אנו מודים שלומי קריספין עבור התמונה בצינור העצבי. בפרט, אנו מכירים יובל קינמון ליזום את הטכניקה transfection GFP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע, אגודת Francaise contre les Myopathies ו Forschungsgemeinshaft Deutche, מרכז מחקר משותף ל 488 CK

1. הכנת micropipettes אנו למשוך pipettes שלנו על Narishige תקן PP-83 פיפטה חולץ עם הגדרת החום של 13.5. ההגדרה המדויקת חייב להיות מכויל, מכוון בקוטר טיפ פיפטה של ​​בין 8 ל 10 מיקרון. אנו משתמשים חוט המכילים צינורות זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.0 מ&quot;מ בקוטר הפנימי של 0.75-0.78 מ&quot;מ. Pipettes מאוחסנים ולכן בצלחת פלסטיק בקצות מוגן מפני מגע עם הקצוות של המנה. 2. ה-DNA הכנה פלסמיד של הריבית transfected לתוך DH5α E. coli באמצעות נהלים סטנדרטיים. תרבויות לינה ממושבות יחיד משמשים לטהר את הפלסמיד באמצעות maxi-מכין ערכות (כל ערכה המסחרי צריך לעשות). אנו משתמשים ריכוז הפלסמיד של 1.0 מיקרוגרם / μL שאינם משובטים זריקות. ריכוזים גבוהים יותר להגדיל את סתימת טיפים פיפטה. עבור יישומים המשובטים, ריכוזי פלסמיד הם הרבה יותר נמוך חייב להיות מותאם (ראו להלן). עבור pCAGG-GFP, ריכוז אופטימלי לייצור תוצאות המשובטים נמצאה על 0.05-0.1 מיקרוגרם / μL. אחת ל 2 μL של פלסמיד משמש בדרך כלל לכל הניסוי, כמות מזערית של אבקת מהיר ירוק (שמירה על קצה פיפטה יבשה זכוכית חדים) מתווסף הפלסמיד לפני שהניסוי יתחיל. הפלסמיד הוא centrifuged אז בצנטריפוגה השולחן במשך 2 דקות במהירות מקסימלית. הליך זה נראה להפחית פיפטה, סתימת בעיות. 3. הזרקה של עוברים 3.1 הכנת עוברים אנו משתמשים שליו כמו גם ביצי תרנגולת זריקות. הביצים מודגרות שוכב על ציר ארוך שלהם עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. הביצים ניקה עם 70% אתנול ו להתייבש. בסוף הצביעה של הביצה הוא דקר במספריים כירורגית (זה הכרחי רק ביצי תרנגולת) ו 1 מ&quot;ל (ב שלווים) או 2 מ&quot;ל (חומוס) של חלבון הוא נמשך מן הביצה עם מזרק מ&quot;ל 10 (19G מחט). החורים סגורים אז עם פרפין חם. לפני ההזרקה בפועל, חלון נפתח בחלק העליון של קליפת הביצה באמצעות מספריים כירורגיות. הנחת סרט דביק על הקליפה חיתוך דרך זה יכול לעזור להפחית את הפסולת מן הקליפה. חיץ PBS המכיל אנטיביוטיקה היא pipetted מיד לתוך הביצה. כדי לגשת את העובר ואת vitelline / או קרומי מי השפיר הם לגזור הוסט באמצעות סיכות חרקים 0.14 מ&quot;מ מותקן על גבי מחזיק מחט. אינו רעיל דיו (שקנאי # 17) מוזרק מתחת blastoderm כדי לעזור להמחיש את העובר, באמצעות אש משך נימי רכוב על aspirator. 3.2 טוען ואת הרכבה של micropipettes Micropipettes חולץ ניתן לטעון עם הפלסמיד על ידי אש משך נימים בקוטר נאותה, רכוב על גבי aspirator. כמות מינימלית של פלסמיד נשאבים באמצעות נימי וטעון פיפטה ממול פתיחתו ועד קצה מחודד, והוא מתקרב קצה מבפנים כמה שיותר. פיפטה נטען וכתוצאה מכך על לחץ אוויר ידני מזרק רכוב על micromanipulator. לחץ מינימלי מוחלת, במידת הצורך, כדי לאפשר את פתרון פלסמיד להגיע אל קצה פיפטה. 3.3 הזרקת פלסמיד פיפטה היא מניפולציה לתוך המדיום הנוזלי של הביצה תוך יישום כמה לחץ אוויר כדי למנוע סתימת של קצה פיפטה. תחום הרקמה הרלוונטית היא פירסינג. השינוי בלחץ כמו קצה נכנס רקמה היא לעתים קרובות מספיק כדי לשחרר את הפלסמיד עם ירוק מהיר גלוי. אם זה לא המקרה, להפעיל לחץ קל על המזרק עד ירוק פלסמיד / מהר נפלטים. תהליך זה ניתן לחזור לאורך ציר של העובר, למשל somites הסמוך או לאורך היקף הצינור העצבי. בעקבות זריקות, PBS ניתן להוסיף. החלון אטום באמצעות סרט דביק (parafilm אינו רצוי במיוחד עבור שליו ביצים, הוא מגביר את שיעורי המוות העובר, ככל הנראה על ידי חסימת החליפין של חמצן דרך הקליפה). עוברים טיפול מוחזרים באינקובטור. הימנע אוורור המקום מכולות קטן עם מים בחממה כפי שהם מסייעים לשמור על התשואות לחות להגדיל. 4. התאמת פרמטרים הזרקת ניטור שיעורי ההצלחה Asessing ו כיול פרמטרים שונים זריקה קריטית עבור יישומים מכוון ניתוח מתא בודד. לא כל אירוע זריקת תוביל תיוג מוצלח של תא בודד. ריכוז פלסמיד אשר גבוה מדי עלול להוביל תיוג לא משובטים, בעוד ריכוזים נמוכים מאוד עקב שיעורי כישלון גבוהים. ריכוז של פלסמיד שהוחדר חייב להיות מותאם זריקות משובט. אנו ממליצים על דילול המניות כולו פלסמיד מטוהרים ולא דילול preps הפרט הריכוז שנקבע מראש. האחרוניםאולי להכניס קצת שונות של אחוזי ההצלחה, ככל הנראה בשל שינויים טוהר ופרמטרים נוספים כגון שיעור פלסמיד supercoiled. 4.1 הערכת שיעורי ההצלחה על ידי תצפית הר שלם הערכה ראשונית של עוברים מוזרק יכול להתבצע על ידי כל תצפית הר המשקפת תחת ניאון. שש עד שמונה שעות לאחר הזרקת מספיקים כדי להעריך את שיעורי ההצלחה עם לבנות pCAGG משופרת GFP. זה סיפק את אתר היעד היא שטחית מספיק כדי להיות ברורה ממבט ראשון (למשל somite הגבי, בצינור העצבי הגבי, וכו &#39;האאקטודרם, ראה איור 1A-C.). צעד זה שימושי במיוחד להערכת סדרת ניסויי בתערוכה או תאים שכותרתו יותר מדי או לחילופין, חסר כל התאים ניאון. אם הדגירה נוסף הוא הרצוי, אנטיביוטיקה המכילים פתרון PBS יש להוסיף את הביצה לאחר צפייה בקלטת איטום צריך להיות מוחלף. 4.2 clonality הערכת ידי ניתוח סדרתי, בסעיף האמצעי הטוב ביותר להערכת שיעורי זריקות מוצלחת היא סדרתי, חתך עוברים מוזרק באמצעות אימונוהיסטוכימיה לדמיין את התאים שכותרתו. בתנאים אלה, פעמים הדגירה יכול להיות קצר ככל 4 שעות לאחר ההזרקה. עוברים קבועים ומעובדים עבור חתך פרפין (או cryosectioning). זכוכית רכוב חלקים אז הם דה paraffinized ו חיסונית מוכתם להדמיה הכתב. שיטות הגברה כגון ביוטין, streptavidin עשויה להיות רצויה. לבסוף, סעיפים הסידורי נסרקים לגילוי תאים שכותרתו במגזרי מוזרק. אם על הניסויים הראשוניים מרובים יותר מאשר תאים בודדים מתקבלים, המניה פלסמיד חייב להיות מדולל והתהליך חוזר על עצמו עד תוצאות נאות מושגות. שני עד פי 10 דילולים של הפתרון מניות פלסמיד עשוי להיות נחוץ במקרים של שיעורי ההצלחה להיות גבוה מדי. עבור כל פלסמיד להיות transfected, כיול יסודית שתבטיח clonality יש לחזור. 5. נציג תוצאות אנחנו בדרך כלל לבצע הזרקה בודדת של pCAGG-GFP לכל somite, תוך מיקוד קטעים 6-12 לכל העובר 1 2. תחת הגדרה זו, אות ברור יכולים להתגלות כל הר 8 זריקה תצפית שלאחר שעות, בקטע אחד לפחות של עובר אחד מתוך עשרה. בתנאים אלה, תיוג אושרה עוד להיות משובט (איור 1 ב &#39;, ג&#39;). בעת שימוש בריכוזים גבוהים DNA, רוב העוברים עשוי להפגין לפחות זריקה אחת מוצלחת, מעלים את האפשרות כי מספר תאים כבר transfected. ניתוח סעיף סידורי גילה כי transfections המשובטים הושגו כאשר שיעור ההצלחה היה 10%. משמעות הדבר היא כי על מנת להשיג clonality, הטכניקה היא לפי הגדרה, לא יעיל במיוחד. מצד שני, בתנאים אלה, יותר מ 93% של אירועים תיוג חיובי נמצאו 1 משובט. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. זריקות המשובטים של pCAGGS-GFP לתוך אבות עצביים השלד. (AC) סעיפים רוחבי מראה תיוג של הצינור העצבי הגבי (NT) (א), תחום ventrolateral של dermomyotome (DM) (ב), או גיליון DM מרכזי (C) , 6hr לאחר microinjection של pCAGGS-GFP על אב אחד. (ד) יומיים לאחר transfection המשובטים של המרכזי, אבות DM יחיד שנוצר נגזרים בדרמיס שני (ד &#39;), כמו גם שרירים (M) (ראו נ&quot;צ. 1 לפרטים נוספים).

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת לעיל הוא שינוי של טכניקה שתואר לעיל עבור אספקת צבעים lipophilic אל תת תאים קטנים או אבות חד 3. יש שלושה יתרונות עיקריים על הטכניקה electroporation סטנדרטי. ראשית, הוא מספק אמצעי עם תיוג אתרים ביטחון דיסקרטית ברקמות היעד, ומאפשר ברזולוציה מרחבית הרבה יותר מאשר electroporation (ראו איור 1B לדוגמה, C). שנית, הוא מאפשר תיוג של תאים בודדים, ובכך מאפשר להתחקות אחר שושלת היוחסין שלהם ב-vivo אחרת תחת תנאים נורמליים 1 2 (איור 1 ג, ד). שלישית, גן להחמיץ ביטוי ברמה מתא בודד מספק כלי לחקר המנגנונים המולקולריים של הפרדה השושלת, ללמוד את התפקיד של גורמי גדילה או של גנים אחרים על התנהגות הסלולר ברקע נורמלית אחרת, וכו &#39;לכן, שיטה זו משלימה הטכניקה electroporation מיושמים באופן נרחב, ועוד מנצל את הנגישות של העובר העופות כדי לזכות-spatio temporally מוסדר אובדן תפקוד הגן ב-vivo. יישום רלוונטי יותר ויותר היא ניתוח של התנהגויות הסלולר ברמת תא בודד (נדידת תאים, הדרכה axonal, חלוקת התא וכו &#39;) באמצעות טכנולוגיות הדמיה המתעוררים לחיות 4 5 6 7. בחלק מן ההגדרות האלה ניסיוני, זה יכול להיות רצוי להשתמש מהירה הפעלה מינים הכתב (כגון ונוס-GFP) 8 על מנת לאפשר ראיה קודמות של התא שהוחדר. לנוכח הפשטות של השיטה המתוארת כאן, סביר מאוד שזה יכול להיות מיושם גם בבעלי חיים אחרים, כגון דג הזברה Xenopus. המערכת היא קלה מאוד להתקנה ולשימוש, והקושי העיקרי הוא לייצר סדרה מספיק גדול של עוברים שכותרתו, כמו גם סריקה עבור הצאצאים שכותרתו ביישומים הדורשים סדרתי, קטעים. בידיים שלנו, התאים מוזרקים הציג אות ה-GFP לזיהוי בקלות עד 3 ימים, אך פרמטר זה עשוי להיות תלוי שיעורי התפשטות תאים. באמצעות כתב חיים ארוכים כמו לאק-Z, או transposon בתיווך העברת גנים המובילים שילוב יציב 9, אפשר יהיה להאריך מעקב של הצאצאים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

נושא מרכזי בביולוגיה התפתחותית היא גיוון של שושלות ועל הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס. זה כרוך ניתוח מעמיק של גורלם של תאים בודדים בתנאים נורמליים וניסיוני. לשם כך, שיטות transfection כי היעד אבות חד הם תנאי מוקדם. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה מבחינה טכנית עבור transfecting תאים בודדים ברקמות עוף, אובו, המאפשר מעקב אחר השושלת אמין כמו גם מניפולציה גנטית. תחומים ספציפיים ברקמות ממוקדות בתוך somite או בצינור העצבי, ו-DNA מוזרק ישירות לתוך האפיתל של עניין, וכתוצאה מכך transfection סדירה של תאים בודדים. באמצעות כתבים, אוכלוסיות המשובטים וכתוצאה מכך עלול לייחס לתקופה של עד שלושה ימים, התנהגות של אוכלוסיות המשובטים מניפולציות גנטיות ניתן להשוות עם זה של הביקורת. שיטה זו מנצלת את הנגישות של העובר חומוס יחד עם כלים חדשים עבור מניפולציה גנטית. אנו משווים ולדון יתרונות על פני שיטת בשימוש נרחב electroporation, יישומים אפשריים לשימוש ב-vivo מודלים נוספים הציעו גם הם. אנחנו תומכים את השימוש בשיטה זו כתוספת משלימים משמעותי על השושלת התחקות קיימים כלי התערבות גנטית.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transfection in Chick Embryos at JoVE.com

Single Cell Transfection in Chick Embryos

באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ&quot;א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Google

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  Hadassah Medical School - Hebrew University. באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.

Video: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...