מודל מיקרופלואידי זה של סרטן על שבב שאנו מכנים מאיץ האבולוציה, מספק פלטפורמה ניתנת לשליטה למחקרים כמותיים ארוכי טווח בזמן אמת של דינמיקת סרטן בתוך תנאים סביבתיים מוגדרים היטב ברמת תא יחיד. הטכנולוגיה מאפשרת לנו לחקור את הדינמיקה האבולוציונית של סרטן תחת נוף מתח דמוי גידול. מתן מידע כולל מורפולוגיה, אוכלוסייה, תנועתיות והגירה לאורך זמן ברמה התאית.
עם היכולת לשלוט ולנטר את ההתנהגות של אוכלוסיות גידולים מעורבים תחת שיפוע מתח מבוקר היטב הטכנולוגיה שלנו עשויה להציג מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לפיתוח תרופות פרה-קליניות. ניתן ליישם את שיטת איטום הלחץ המוצגת גם במערכות מיקרופלואידיות אחרות הדורשות התאמה מתוחכמת של הרכב גז הסביבה, כמו גם את יכולת הניסוי במורד הזרם. המפתחות לביצוע ניסוי ארוך טווח בהצלחה הם להבטיח סביבה יציבה פיזית וביוכימית.
יש ל לפקח על גורמים הכוללים טמפרטורה, לחות והרכב גז בכל עת. כדי להתחיל, לפברק מחזיק צלחת כי הוא מספיק כדי להחזיק מנות תרבות חדירות גז בו זמנית על מכונת הדפסה 3D. בטל את הברגת הרכיבים של לוחית הדגימה המותאמת אישית של שלושה בארות עם מנהל התקן בורג.
יש לחטא את הרכיבים באמצעות חשיפה לקרינת UV למשך שעה אחת לפחות ולהשאיר בסביבה סטרילית. כדי להתחיל זריעת קו התא להוסיף חמישה מיליליטר של טריפסין לתוך כל PC3-Epi או PC3-EMT תא תרבות צלחת 10 ס"מ ולהפעיל את טריפסיניזציה במשך חמש דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את התאים ממנות התרבות לצינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 150 פעמים g במשך שלוש דקות.
השלך את העל-טבעי. להשעות מחדש כל כדורי התא בצינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר לספור את התאים של כל PC3-MP או PC3-EMT באמצעות hemocytometer. לבודד סך של 2.5 פעמים 10 לארבעה מכל סוג תא.
ערבבו את שני סוגי התאים המבודדים והוסיפו שני מיליליטר של מדיית תרבות. זרע שני מיליליטר של תרבות התא לתוך כל אחד משלוש מנות התרבות חדיר גז. השאירו את הגז חדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה לתאים לצרף.
יש לחטא את התקני ה-PDMS באמצעות חשיפה לקרינת UV למשך שעה אחת לפחות ולהשאירם בסביבה סטרילית. עכשיו להקים מערכת אספקת גז המורכבת הן פחמן דו חמצני ויחידות בקרת חמצן, משאבת גז, תא ערבוב גז, מכשיר אדים או בועה, ושלוש קבוצות נפרדות של שסתומי גז, ומדי לחץ. לחלופין, השתמש במערכת אספקת גז המספקת מצב נורמוקסיה.
ודאו שהלחות היחסית בתא הערבוב גדלה אל מעל 85% הקימו יחידת בקרה תרמית של דגירה על הבמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תת-יחידות חימום נפרדות למכסה ולצלחת התחתונה. למחרת מוציאים את מנות התרבות חדירות הגז מהחממה ומזהים שהרכיבים המפורטים מסודרים, בכל באר יש מחזיק צלחת תרבות חדירה לגז, מחזיק שבב PDMS, מחזיק חלון זכוכית וזוג חלונות זכוכית ברוחב 35 מיליליטר. השתמש בברגים המותאמים להרכבת רכיבים אלה ולהדק את צלחת התרבות חדירה גז.
לאחר מכן מעבירים את מדיום התרבות החם לתא ואקום כדי לבטל את הגז למשך 20 דקות. לטפל בשבב PDMS במערכת פלזמה חמצן במשך 30 שניות על מנת לשמור על הידרופיליות. העומס הבא שני מזרקים לאט עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה de-gassed ושני מזרקים אחרים עם 10 מיליליטר של reagent הרצוי דה גז של עניין.
לדוגמה תקשורת ומדיה עם סמים. חבר כל מזרק בודדים צינורות 50 ס"מ על ידי מחט מחלק מד 23 לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלולה לקצה השני של הצינור.
דחוף את המדיה לתוך הצינור כדי להפוך את הצינורות ולהכניס את סיכת הפלדה לתוך כל שבב PDMS דרך שכבת המכסה. מלאו את שכבת המאגר והרטיבו את שכבת דוגמת המילוי של PDMS במדיה. שכבת המאגר פועלת כמלכודת בועות על השבב כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לתבנית המיקרופלואידית.
ואז לטעון מזרק מיליליטר אחד עם מדיה תרבותית. חבר את המזרק צינורות חמישה סנטימטרים על ידי מחט חלוקת מד 23 לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלולה לקצה השני של הצינור וראש הצינור.
הכנס את סיכת הפלדה החלולה לתוך החור המרכזי של השבב כדי שמדיה מוגזמת תחולץ מאוחר יותר. לטעון שני מזרקים 10 מיליליטר לכל שבב בסיפון הקדמי ולמקום את שני המזרקים האחרים בסיפון הנסיגה של מערכת המזרק. על מנת למנוע מלכודת microbubbles בתבנית microfluidic, לחלק מיליליטר אחד של התקשורת מחומם מראש de-gassed לתוך צלחת תרבות חדיר גז עמוק 35 מיליליטר.
מקם את השבבים ישירות על גבי קרום התרבות חדיר הגז, שבו השבב מתקרב למשטח הנוזלי עם זווית הטיה של 15 מעלות. מהדקים את שבב ה-PDMS עם מחזיק השבבים PDMS ודוחפים את התקן ה-PDMS כלפי מטה. קלטת גיליון של איטום על גבי התקן PDMS ומהדק עם מחזיק שבב PDMS, על מנת למנוע את השבב להתייבש.
הגדר את קצב זרימת המדיה סביב המערך ל- 20 מיקרוליטר לשעה. מקם את הצלחת כולה באינקובטור על הבמה על הבמה המונעת של מיקרוסקופ הפוך. חבר את מערכת אספקת הגז לערוצי הגז באמצעות צינורות גז ושמור על לחץ המד ב 0.2 PSI.
פעולה זו לוחצת על קרום התרבות חדיר גז נגד שבב PDMS מותקן כדי להבטיח איטום של המכשיר. לאט לחלץ מדיה מוגזמת בשבב באמצעות מזרק מיליליטר אחד מהחור המרכזי. שימו לב לשבב מתחת למיקרוסקופ תוך כדי חילוץ מדיה ולאחר מכן הפסיקו לחלץ כשהשבב אטום.
חבר את יחידת חישת הטמפרטורה של החממה על הבמה לצלחת שלוש בארות ולהגדיר 37 מעלות צלזיוס. במחקר זה PC3 מתורבת במאיץ אבולוציה ללא נוכחות של מתח חיצוני היו עקומות צמיחה בעוד מיושר. מציע את הזהות של פרופיל התפשטות התא כפונקציה של מיקום על פני השבב.
השיפוע הראשוני של העקומות חושף את שיעור ההתפשטות. זמן ההכפלה עבור תאים בהתקן הוא כ- 24 שעות. GFP המביעים PC3-EMT ו mCherry המביעים תא PC3-Epi מרופד היו מתורבתים במשותף במאיץ האבולוציה.
החל מ-40% מהתרבות גדלה הקובולטורה ב-40% בתוך שלושה ימים. בעוד עקומת הצמיחה של ההתכנסות הכוללת היא בצורה של מודל צמיחה לוגיסטי. האוכלוסייה של PC3-EMT המשיכה להתרחב ו-PC3-Epi דוכא בשלב האסימפטוטי.
תאי PC3-Epi ו-PC3-EMT ישבו בצפיפות במרכז המכשיר והורשו לנדוד בחופשיות לכיוון האזור הריק. ההיסטוגרמה מנורמל של המהירות של שני פנוטיפים מראה את המהירות של PC3-EMT היה גבוה באופן משמעותי מאשר PC3-Epi על ידי גורם של 1.8 פעמים. חשוב מאוד להימנע מיצירת microbubbles בכל מחיר בעוד התקשורת התרבותית צריכה להיות מחוממת מראש de-gassed.
השבב PDMS צריך להיות רטוב כראוי ומטופל בעדינות. בשל האופי הרך שניתן לאטום מחדש של שיטת איטום הלחץ שלנו, ניסויים רבים במורד הזרם יכולים להיות מעוצבים מראש. כגון מיצוי אוכלוסייה תת-קליני, ניתוח מטבוליטים מקומי, ושפע חיסוני ותרשים שנפתרו באופן מרחבי.
הטכנולוגיה שלנו מדגימה דרך לשכפל רכיבים ואינטראקציות מרכזיים בסביבת סופר מיקרו מורכבת באופן מקיף. עם זאת, פשוט מספיק כדי לספק נתונים כמותיים, אמינים ובלתי ניתנים לשחזור.
