פרוטוקול זה ידגים כיצד ניתן לזרוע תאי גזע פלוריפוטנטיים מובחנים על איבר על שבב כדי ליצור מחסום דם-מוח מיקרופלואידי אנושי לחלוטין, מותאם אישית, שניתן להשתמש בו כדי לחזות חרניות תרופה של מערכת העצבים המרכזית וללמוד הפרעות נוירולוגיות. באמצעות איבר על שבב הזמין מסחרית, אנו נדגים כיצד כל מעבדה מוכוונת ביולוגית יכולה להשתמש בטכנולוגיה זו כדי ליצור מחסום דם-מוח מיקרופלואידי מותאם אישית. הצטברות ראיות עולה כי BBB ממלא תפקיד במחלה נוירולוגית על ידי יצירת שבבי BBB מותאמים אישית הנגזרים iPSCs של אנשים עם מחלה נוירולוגית גנטית.
ניתן יהיה ללמוד את תפקידו של BBB בבריאות ומחלות. שיטה זו יכולה גם להיות שימושית עבור חברות פארמה, אשר יכול להשתמש בפלטפורמת BBB אנושית זו כדי לסנן את החדירה של תרופות נוירולוגיות מועמד לתוך המוח האנושי. היישום של טכנולוגיות איברים על שבב דורש בדרך כלל מיומנויות הנדסיות מיוחדות.
שימוש בפלטפורמות מסחריות מאפשרות יישום של טכנולוגיה זו בכל מעבדה מוכוונת ביולוגית. כדי להתחיל, להביא את המנה המכילה את השבבים מוכנים לארון biosafety. באמצעות פיפטה P200, בעדינות לשטוף את שני הערוצים על ידי הוספת 200 microliters של מדיום התברואה עצבית לתוך התוך התוך ומשיכת הנוזל מהשקע.
הימנעות ממגע עם היציאות, שאף בזהירות טיפות מדיה עודפות מפני השטח של השבב. בעדינות להתסיס את ההשעיה התא כדי להבטיח השעיית תא הומוגני. כדי לזרוע את תאי הצאצא העצביים שמקורם ב- iPSC לתוך הערוץ העליון כדי ליצור את צד המוח, הוסף קצה P200 המכיל 30 עד 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים בריכוז של פי 10 עד ששת התאים למיליליטר לתוך עמוד הערוץ העליון, ושחרר בעדינות את הקצה מהפיגט.
קח פיפטה P200 ריקה, לדכא את הבוכנה, להכניס לשקע הערוץ העליון, בזהירות למשוך את ההשעיה תא יחיד דרך הקצה. העבר את השבב למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה ואת ההתפלגות ההומוגנית של תאים בתוך הערוץ העליון. לאחר אישור צפיפות התא בכיסוי של 20%, הנח מיד את השבבים באינקובטור למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לשטוף את התאים כי לא לצרף על ידי הוספת מדיום התברואה עצבית טרי לתוך שקע מושך את הנוזל באמצעות פיפטה מן השקע. שמור על התאים בתנאים סטטיים ב 37 מעלות צלזיוס עם החלפה בינונית התברואה עצבית יומית. לאחר iNPCs מחוברים או ביום שלאחר מכן לאחר הזריעה, להביא את המנה המכילה את השבבים מוכנים לארון biosafety.
לשטוף בעדינות את הערוץ התחתון עם 200 microliters של מדיום תא אנדותל. הימנעות ממגע עם היציאות, בזהירות שאפו טיפות של מדיום תא אנדותל עודף מפני השטח של השבב, הקפדה להשאיר בינוני בשני הערוצים. בעדינות להתסיס את ההשעיה התא כדי להבטיח השעיית תא הומוגני.
באמצעות פיפטה P200, לצייר עד 30 עד 100 microliters של ה-iPSC נגזר המוח microvascular ההשעיה תא אנדותל בריכוז של 14 עד 20 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר, ולמקם את הקצה לתוך המפרצון הערוץ התחתון. הצעד הקריטי ביותר להשגת תכונות מחסום תפקודי הוא זריעת תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח. זה חיוני לתאי זרעים בצפיפות נאותה כדי למנוע היווצרות בועה כדי לאמת הפצה הומוגנית בתוך שבב האיבר.
לדכא את הבוכנה על פיפטה P200 עם קצה ריק, להכניס לשקע הערוץ התחתון, ולאט לאט לשחרר את הבוכנה פיפטה למשוך בזהירות את ההשעיה תא יחיד דרך הערוץ התחתון. שאף את ההשעיה העודפת של התא מפני השטח של השבב. הימנע ממגע ישיר עם יציאות השקע והשקע כדי להבטיח שאף מתלה תא לא ישאף לצאת מהערוצים.
מעבירים את השבב למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה. הערוץ התחתון מלא בתאים ללא פערים ניתנים לצפייה ביניהם. לאחר אישור צפיפות התאים הנכונה, זרע את התאים בשבבים הנותרים.
כדי לחבר את התאים אל הממברנה הנקבובית, הממוקמת על גבי התעלה התחתונה, להפוך כל שבב, ולתת להם לנוח בעריסה שבב. מניחים מאגר קטן המכיל DPBS סטרילי בתוך צלחת 150 מילימטר כדי לספק לחות לתאים. דגירה השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשלוש שעות או עד תאים בערוץ התחתון מחוברים.
לאחר שתאי ה אנדותל המיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב- iPSC מחוברים, הופכים את השבבים בחזרה למצב זקוף כדי לאפשר חיבור תא לחלק התחתון של הערוץ התחתון. 48 שעות לאחר הזריעה של תאי הדם המיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב- iPSC, לצייד את הטמפרטורה של מדיום התא ה אנדותל על ידי התחממות באמבט מים צלזיוס 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר מכן, degas המדיום על ידי דגירה תחת מערכת סינון מונחה ואקום במשך 15 דקות.
לאחר מכן, חטא את החלק החיצוני של האריזה והמגשים הניידים עם 70% אתנול, נגב והעבר אותם לארון ה-biosafety. פתח את החבילה, והצב את המודולים במגש כוון אותם עם המאגרים לכיוון החלק האחורי של המגש. פיפטה שלושה מיליליטר של המדיה החמה והמנויידת מראש לכל מאגר פנימה.
הוסף מדיום תרבות תא אנדותל למאגר inlet של הערוץ התחתון ואת מדיום ההתברמות העצבית למאגר הערוצים העליון של הערוץ העליון. לאחר מכן, פיפטה 300 מיקרוליטרים של המדיה החמה והמתואם מראש לכל מאגר שקע, ישירות מעל כל יציאת מוצא. מקם עד שישה מודולים ניידים על כל מגש.
הביאו מגשים לאנקובטור, והחליקו לחלוטין לתוך מודול התרבות כשידית המגש פונה כלפי חוץ. בחר והפעל את המחזור הראשי במודול התרבות. סגור את דלת החממה, ואפשר למודול התרבות לחבר את המודולים הניידים במשך כדקה.
מחזור ההקדמות יושלם כאשר שורת המצב תהיה מוכנה. מוציאים את המגש ממודודול התרבות ומביאים אותו לארון ה-biosafety. בדוק את החלק התחתון של כל מודול נייד בארון biosafety כדי לוודא כי המודולים הניידים היו בהצלחה primed.
חפש את נוכחותן של טיפות קטנות בכל ארבעת הנמלים. אם מודול נייד כלשהו אינו מציג טיפות, לחץ מחדש על המחזור הראשי במודולים אלה. אם מדיה כלשהי טפטף על המגש, המתרחש לעתים קרובות יותר על ידי יציאות היציאה, נקה את המגש עם 70%אתנול.
לאחר מכן, שטפו בעדינות את שני הערוצים של כל שבב עם מדיום תרבות חם ושורף לתאים כדי להסיר בועות אפשריות בערוץ, והצב טיפות קטנות של מדיה בחלק העליון של כל יציאה פנימה ושקע. הכנס את השבבים עם מנשאים לתוך המודולים הניידים, והצב עד שישה על כל מגש. הכנס את המגשים למודול התרבות.
תכנת את תנאי תרבות שבבי האיברים המתאימים, כגון קצב זרימה ומתיחה, במודול התרבות. ברגע מחזור לווסת הושלמה, אשר לוקח כשעתיים, התנאים מתוכנת להתחיל. לאחר מכן, מודול התרבות מתחיל לזרום בתנאי תרבות שבבי האיברים המוגדרים מראש.
אימונוציטוכימיה על שבב מחסום הדם - מוח מבוסס iPSC שבעה ימים לאחר הזריעה מראה את ספירות EZ נבדל לתוך אוכלוסיית תאים עצביים מעורבים בערוץ בצד המוח העליון, כולל S100 אסטרוציטים חיוביים בטא, נסטין חיובי תאי ניוון עצבי, כמו גם אסטרוציטים חיוביים GFAP, ובטא III טובולין חיובי נוירונים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב- IPSC שנזרעו בערוץ צד הדם התחתון הביעו GLUT-1 ו- PECAM-1. הערכה של החודרות שבב מחסום הדם - מוח מדגים כי שבב האיבר זרע עם תאי אנדותל microvascular המוח נגזר iPSC ו כדוריות EZ היה מחסום הדוק בהשוואה שבבי איברים זרע עם תאי אנדותל microvascular המוח נגזר iPSC לבד.
שבבי איברים עם כדורי EZ בלבד לא הציגו תכונות מחסום כלשהן. מטיפול פני השטח הראשוני של הערוץ למיתוג בינוני בכל יום, הימנע היווצרות בועה בערוץ. לאורך כל השלב בפרוטוקול שבו יש להכניס מדיום להפעלת פני השטח, מטריצה חוץ-תאית או מדיום המכיל תאים דרך הערוצים, חשוב מאוד לוודא בזהירות שלא נמצאה בועה.
ניתן לבצע את ההתמדה חדירה כדי להעריך את חדירת המוח האנושי של תרופות מועמדות. גישה זו יכולה לשמש לבדיקת טיפולים פוטנציאליים. היישום של שבב BBB מבוסס iPSC מאפשר ללמוד את התפקיד של BBB במחלות נוירולוגיות שונות.
בעתיד, פלטפורמה כזו עשויה להיות שימושית עבור יישומי רפואה חזויים ומותאים אישית.
