הכבד הוא האיבר הגדול ביותר ביונקים. זה ממלא תפקיד חשוב מאוד בחילוף החומרים וניקוי רעלים. למרות הכבד יש יכולות התחדשות יוצאת דופן במבחנה, זה עדיין אתגר גדול מאוד לטווח ארוך לתרבות hepatocyte in-vitro.
כאן, אנו מקימים את האורגנוידים של הפטוציטים מהפטוציטים בוגרים. זה שומר על התכונות העיקריות של hepatocytes במורפולוגיה ותפקוד. בסרטון זה, נציג כיצד לתרבות ומעבר האורגנוידים האלה וכיצד לבצע את השינוי הגנטי של organoids אלה בפרטים.
ראשית, זלוף בכבד ועיכול. הכן את כל האזורים ואת המכשירים ולהפוך אותם סטריליים. לשטוף את העכבר ולפתוח את האפידרמיס ואת העור, ולאחר מכן לנסות למצוא את תנור הכיס של הכבד.
להזריק את המחטים לתוכו, ולאחר מכן ללכוד את זה. האם זלוף במהירות של חמישה מיליליטר לדקה, עד הכבד הופך חיוור. לשנות אותם לתוך חוצץ זלוף, למקם בזהירות, לצפות בכבד, עד שהוא הופך רך.
בדרך כלל זה לוקח שלוש עד חמש דקות, ואז לחתוך את הכבד ולשים אותם לתוך הצלחות, ולחתוך אותם לחתיכות קטנות עם המספריים. פפ זה למעלה ולמטה לעתים קרובות. בדרך כלל, זה לוקח 10 עד 15 דקות כדי להפוך אותם לתא יחיד.
ואז להקפיץ אותו למעלה ולמטה עם 10 עד 15 דקות ולהאכיל אותם דרך הכושר. הפוך אותם לתאים בודדים. לאסוף את כל התאים בצינור 50 מיליליטר, ו צנטריפוגות אותם, עם המהירות ולאחר מכן לאסוף את כל לוחות לכל.
נסה לשמור אותם תמיד בקרח הקר. הפוך את ההשעיות של התא הבודד וספור אותן עם מונה התאים. בדרך כלל הפטוציטים אם מאושרים, יש לו פלואורסצנטי תוסס.
בחלק השני, אנחנו מנסים להושיב את התאים ולעשות את התרבות האורגנוידת. אנחנו אוספים את כל ההשעיות של התאים, וסופרים את התאים עם קונצ'רו-היתוך מסוים ואז אנחנו מערבבים את. מטרוגלס. ואת מדיום הקוד.
בדרך כלל אנחנו לוקחים, עם הבינוני ואת metrogels, ביחס של 1 עד 2 או 1 עד 3. לאחר ערבוב בזהירות אותם, אנחנו מושיבים אותם על לוחות הדרגתיים. אנחנו בדרך כלל מוסיפים 100 מיקרוליטרים בצלחת 24 היטב.
שים אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות. אחרי 20 דקות, שמנו אותם הפוך קדימה עם התחתון בתחתית ולאחר מכן במדיום. עם יומיים או שלושה נגד, אנחנו בדרך כלל רואים את organoids לצאת.
זוהי התמונה הטיפוסית של האורגנוידים שלנו. אנחנו בדרך כלל צריכים תאים בודדים מאורגנואידים אם אנחנו רוצים לעשות את המעבר או לעשות איזו שיטת שינוי גנטי אנחנו אוספים את כל האורגנוידים מלוחות הנגד עם חיץ שטיפת המעיל. אנחנו זורקים את supernatant, אז על חוצץ לשטוף מעיל לתוך הצלחת, לערבב אותם, כך עידוד זה למעלה ולמטה.
ואז אנחנו בדרך כלל שוטפים מראש את כל הטיפים עם חיץ קלטות הכביסה. כדי למנוע את כל organoids טיפ על הטיפים. ואז עם, אצווה חדשה על קרח או בלעדיו, אנחנו אוספים את כל האורגנוידים על ידי היתוך סנטרו.
אנחנו מטפלים בהם, יש ראדיאנטים מרמה כדי להסיר את כל metrogels. לאחר 20 עד 30 דקות של דגירה על קרח כל המטרוגלים מוסרים. אנו אוספים את כל האורגנוידים הנקיים ומוסיפים טריפסין כדי להפוך אותם לתאים בודדים.
לאחר טריפסין מתווסף, אנו מטפלים organoids לתוך האינקובטור. זה לוקח 5 עד 10 דקות עבור organoids הכבד להיות תאים בודדים. אנו מוסיפים עוד מאגרי כביסה כדי לעצור את הטריפלטין.
ואז להקפיך את זה למעלה ולמטה לכיוונם. עבור תהליך אפשרות, אתה יכול לשטוף אותם עוד פעם אחת כדי להסיר את כל טריפסין. לאחר שטיפה על ידי צנטריופוזיה, אנחנו יכולים לספור אותם מתחת לדלפק התא.
אז נראה איך לעשות עסקה או טרנספקטציה של האורגנוידים האלה. ראשית, לתייג את הצינורות של מה שאתה תעשה, ולאחר מכן נעשה את transfection הראייה על פי הוראות היצרן. אתה צריך, העוצר של עובדת ליפויל אילוף INI MaX.
אנחנו מוסיפים את. לשלוט ואת siRNA הגן הספציפי, ולדגירה אותם עם האופטימלי, על פי הוראות היצרן. ואז על פי ריכוז התא אנו מוסיפים את מקס RAN ומערבבים אותם ביסודיות.
לאחר מכן אנו מוסיפים גם את מקס RAN עם האופטימלי בנפרד ולשים אותם על קרח. לאחר 5 דקות, אנו ממרחים תערובת מקסימום RAN נפרדת עם siRNAs שונים, גן ספציפי RANi ו- II לשלוט בנפרד ומערבבים אותם ביסודיות. שים אותם על קרח שוב, ואז אנחנו אוספים את כל organoids, centrofusion איטי, טיפת כל supernatant, אנו מוסיפים את מקסימום RNAi, תערובת siRNA לתוך צלחת תא זה ולעודד אותו למעלה ולמטה ביסודיות.
בקצרה, התאים ואת התווית RNAi מקסימום תערובת siRNA היו ג'נטריפיקציה ודגרה במשך 4 עד 5 שעות ב 37 מעלות. בחלק האחרון, אורגנוידים הפטוציטים אלה יכולים גם להיות נגועים על ידי וירוס לנטי. הודעה דומה בוצעה כתמרת siRNA.
הבקרה וצינורות וירוס siRNA היו מוכנים היטב, ואת האופטימום נוספה על פי הוראות היצרן. ואז עם אזורי הזיהום כמו פולי גרין ואז אנחנו מוסיפים וירוס לנטי שונה, על פי חוקת הוראות היצרן. שלב את ההשעיות של תא בודד בתרבות האורגנוידים וחלקיקים שונים בצינורות אפנדורף 1.5 מיליליטר, הוסף, טוב, לערבב אותם צלחת תערובת זו, ולרכז אותם במשך שעה אחת ב 32 מעלות.
היתוך הריכוז יבוצע ב 500 G.ואחרי 4 עד 5 שעות דגירה ב 37 מעלות מתלה התא ייאסף לאחר מכן ויושב metrogel. ולשים אותם לתוך האינקובטור שוב. האיבר על יעילות היווצרות או ניתוח פונקציונלי אחר יכול להתבצע 7 עד 10 ימים מאוחר יותר.
הנה התוצאות הייצוגיות שלנו. באיור 1A, אתה יכול לראות ALB-Cre Rosa שלנו 26-GFP או RFP hepatocytes organoid מעכבר. באיור 1B ניתן היה לראות את האות החיובי של Ki67 בהכתמה, אשר הראה כי האורגנוידים ההפטוציטים שלנו מתרבים.
באיור 2A ו-2B הנה ביטוי ייצוגי של הביטוי המפריע שלנו לגנים שלנו. לאחר מניפולציה גנטית באורגנוידים hepatocytes, יעיל מפריע הוא יעיל מאוד. הנה איור 2C, אתה יכול לראות לאחר מניפולציה גנטית עם טכנולוגיית קרסונייט באורגנוידים המוריניים שלנו.
מסקנה, התוצאות שלנו הראו את האורגנוידים hepatocytes ניתן להרחיב במבחנה ומניפולציה גנטית. לסיכום, בסרטון זה אנו מראים כיצד לעשות את זלוף הכבד ועיכול כדי לקבל את hepatocytes. כיצד ללכוד את ההפטוציטים ולעבר את האורגנוידים של הפטוציטים.
כמו כן, הראינו כיצד לעשות את siRNA ו transfection וקטור או זיהום וירוס לנטי לעשות את השינוי הגנטי של organoids אלה. כמו כן, יש לנו שני מחסור באורגנוידים שלנו. ראשית, לא השתמשנו בליבת ליבה או בליבת פרווה כדי טהור את ההפטוציטים.
ושנית, אני חושב שיש לנסות יותר גורמי גדילה ואיתות כדי לשפר את זמן הגידול של האורגנוידים.
