שלום, אני קאי ג'ין מאוניברסיטת יאנגז'ו. בשם קבוצת המחקר שלנו אני הולך להציג כלי רב עוצמה של עובר התרנגולת במחקר התפתחותי. עובר עוף הוא מודל התפתחותי קלאסי ששימש לחקר התפתחות והבחנה, למעשה, האמצעים החיצוניים של המעבדה לעוברי עוף הם כלי רב ערך לביולוגיה התפתחותית, כגון טרנספקציה של גנים, רבייה מהונדסת והכנה טרנסמורלית של גונדאל.
במעבדה שלנו ביססנו את שיטות ההזרקה מסוג mu, אך עבור חוקרים רבים, פרטי ההזרקה אינם ברורים וקשים ליישר אותם. אז בסרטון זה, אנו הולכים להראות את הפרטים של הזרקת כלי דם במהלך השלב המוקדם של התפתחות עובר עוף באובו. אתה מוזמן ליצור איתנו קשר אם אתה מעוניין בכך.
כאן אנו מציגים את פרטי הפרוטוקול. איסוף והכנה של ביציות מופרות. ראשית, בניגוד ליונקים יש לתרנגולת מיליוני זקיקים בשחלה אחת, אך רק מעטים מהזקיקים האלה בוגרים מספיק כדי לביוץ.
כל זקיק מכיל ביצית אחת או תא נבט אחד. ברגע שהזקיק מבשיל ומשחרר את החלמון שלו, הוא משולב במשפך של החצוצרה. כאשר הזקיק נכנס לבטן הג'וגולרית של האובידוקט, הזרע נקשר לביצית בגוף התרנגולת והסידן בגוף התרנגולת יוצר קליפה שעוטפת את הביצית המופרית ויוצרת ביצת קליפה רכה בגוף.
קליפות הסידן מתעבות בהדרגה עד שמייצרים את הביצה. אספו את הביצית המופרית, הנקראת אקדמית ביציות עובריות והניחו אותן בצורה מסודרת על מתלה באינקובטור בטמפרטורה של 37.8 מעלות צלזיוס ו-60% לחות. העוברים מודגרים בתנאים מתאימים.
לאחר יומיים דגירה מופיעות נקודות אדומות פועמות קטנות הנקראות לבבות ראשוניים. תהליך זה נקרא מכות דובדבן. בסביבות יומיים וחצי, כלי הדם נראים לעין ומקטעי הלב והגוף נוצרו.
הכנת מחט ופלסמיד. אנו משתמשים בנימי זכוכית כמחטים. לפני ההזרקה להכין נימי זכוכית עם קוטר חיצוני של מילימטר אחד ואת הקוטר הפנימי של 0.6 מילימטרים.
החומרים האקסוגניים הם בדרך כלל פלסמידים, לנטי-וירוסים ארוזים ותאי נבט ראשוניים, או מחשבים אישיים. בסרטון זה, אנו משתמשים בכחול טריפאן כדי להראות את עקבות החומרים המוזרקים. חלונות. לפני חשיפת העוברים, עלינו לעקר את העוברים כדי למנוע זיהום חיידקים.
זה נעשה על ידי ניגוב עדין של פני השטח של העוברים עם 75% אלכוהול צמר גפן כדור באתר פתיחת הביצה. לאחר החיטוי, הקש בעדינות על הקצה הקהה של קליפת הביצה עם מלקחיים וחתך בזהירות חור של 0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ על פני קליפת הביצה עם המלקחיים כדי לחשוף את העובר. הזרקה תוך-וסקולרית In-ovo.
התבוננו בנוף שמתחת למיקרוסקופ, התאימו את מוקד המיקרוסקופ כדי לאתר תחילה את העובר ואז מצאו את כלי הדם של עובר העוף מוכנים להזרקה. כוון את המחט עם החומר האקסוגני בכלי הדם, וציין כי המחט מקבילה לכלי הדם המוזרק. הכנס את המחט בעדינות לתוך כלי הדם ולאחר מכן הפעל את משאבת האוויר.
בשלב זה, החומר הזר נכנס לעורק ועם פעימות הלב, מסתובב בחזרה לעובר דרך העורק, ולאחר מכן לווריד. ישנם שני סוגים של זריקות כלי דם. האחד הוא הזרקת ראש שבה החומר הזר מוזרק מווריד בראש העובר וזורם בחזרה ללב.
השני הוא הזרקה אבי העורקים הגבי שבו החומר הזר מסתובב לעובר עם פעימות הלב. עם פעימות הלב העוברי ומחזור הדם אנו יכולים לראות בבירור כי החומר הזר מתקבל על ידי הנימים בקצה העורק, לתוך הווריד ולאחר מכן חוזר לעובר מהווריד, מה שמעיד על כך שהחומר הזר מוזרק מועבר למעשה לכל חלק של העובר. לאחר ההזרקה, מוציאים את הביצה מהסטריאומיקרוסקופ, חותכים פיסת סרט רפואי באורך שלושה סנטימטרים עם מספריים קטנים, ומחברים את הקלטת לפתח.
מגרדים בעדינות את הקלטת עם המספריים כדי לסחוט את בועות האוויר, ואז חותכים עוד חתיכת סרט כדי לאטום את הפתח לצלב. לאחר איטום הפתח, העוברים המוזרקים מוכנסים בזהירות בחזרה לחממה. כאן אנו מראים את התמונות המייצגות של עוברי עוף לאחר ההזרקה.
התמונה הראשונה מראה את התוצאה של הזרקת פלסמיד lentivirus. הפלואורסצנציה הירוקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי מצביעה על ביטוי מוצלח של פלסמיד מוזרק בעוברים. זה מצביע על ההיתכנות של הזרקה תוך-וסקולרית של פלסמידים לעוברי עוף.
התמונה השנייה מציגה את התוצאות של הזרקת PGC. המחשבים האישיים סומנו עם RFP. בתמונה זו יכולנו לראות את המחשבים המוזרקים שהם הנקודות האדומות כאן, הממוקמים בגונד של המקבלים.
עובדה זו מצביעה על כך שמחשבי ה-PGCs של התורמים הצליחו להיכנס ולהתיישב בגונד של המקבלים ביעילות. לסיכום, פרוטוקול זה מציג את התהליך של הזרקה תוך-וסקולרית in-ovo של חומרים אקסוגניים, פלסמידים או מחשבים אישיים לעוברי עוף. השיטה המוצגת כאן קלה למעקב ולמידה ושווה את היישום בתחומים רבים.
זה כל מה שאני רוצה לשתף אתכם בו. אני מקווה שגישה זו תקל על עבודתך ככלי מחקרי רב עוצמה בקביעת עוברי עוף וביולוגיה התפתחותית. תודה שצפית בסרטון זה ובהצלחה עם המחקר שלך.
