This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.

<ol>
	<li>Wiberg, M., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+it+be+possible+to+produce+peripheral+nerves.">Will it be possible to produce peripheral nerves.</a> Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).</li><li>Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+and+basic+science+review:+past,+present,+and+future+of+nerve+repair.">Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair.</a> J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).</li><li>Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+for+return+to+work+in+patients+with+median+and+ulnar+nerve+injuries.">Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries.</a> J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).</li><li>Geuna, S., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).</li><li>Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+differentiate+into+a+Schwann+cell+phenotype+and+promote+neurite+outgrowth+in+vitro.">Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro.</a> Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).</li><li>Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+and+regeneration+of+the+peripheral+nervous+system:+From+Augustus+Waller&#8217;s+observations+to+neuroinflammation.">Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller&#8217;s observations to neuroinflammation.</a> J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).</li><li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering:+strategies+for+repair+and+regeneration.">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).</li><li>Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+repair+of+peripheral+nerves.">Regeneration and repair of peripheral nerves.</a> Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).</li><li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+dorsal+root+ganglia+neurons+purification+with+a+one-time+anti-mitotic+reagent+treatment.">An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment.</a> PloS One. 8 (4), e60558 (2013).</li><li>Stettner, M., Wolffram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+in+vitro+model+for+studying+peripheral+nerve+myelination+in+mouse.">A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse.</a> J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).</li><li>Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+and+neuron+co-cultures+for+the+study+of+nerve+regeneration.">Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration.</a> Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).</li><li>Nissinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies.">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li><li>Lewallen, K. a., Aa Shen, Y. -., De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+role+of+the+cadherin/catenin+complex+at+the+Schwann+cell-axon+interface+and+in+the+initiation+of+myelination.">Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination.</a> J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).</li><li>Evans, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+to+nerve+regeneration.">Challenges to nerve regeneration.</a> Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).</li><li>Webber, C., Zochodne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nerve+regenerative+microenvironment:+early+behavior+and+partnership+of+axons+and+Schwann+cells.">The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells.</a> Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).</li><li>Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+current+findings+and+future+persperctives.">Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives.</a> Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).</li><li>Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+and+nerve+regeneration:+promises+and+pitfalls.">Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls.</a> Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).</li><li>Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li><li>Xu, Y., Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin-forming+ability+of+Schwann+cell-like+cells+induced+from+rat+adipose-derived+stem+cells+in+vitro.">Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro.</a> Brain Res. 1239, 49-55 (2008).</li><li>Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells:+implications+for+cell-based+transplantation+therapy.">Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy.</a> Neuroscience. 236, 55-65 (2013).</li><li>Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+secrete+neurotrophic+factors.">Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors.</a> Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).</li><li>Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+enhance+peripheral+nerve+regeneration.">Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).</li><li>Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+regeneration+of+peripheral+nerves+through+bioengineered+nerve+grafts.">Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts.</a> Neuroscience. 181, 278-291 (2011).</li><li>Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+decellularized+allogeneic+artery+conduits+with+autologous+transdifferentiated+adipose-derived+stem+cells+for+facial+nerve+regeneration+in+rats.">Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).</li><li>Zhang, Y., Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nerve+graft+constructed+with+xenogeneic+acellular+nerve+matrix+and+autologous+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).</li><li>Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+adipose+tissue+engineering.">Stem cells and adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).</li><li>Bottenstein, J. E., Sato, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+rat+neuroblastoma+cell+line+in+serum-free+supplemented+medium.">Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).</li><li>Mantovani, C., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+molecular+and+functional+differences+of+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+stem+cells+isolated+from+rats+of+different+ages.">Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages.</a> Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).</li><li>Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+adipose-derived+stem+cells+act+synergistically+with+RGD-modi+fi+ed+surfaces+to+improve+neurite+outgrowth+in+a+co-culture+model.">Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Molecules+Enhance+the+Neurotrophic+Effect+of+Schwann+Cell-Like+Differentiated.">Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated.</a> Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).</li><li>Fudge, N. J., Mearow, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-associated+gene+expression+in+adult+sensory+neuron+populations+cultured+on+a+laminin+substrate.">Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate.</a> BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).</li><li>Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+rigidity+and+ligand+density+influence+neuronal+response+in+methylcellulose-laminin+hydrogels.">Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels.</a> Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).</li><li>Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21:+Use+of+stem+cells+for+improving+nerve+regeneration.">Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration.</a> Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).</li><li>Richardson, J. a., Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+dorsal+root+ganglion+neurites+and+Schwann+cells+by+isolated+Schwann+cell+topography+on+poly(dimethyl+siloxane)+conduits+and+films.">Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).</li><li>Seggio, a. M., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-aligned+Schwann+cell+monolayers+demonstrate+an+inherent+ability+to+direct+neurite+outgrowth.">Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth.</a> J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).</li><li>Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+polycaprolactone+films+via+surface-initiated+atom+transfer+radical+polymerization+for+covalently+coupling+cell-adhesive+biomolecules.">Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules.</a> Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).</li><li>Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+molecules+mediate+both+Schwann+cell+proliferation+and+activation+to+enhance+neurite+outgrowth.">ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).</li></ol>

The authors confirm that there are no conflicts of interest associated with this publication.

הנוירונים DRG משמשים לעתים קרובות בין תאים עצביים לתרבות העיקרית ללמוד את ההתחדשות של תאי עצב לאחר axotomy in vivo. הנה פרוטוקול מדויק לקציר DRG מחולדות מבוגרות מוצג, אשר נועד להקטין את האוכלוסייה של תאי לווין בסביבה מבלי להתפשר על ההישרדות העצבית. כASC המובחן לפנוטיפ כמו SC-הן אלטרנטיבה חוקית לSC לטיפולים בתאים, מערכת שיתוף תרבות ASC / DRG כמו SC-גם תוארה בפירוט. זה ידוע שlaminin (או נגזר laminin רצפי פפטיד) שיש לו השפעה חיובית על הישרדות נוירון והיווצרות neurite 31-33. בעת ביצוע תרבויות נוירון DRG מומלץ לכן למעייל בעבר כל מצע עם laminin כדי להימנע מכל אובדן פונקציונלי של התאים עצביים. הרעיון של ציפוי laminin חל גם על מצעים ביולוגי לעיצובמבני הנדסת רקמות, כגון פולי - caprolactone (PCL) משמשים לעתים קרובות לייצור של צינורות עצב 30. כמו כן, העבודה קודמת הראתה כי מטריצות הפיברין הן חומרים המתאימים לתרבויות עצביות בתלת ממד 11. בנוסף לציפוי חלבון, מודלים שיתוף התרבות לספק תנאים חשובים להישרדות תא עצב DRG וסביבה מתאימה ללמוד את יחסי הגומלין המתרחשים בין תאי עצב וSC במערכת העצבים ההיקפית בעקבות פציעה. יכולים גם להיות מושתלים תאים in vivo על ידי שימוש במכשירים עצביים כדי לקצר את זמן הגיוס של תאי אוטולוגי באתר הפציעה. הדבר חשוב במיוחד בפציעות קשות, אשר יכול להוביל להזדקנות תא / מוות וניוון שרירים. למרות SC הם תאי גליה החשובים ביותר המעורבים בתהליך של התחדשות היקפית עצב וmyelination, זמינות המוגבלת שלהם וקצב ההתפשטות האיטי שלהם הופך אותם לבלתי מתאיםעבור יישומי הנדסת רקמות 34. ASC הוא אלטרנטיבה חוקית בשל השפע והיכולת להתמיין לפנוטיפ SC, המבטא סמני גליה ספציפיים ומראה דמיון פונקציונלי לSC יליד 19. ASC הוא גם מסוגל לייצר חלבונים וצמיחת גורמי 5 שיכולים להיות מועיל להיווצרות והארכת neurites ידי נוירונים DRG במערכת שיתוף תרבות. עם זאת, ניתן להגדיר שתי מערכות שיתוף תרבות שונה כפונקציה של צרכי הניסוי. השיטה המוצעת במאמר זה היא גרסה מתוקנת של פרוטוקול מבוסס היטב במעבדה שלנו 11 והוא כרוך במגע ישיר בין שני סוגי התאים (שיתוף תרבות ישירה), שבו הסוג השני תא (תאי עצב DRG) הם זורעים בחלק העליון של אחרים (ASC כמו SC-). גישה זו מבוססת על ממצאים קודמים שהראו את החשיבות של הנוכחות של שכבת תאי גלייה על המצע כאשר זריעת תרבויות עצביות 35 <sup&gt; - 37. השפעה זו היא כנראה עקב תאי תאי אינטראקציות דרך integrins DRG ומולקולות ECM הופקדו מASC ורמזים אחרים על פני השטח של תאי גזע. כמו כן, ציין כי הפחתה של סרום חלבון במדיום הפחיתה את ההתפשטות של זיהום תאי לווין שיכול לנבוע מהניתוק של נוירונים DRG, מבלי להשפיע על פונקציות ASC. עם זאת, תאי לווין, כולל אוכלוסייה קטנה של SC, קשה לחסל לחלוטין מתרבויות של נוירונים DRG וכמה תאים שנותרו גם יהיה נוכח במערכת שיתוף התרבות. לכן חשוב לציין כי תת-אוכלוסיות הקטנות אלה יכולים גם להשתתף בתהליכי myelination במהלך לימודים במבחנה, ונזכרו תאי אוטולוגי שנמצאים in vivo לאחר פציעה. הגישה השנייה (לא מוצג כאן) כרוכה בשימוש בתרבות מוסיף תא, הימנעות מגע ישיר בין שני סוגי התאים שונים (שיתוף תרבות עקיפה). Howevאה, זה לא נציג של תנאי in vivo במהלך רגנרציה עצב (היכולת המופחתת של תאים עצביים לפתח neurites הארוכה), אבל הוא משמש כדי לחקור את ההשפעה של גורמי diffusible שוחררו במדיום על ידי אוכלוסיית תא מסוימת על 38 האחרים .

פציעות עצבים היקפיים נפוצות עם כ -9,000 מקרים בבריטניה המתרחשים בכל שנה בעיקרה צעיר ואוכלוסייה עובד 1. למרות טכניקות תיקון עצב מייקרו, שיקום רגיל של פונקציה הוא בלתי ניתן להשגה עם תוצאת יד תחושה לקויה, תפקוד מוטורי מופחת וכאב תכוף וחוסר סובלנות קרה 2. יש להם פציעות כגון השפעה עמוקה וקבועה על המטופל ועל יכולתן לבצע פעולות יומיומיות, עם פחות מ -60% חוזרים לעבודה 3. בעקבות פציעה, פנוטיפ והמורפולוגיה של תאי עצב ותאי שוואן שינוי (SC) על מנת ליצור סביבה מתאימה שתאפשר נביטת האקסון. במקרה של חיתוך רוחב, העצב מחולק להפרוקסימלי וגדמי דיסטלי; להיות הנקודה שממנה את תהליך ההתחדשות מתרחש, תוך הגדם הדיסטלי הגדם הפרוקסימלי עובר ניוון Wallerian ואז ניתק SCמהאקסונים נפצעו, דה-להבדיל ולהתרבות. זה הוא יסוד לכיוון הסרת המיאלין פסולת והכנת הגדם הדיסטלי ל4,5 מחדש דור עצב. ההנבטה אקסון נתמכת על ידי הייצור של גורמי neurotrophic וכמוקינים שפורסמו על ידי SC בגדם הדיסטלי, ומונחה על ידי lamina הבסיס נשאר מאחור הבא ניוון Wallerian 6,7. SC ליישר לצד האקסון ההתחדשות להרכיב הלהקות של Büngner, אשר מסייע צמיחת האקסון לאיבר המטרה, הפחתת ההסתעפות מחוץ לצינור endoneurial. בעקבות reinnervation, SC מהווה את מעטפת המיאלין החדשה עוטפת את האקסונים מחדש, אבל תפקוד חושי ומוטורי הוא רק החזיר 8 באופן חלקי. גרעיני שורש הגבי (DRG) הם מבנים הממוקמים בforamina חולייתי בעמוד השדרה, המכילים את התאים עצביים התחושתיים innervating האיברים ההיקפיים. כאשר ניתק, הם יכולים לשמש כמתאימים במבחנה modאל לחקר התחדשות עצב 9-11, כוללים חקירות של היווצרות המיאלין. בפרט, הנוירונים DRG המבוגרים לחקות את מאפייני in vivo של תאים אלה ולספק כלי אימתני ללמוד אסטרטגיות חדשות לתיקון עצב היקפי בהנדסת רקמות. שיתוף תרבויות מייצגות מערכת דינמית המדמה במבחנה הגומלין של שני (או יותר) סוגי תאים בסביבה מסוימת in vivo. אחד היתרונות של דגמי שיתוף תרבות תאים אלה הוא הגמישות ושליטה גבוהה שיכול להיות שהופעלה על הסביבה תאית. הנוירונים DRG היו בשימוש לעתים קרובות במערכות שיתוף תרבות עם SC לחקות את האינטראקציות המתרחשות בפועל בין שני סוגי התאים במערכת העצבים ההיקפית 10,12 - 14. זה היה הראה כי SC להפריש מטריצה ​​תאית (ECM) חלבונים וגורמי גדילה שיכולה לשפר פלאיםהיכולת של נוירונים DRG לשרוד ולנבוט neurites 15,16. עם זאת, SC דורש תקופות ארוכות של זמן להתרבות ו, למרות ההתקדמות בטכניקת תרבית תאים, זה עדיין קשה כדי ליצור מספר מתאים של תאים עבור יישומי הנדסת רקמות. בנוסף, את ההקרבה של עצב בריא מתחייבת למסוק SC אוטולוגי. לכן, ההבדל בSC המקור חשוב לשניהם הנדסת הרקמות ובבדיקת מבחנה של תאי עצב חדש. בתצוגה זו, ASC יכול להיחשב חלופה רבת ערך לפיתוח מבנה רקמות מהונדסות כדי לשמש ל17,18 תיקון עצב ההיקפי. עבודה קודמת הוכיחה את יכולתם של התאים להתמיין לASC כמו SC-, להביע גליה-סמנים אופייניים, כגון S-100, p75 וחלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) 19, כמו גם את חלבון המיאלין אפס (P0) 20 . הפרשת גורמי גדילת גליה, כגון גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), גורם גדילה עצבית (NGF) וגורם שמקורן בתאים גליה neurotrophic (GDNF) נצפו גם 21,22. לכן, ASC כמו SC-יכול לשמש כאמרגן של התחדשות עצבים היקפית, כפי שהודגם על ידי שני במבחנת in vivo לומד 23-26. בנוסף, ניתן לקצור ASC באמצעות הליכים מינימאלי פולשנית במספר גבוה יותר בהשוואה לסוגים אחרים של תאי גזע; התדירות של תאי גזע ברקמת שומן היא 100 עד 1,000 גבוה פי יותר מאשר במח עצם 27, ויש להם שיעור ריבוי גבוה יותר בהשוואה לתאי גזע mesenchymal SC ומח עצם. עבודה זו נועדה לספק פרוטוקול מפורט לביצוע קציר יעיל גבוה של נוירונים DRG ניתקו וASC בהתאמה, האחרון שהבדיל לתוך תאים כמו SC-. התרבות המשותפת של שני סוגי התאים ולכן תספק מערכת מעשית מאוד שיכול לשמש למחקרים עתידיים ביכולת של ne DRGurons לנבוט neurites והמנגנונים של היווצרות המיאלין על פיגום שונה להנדסת רקמות עצבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">100 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:116px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;">70 &#956;m strainers (ref. 352350) can be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">15 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">50 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.547.004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">75 cm2 flasks</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">BC301</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Retinoic Acid &#62;98% HPLC</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">ARA-C supplement</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6645</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic (154 aa)</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9205</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Collagenase type I</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17100-017</td>
			<td style="width:167px;">Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:216px;">Collagenase type IV</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">LS004188</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:119px;">FB-1001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Forskolin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3917</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB50253</td>
			<td style="width:167px;">Sharp material to be disposed accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="253">
			<td height="253" style="height:253px;width:216px;">Glial Growth Factor-2 (GGF-2)</td>
			<td style="width:116px;">Acorda Therapeutics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-&#946;1 (R &#38; D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nutrient Mix F12 HAM</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6658</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">N-2 supplement (100x)</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands&#160; (NGF)</td>
			<td style="width:116px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">NC011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Recombinant Human PDGF-AA</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-13A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin (2x bovine pancreatic)</td>
			<td style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003703</td>
			<td style="width:167px;">This is used for DRG dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td style="width:167px;">Prepare the solution in the biological cabinet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

תרבויות של נוירונים DRG ניתק לייצג מתאימות במודל חוץ גופית לחקר תאי עצב חדש. עם זאת, מצעים שלא טופלו לא מספקים סביבה מתאימה לקובץ מצורף DRG והרחבה של neurites. כמו SC-ASC מסוגל לייצר גורמי גדילה וכמוקינים 19 אשר יכולה לשפר את היכולת של נוירונים DRG לנבוט neurites כאשר הם משתחררים במדיום התרבות. הנוכחות של ASC כמו SC-במערכת התרבות ולכן יכולה לשחק תפקיד חשוב בויסות פונקציות DRG. פרוטוקול זה (איור 1) ממחיש את ההליך כדי לבצע שיתוף תרבות ישירה של נוירונים ASC וDRG כמו SC-, שבמהלכו תאים עצביים לקבל בקשר ישיר עם ASC כמו SC-זרע בעבר. הקושי העיקרי הקשורים בהליך זה הוא שונות הגבוה של מספר הנוירונים DRG שנקטפו מבעלי חיים שונים. מסיבה זו, תוצאות יכולות להיות לפעמים קשה comparדואר ותשומת לב מיוחד צריכים להיות משולם במהלך הליך הזריעה כדי להשיג תמיד צפיפות תאים דומה בכל ניסוי. הפרוטוקול כבר מותאם להפחתה לפחות את מספר תאי לווין שנותרו מניתוק נוירון DRG באמצעות שיפוע BSA (שלב 3.11). בנוסף, תוספת ציטוזין-arabinose (ARA-C) ניתן להוסיף למדיום BS כדי למזער את אוכלוסיית תאי לווין נוסף, כפי שתוארה על ידי et al Kingham. 11. עם זאת, הבחירה של זמן הטיפול צריכה להיות מאוזן היטב עם DRG וחיוניות ASC כמו SC-, השפיע גם על ידי הנוכחות של תוספת ARA-C במדיום התרבות. לכן, זה מאוד קשה להשיג בחינם-מערכת תא לווין. איור 2 מראה את החשיבות של ASC כמו SC-לneurite DRG הנבטה במודל שיתוף תרבות באמצעות פולי שלא טופלו וכימי-שונה - סרטי caprolactone (PCL) כמו מצעים. הנוירונים DRG היו maintained בתרבות במשך 3 ימים בנוכחות או עדר של ASC כמו SC-, באמצעות פתרון מעורב המכיל 50% של מדיום BS ו -50% של מדיום התמיינות תאי גזע, כפי שמתואר בשלב 4.5. בעקבות תקופה זו, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4% ומוכתמים בβ טובולין III (נוירונים DRG) וS100 (ASC כמו SC-) לחקור מורפולוגיה של תאים וללמוד את היכולת של נוירונים DRG כדי לבלוט neurites. אין neurites נצפתה על משטחים שלא טופלו בהעדר ASC (איור 2 א) כמו SC-, תוך היווצרות neurites שופרה במערכת שיתוף התרבות (איור 2 ג) באופן ברור. בממוצע, מספר neurites לגוף תא גדל באופן משמעותי 0-3 בנוכחותם של תאי גזע. אישור לתוצאות אלה ניתנו גם על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים ניתוח (SEM), שמוצג באיור 3. בפרט, תמונות SEM מראות כי היכולת של הנוירונים DRG לנבוט neurites מתרחשת באופן מועדף בשיתוףעם ASC כמו SC-, כפי שצוין על ידי החצים הצהובים באיור 3 ג. יש לציין שהשימוש במצעים-שונה laminin (כוללים פפטידים המופק laminin) במערכות תרבות המכילות נוירונים DRG הוגדר לעתים קרובות כתנאי מתאימים לתרבית תאים עצבית, שיש השפעות מדהימות על היווצרות והארכת neurite 30-32 . עם זאת, התוצאות מוצגות באיור 2 ד ו איור 3D מראות כי השילוב של אותות כימיים וביולוגיים נוסף יכול לשפר את התגובה של נוירונים DRG. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> הכנת איור 1. של מערכת שיתוף תרבות ASC כמו DRG-SC הישירה. נוירונים DRG וASC נגזרים בהתאמה מעמוד השדרה והשומן הקרביים ומפשעה של mal הבוגרחולדות הדואר Sprague-Dawley. לאחר העיכול של רקמת השומן דרך מפל של תגובות אנזימטיות, ASC נבדל לתאים כמו SC-ונשמר בתנאים תת-מחוברות עד הצורך. ASC כמו SC-הם מראש זרע על כל שעה מצע 24 לפני קציר DRG. ביום, הנוירונים DRG מופקים וניתקו באמצעות סדרה של פעולות אנזימטיות ומכאניות. אז נוירונים הם זורעים בחלק העליון של ASC כמו SC-זרע בעבר ומתוחזק בתרבות עד assayed (בינוני מעורבת: מכילים 50% של מדיום התמיינות תאי גזע ו -50% של מדיום BS שונה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> איור 2. תמונות הקרינה של נוירונים DRG בתנאי תרבות מגוונים.() סרטים PCL שלא טופלו; (ב) סרטי PCL שונה-RGD; (ג) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL שלא טופלו; (ד) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL שונה-RGD. תאים נשמרו בתרבות במשך 3 ימים באמצעות פתרון מעורב המכיל 50% של מדיום BS שונה ו -50% מבינוניים התמיינות תאי גזע. לאחר פרק זמן זה, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4%, permeabilized בפתרון Triton-X, ואתרי קישור שאינם ספציפיים חסומים עם BSA 1%. תאים עצביים אז היו מוכתמים נגד β טובולין III (FITC; ירוק) וASC כמו SC-נגד S-100 (AlexaFluor568; אדום) נוגדנים. לבסוף גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אולימפוס BX60, יפן). (Re-הדפסה באישור דה לוקה et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> איור 3. תמונות SEM של נוירונים DRG בתנאי תרבות מגוונים () סרטי PCL שלא טופלו (B) סרטי PCL שונה-RGD;. (ג) שיתוף תרבותי עם ASC כמו-SC על סרטי PCL שלא טופלו; (ד) שיתוף תרבותי עם ASC כמו SC-על סרטי PCL-שונה RGD. החיצים הצהובים מצביעים על נקודות המגע בין ASC כמו SC-וDRG, המאשרים האינטראקציה הישירה שלהם במערכת שיתוף התרבות. תאים נשמרו בתרבות במשך 3 ימים וקבועים בglutaraldehyde 2.5%. בעקבות התייבשות בסדרה מדורגת אתנול (50%, 70%, 90%, 100%), תאים היו סוף סוף לשטוף בhexamethyldisilazane ויבש לפני ההרכבה של ספחים וזהב מקרטעות לניתוח SEM. תמונות נרכשו באמצעות SEM (Zeiss EVO60, בריטניה) עם כרך מאיץכאחוז של 10kV. (Re-הדפסה באישור דה לוקה et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

dorsal-root-ganglia-neurons-differentiated-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

21.1K Views.  EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI.  גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר ה...

Video: Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

ניתוח עצבי הפנים במודל חולדה כדי ללמוד עיכוב Axonal והתחדשות

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...