדרך כלל עבור כל עובר. נפח DII וקוטר מחט הם פרמטרים קריטיים עבור כל עובר ויש להעריך על סוג פראי, פקדים תואמי שלב.
לסיכום, שיטת התיוג הכפולה שלנו של השתלת צינור עצבי וציור כלי DiI בעוברים של אפרוחים חיים יכולה לשמש כדי לחקור את היחסים ההדדיים בין רשתות NCC וכלי דם במהלך organogenesis. בהתחשב במנגנונים האחראים על ביסוס היעד הנכון innervation ו vascularization במהלך פיתוח איברים עדיין ידועים במידה רבה, מתודולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל תגליות עתידיות בתחום זה.

עובר העוף הוא אורגניזם מודל שלא יסולא בפז בביולוגיה התפתחותית של בעלי חוליות, לא פחות משום שהתפתחותו באובו מאפשרת מניפולציות ניסיוניות שאחרת בלתי אפשריות לביצוע בחולייתנים המתפתחים ברחם. נגישות זו וקלות המניפולציות הובילו לכך שעובר הגוזל ממלא תפקידי מפתח בתגליות מהותיות רבות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. בין הטכניקות החזקות ביותר היה השימוש בעוברים כימריים אפרוחי שליו כדי לחקור את גורל התא, שיטה חלוצית על ידי פרופסור ניקול לה Douarin בשנות ה-70 1-3. בפרט, כימרות שליו-חומוס היו שימושיים במיוחד כדי לסמן גנטית ולעקוב אחר אוכלוסיות גבוהות של תאי ציצה עצביים נודדים (NCC) במהלך ההתפתחות המוקדמת. NCC הם אוכלוסייה רב-תכליתית של תאים נודדים, הנובעת באקטודרם הגבי בשולי הצינור העצבי, המולידה מגוון רחב של סוגי תאים ברחבי העובר החולייתני. אלה כוללים מבנים craniofacial (סחוס, עצם, שרירים), נוירונים גליה (במערכת העצבים החושית והאוטונומית), מלנוציטים, ותת-אוכלוסין של תאים של המערכת האנדוקרינית2,4,5. אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על גורל NCC הוא מיקומם הראשוני לאורך הציר האחורי-ראשי של הצינור העצבי. לדוגמה, NCC אנטרי, אשר מעוררים את הנוירונים ואת גליה של מערכת העצבים האנטרית (ENS), נובעים משתי תת אוכלוסיות נפרדות: הראשון ממוקם באזור vagal (caudal hindbrain), והשני באזור sacral של הצינור העצבי6-13. השתלה בין-מינים או פנים-מינים של האזורים המתאימים של הצינור העצבי היו הטכניקות המועדפות לתייג תאים אלה לצמיתות ולאחר מכן לאפשר מעקב, מלידתם בשולי הצינור העצבי, ליעדם הסופי בתוך מערכת העיכול6,7,10.
מניפולציה עוברית נוספת שקל יותר לבצע בחומוס, בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים, היא תיוג חיוני של מערכת כלי הדם. ואכן, ככל שעובר הגוזל מתפתח, הוא מונח על גבי רשת כלי דם חוץ-עוברית המסתובבת חמצן וחומרים מזינים מהחלמון. רשת כלי דם נגישה זו, הממוקמת על פני השטח של החלמון, יכולה לשמש כשער לתיוג מערכת כלי הדם המתפתחת של העובר במהלך organogenesis12,14-17. הזרקה תוך-וסקולרית של צבעים שונים, כגון צבע ליפופילי DiI, מאפשרת לציין /להכתים את כל כלי הדם הזוהרים של רשת כלי הדם המתהווה.
מכיוון שאיברים מתפתחים צריכים להיות מחוברים הן למערכת העצבים (לשליטה חושית ומוטורית) והן למערכת כלי הדם (להחלפת גזים, אספקת נוזלים וחומרים מזינים), שתי הרשתות מתפתחות זו לצד זו וחולקות קווי דמיון בולטים בארכיטקטורת ההסתעפות שלהן18-20. כאן אנו מדווחים על מניפולציות עובריות המאפשרות לנו לחקור את ההתפתחות הסימולטנית של ENS שמקורו ב- NCC, יחד עם מערכת כלי הדם, במהלך organogenesis. זה מושגת על ידי יצירת כימרות עוף באמצעות השתלת קטעים נפרדים של הצינור העצבי, כולל הסמל העצבי, בשילוב עם הזרקת DiI כלי דם. כהתקדמות מכומרות עוף שליו, השיטה שלנו משתמשת בעוברים מהונדסים של אפרוחי GFP להשתלה תוך-מין, מה שהופך את טכניקת ההשתלה לחזקה יותר, במונחים של תאי הדמיה והתחזיות שלהם, ומבטל כל הטיה פוטנציאלית הקשורה להבדלים בין מינים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="58">
			<td height="79" rowspan="2" style="height:80px;width:528px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:312px;">Company&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:320px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Fertilised chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">Henry Stewart and Co, Louth, UK</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">Fertilised GFP chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Egg incubator (Profi-H Hatcher)</td>
			<td>Lyon Technologies, CA, USA</td>
			<td style="width:320px;">910-033</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">14C Incubator</td>
			<td style="width:312px;">Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK</td>
			<td style="width:320px;">Model LT2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo-microscope&#160;</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">Model MZ 12.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">DC500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">IM50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Goose neck halogen cold light source</td>
			<td style="width:312px;">Advanced Imaging Concepts, Inc</td>
			<td>KL 1500 LCD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">181&#8260;2 G hypodermic needle&#160;</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">HSWNH181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancreatin</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">P3292</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>D5030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>G6767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">5ml syringe</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z248010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Mouth tube</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">A5177</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in.</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">S6018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Transfer pipettes, polyethylene</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z350796&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PY8 30-0035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holders (Nickel-plated pin holder)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:320px;">15371-92</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>11251-30&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Minutien pins&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">26002-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11210-10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perforated spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10370-18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten needles (0.125mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10130-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sellotape (clear, 24mm width)</td>
			<td style="width:312px;">Any Supplier</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution</td>
			<td style="width:312px;">VWR international</td>
			<td>101447-068&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:312px;">Dow Corning</td>
			<td>S09 512 516</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pelikan black ink</td>
			<td style="width:312px;">Pelikan</td>
			<td>211-169</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">C-7001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Settings for glass needle puller&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller model P-86</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual labeling of neural crest cells and blood vessels within chicken embryos using chickgfp neural tube grafting and carbocyanine dye dii injection

כל האיברים המתפתחים צריכים להיות מחוברים הן למערכת העצבים (לשליטה חושית ומוטורית) והן למערכת כלי הדם (להחלפת גזים, אספקת נוזלים וחומרים מזינים). כתוצאה מכך, הן מערכות העצבים והן מערכות כלי הדם מתפתחות זו לצד זו וחולקות קווי דמיון בולטים בארכיטקטורת ההסתעפות שלהן. כאן אנו מדווחים על מניפולציות עובריות המאפשרות לנו לחקור את ההתפתחות הסימולטנית של רקמת עצבים שמקורה בסמל עצבי (במקרה זה מערכת העצבים האנטרית), ואת מערכת כלי הדם. זה מושגת על ידי יצירת כימרות עוף באמצעות השתלת קטעים נפרדים של הצינור העצבי, ואת הסמל העצבי הקשורים, בשילוב עם הזרקת DiI כלי דם באותו עובר. השיטה שלנו משתמשת בעוברים מהונדסיםשל אפרוחים GFP להשתלה תוך-מינית, מה שהופך את טכניקת ההשתלה לחזקה יותר מפרוטוקול השתלת אפרוחי השליו הקלאסי המשמש בהשפעה רבה מאז שנות השבעים. השתלת אפרוחיםGFP-אפרוחים intraspecies מאפשרת הדמיה של תאים מושתלים ואת התחזיות שלהם ברקמות שלמות, ומבטלת כל הטיה פוטנציאלית בהתפתחות התאים הקשורה להבדלים בין מינים. שיטה זו מנצלת במלואה את קלות הגישה של עובר העופות (בהשוואה לעוברים אחרים של בעלי חוליות) כדי לחקור את ההתפתחות המשותפת של מערכת העצבים האנטרית ומערכת כלי הדם.

איור 1 מראה מכשירים אופייניים הדרושים לביצוע בידוד מיקרו-כירורגי והשתלה של הצינור העצבי. איור 2 מציג את הליך ההשתלה. לאחר ההשתלה עוברים נבדקים להצלחת ההשתלה. זה כרוך בבדיקת העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, בדרך כלל בבוקר שלאחר מיקרוכירורגיה, לנוכחות של שתל נגזר (GFP +) NCC. אם ההשתלה הייתה הצלחה, אז GFP + NCC ניתן לראות בקרבת הצינור העצבי ובמסלולי הגירה מוקדמת המובילים לכיוון המזלג. אם ההליך לא הצליח, GFP + NCC לא יצוין מחוץ לצינור העצבי, או אם הם נמצאים במחשב המארח הם עשויים להיות במספרים קטנים יותר. העוברים הלא מוצלחים האלה מושלכים. בדרך כלל, 5-8 השתלות צינור עצבי מבוצעות ביום אחד, ומתוכם 80% מוצלחים. הסיבות להשתלת צינור עצבי לא מוצלח כוללות מוות של העובר עקב נזק לרקמות שנגרמו במהלך מיקרו-כירורגיה, או כישלון של הצינור העצבי להשתלב בעובר המארח. זה האחרון יכול לנבוע מיקום לקוי של הצינור העצבי בתוך המארח או מצינור עצבי באיכות ירודה עקב טכניקת ניתוח לקויה או מחשיפה מוגזמת לאנזים דיסוציאציה. שלב ההקרנה הראשוני, כמו גם בדיקות מאוחרות דומות עבור תאי GFP + , שימושי כפי שהוא אומר כי זמן ומשאבים אינם מבוזבזים על ידי ביצוע ניסויים על עוברים שאין להם GFP שכותרתו NCC בתוך המעיים.
איור 3 מראה את ההליך להזרקת DiI של כלי הדם. היעילות/ ההצלחה של טכניקת הזרקת DiI תלויה: ראשית, חיתוך מחט ההזרקה לקוטר האופטימלי עבור הווריד הממוקד, השני מחווה מדויקת בעת החדרת המחט לווריד (כך שלא לנקב דרך הצד השני), ושלישית הימנעות המחט מקבל פקוק במהלך ההזרקה על ידי נושבת בקצב קבוע. אם אחד משלושת הפרמטרים האלה נעשה באופן שגוי, העובר ידמם למוות או יצטרך כמה שעות כדי להתאושש לפני ניסיון שני נעשה כמו הדימום עושה את זה כמעט בלתי אפשרי להזריק מחדש מיד. עוברים מוצלחים צריכים להיבחר באופן מיידי על ידי צפייה תחת מיקרוסקופ stereofluorescence ויש לנתח במהירות. בעוברים מוצלחים, כלי דם המסומנים ב-DiI נמצאים בכל העובר (איור 3C,D)כולל מיטות נימי(איור 3D).
עם קצירת עוברים ובדיקת מקטעי רקמות או מערכת העיכול כולה, תוצאות אופייניות חושפות את GFP+ NCC בתוך ה- ENS הפרימיטיבי ואת המבנה העדין של רשתות כלי הדם במעיים המסומנים ב- DiI (איור 4) ניתן לבחון תכשירים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לפיה ערימות תמונה מייצרות שחזורים תלת מימדיים (3D) המראים את יחסי הגומלין בין התחזיות העדינות של תאי GFP + ENS לבין מערכת כלי הדם המוכתמת ב- DiI (איור 4 A-C; ג'י-איי. סרטונים 1 ו-2.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig1.jpg"> איור 1. מכשירי מיקרוכירורגיה מומלצים. (א) מיקרו אזמל בצורת מחט תפירה. (B) אבן ארקנסו משובחת לעיצוב אזמל מיקרו. (C) a) מספריים ישרים, ב) מספריים מעוגלות, ג) 5 מזרק מיליליטר עם 181/2 G מחט hypodermic, ד) פיפטה פלסטיק, ה) מחזיק ביצה בהתאמה אישית, ו) דיו שחור, ז) זכוכית שעון מרובע, ח) זכוכית שעון מרובע עם בסיס sylgard שחור, i) מיקרו אזמל על מחזיק מחט, j) סיכות minutien, k) minutien או מחט טונגסטן על מחזיק מחט, l) Pascheff-וולף מספריים האביב, m) Dumont #5 פינצטה, n) כפית מחוררת, אוי) קצר אש משך מחט העברה, oii) ארוך אש משך מחט בדיו, p) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a> 
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig2.jpg"> איור 2. השתלת צינור עצבי תוך-מיני. תמונות הצינור העצבי של צ'יק עובר /GFP שונו מדללנד ואח '. 12. כלי דם אינו הכרחי עבור קולוניזציה במעיים על ידי תאי ציצה עצבית אנטרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig3.jpg"> איור 3. הזרקת DiI תוך ורידי. (א) מכשירים מומלצים: א) CellTracker CM-DiI טיפה על parafilm, ב) משך מחט הזרקת זכוכית, ג) צינור הפה. (B) דיאגרמה סכמטית של הזרקת DiI תוך ורידי לעובר אפרוח כימרי E4. (ג) בהזרקה תוך ורידית ovo DiI מראה מחט זכוכית עדינה המכילה DiI מוכנס לתוך הווריד (חץ). (ד) E4 עובר כימרי פוסט הזרקת DiI (אדום) עם צינור עצבי GFP + (חץ). (ה) רשת כלי דם עדינה מוכתמת DiI בעובר חי, 24 שעות לאחר ההזרקה. Br: מוח; H: לב; LB: ניצן גפיים; ת: אלנטויס. תמונות ב- (C) ו- (D) שונו מ- Delalande et al. 12 ,12 כלי דם אינו הכרחי עבור קולוניזציה במעיים על ידי תאי ציצה עצבית אנטרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig4.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות בקיבה ובקיבה של עובר אפרוח E5.5. (A-C) אני לא יכול לעשות את זה. שחזור תלת מימדי (3D) של מחסנית תמונה קונפוקלית באזור הקיבה המציגה (D) את תאי הסמל העצבי האנקטי GFP + (ENCC) (E) מערכת כלי הדם המוכתמת ב- DiI ו- (F) תמונה ממוזגת של שתי הרשתות מקטעים היסטולוגיים D-F ברמת הבטן מראה (G) GFP + ENCC (H) מערכת כלי הדם מוכתם DiI ו (I) תמונה ממוזגת של שתי הרשתות. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (ציאן). (G-H) שחזור תלת-ממדי של מחסנית תמונות קונפוקלית באזור caecum המציג (A) את חזית ההעברה GFP+ ENCC בירוק, (B) את מערכת כלי הדם המוכתמת ב- DiI באדום, ו- (C) תמונה ממוזגת של שתי הרשתות. תמונות (A-F) שונו מ Delalande ואח '. 12 ,12 כלי דם אינו הכרחי עבור קולוניזציה במעיים על ידי תאי ציצה עצבית אנטרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/52514/52514figS1.jpg"> איור S1. בידוד של צינור עצבי GFP+ תורם מהרקמות שמסביב על ידי עיכול אנזימטי ומיקרו-ניתוח. (א) צינור עצבי GFP+ וסומיטים סמוכים נותחו מהעובר התורם. (ב) צינור עצבי מבודד לאחר עיכול הלבלב ומיקרו-ניתוח באמצעות סיכות מינוטין אל-חלד. אז: סומיטי; NT: צינור עצבי; נ.נ: נוטוקורד.
<img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514video1.jpg"> סיבוב תלת מימדי 1. 360° של התמונה באיור 4C, המציג את מערכת כלי הדם ואת ENCC בבטן ב- E5.5 (HH27-28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514video2.jpg"> סיבוב תלת מימדי 360° של התמונה באיור 4I, המציג את מערכת כלי הדם ואת חזית ההעברה של ENCC באזור ה- caecum ב- E5.5 (HH27-28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection at JoVE.co

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

dual-labeling-neural-crest-cells-blood-vessels-within-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

8.0K Views.  UCL Institute of Child Health. כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנז...

Video: Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...