This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.

주 : 동물을 포함한 모든 실험 동물 UK (과학적 절차) 법 1986에 따라 수행 하였다. 1. 실험 장치 <ol><li> 모든 도구는 멸균 확인, 조직 및 세포 수확을 시작하기 전에. 필요 여부, 날카로운 외과 가위, 아주 좋은 집게와 벌금 표준 포셉 한 쌍을 압력솥. 또한 UV 살균, 에탄올 노출 또는 적절한 증기 멸균을 사용하여 세포 파종하기 전에 각 기판을 소독. </li><li> 줄기 세포 수확 및 차별화를위한 미디어의 준비 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 200 mM의 L- 글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PS)가 보충 된 최소 필수 중간 (MEM-α)를 포함하는, 줄기 세포 성장 배지를 준비한다. </li><li> 멸균 디메틸 sulfoxyde의 2.436 ml의 포스 콜린 10mg을 용해시켜 포스 콜린의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 14 μM의 최종 농도로 사용합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 멸균 디메틸 sulfoxyde 1.43 ml의 50 mg을 용해시킴으로써 레티노 산의 35 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 준비한다. 350 NG / ㎖의 최종 농도로 사용합니다. </li><li> 멸균 증류수 100 ㎕의 동결 건조 분말을 10 μg의 용해시켜 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 축적량 (100 ㎍ / ml)로 준비한다. 5 NG / ㎖의 최종 농도로 사용합니다. </li><li> 멸균 증류수 500 μL의 동결 건조 분말을 50 μg의 용해시켜 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 축적량 (100 ㎍ / ml)로 준비한다. 10 NG / ㎖의 최종 농도로 사용합니다. </li><li> 14 μM 포르 스 콜린, 126 NG / ㎖ 아교 성장 인자 -2 (GGF-2), 5- NG / ㎖의 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 10 ng의 보충 줄기 세포 성장 배지 함유 줄기 세포 분화 배지를 준비 / ml의 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF). </li></ol></li><li> 신경 수확 및 분리를위한 미디어 및 주식 솔루션의 준비 <ol><li> Bottenst 준비EIN와 햄 F12 배지에 1 % 1 % PS N2 보충제를 첨가함으로써 사토 (BS) 매체 (28). (24 웰 플레이트를 사용하는 경우) 물론 당 500 μL로 필요한 최종 부피를 계산합니다. </li><li> 중량 / V 1.25 %의 농도에서 햄의 F12 배지에서 콜라겐 IV 주식을 준비합니다. 200 ㎕를 분주으로 -20 ° C에서 솔루션 및 저장소를 필터 소독. </li><li> , 2.5 % 중량 / V의 농도에서 햄의 F12 배지에 소 췌장 트립신 주식을 준비 200 μL 씩 -20 ° C에서 필터 소독 및 저장. </li><li> 신경 성장 인자 (NGF) 200 μL -20 C에서 필터 멸균 한 MG F12 매체 저장소 / ㎖의 지방산이없는 소 혈청 알부민 (BSA) 중의 5 ㎍ / mL의 농도의 스톡 용액을 준비 분취. 재구성 후 NGF를 필터링하지 마십시오. </li></ol></li><li> 경우에는 표면 개질 RT에서 15 분 동안, 코팅 된 커버 / 폴리 D 라이신 플레이트 (0.1 ㎎ / ㎖을 수행되지 않았다) 및 / 또는 라미닌 (37 ° C에서 2 시간 동안 2-10 ㎍ / cm 2) 적절한 신경 세포의 부착 및 신경 돌기 가지를 지원합니다. </li><li> 항상 사용하기 전에 37 ° C에서 물을 욕조에 미디어를 따뜻하게. </li></ol> SC 표현형에 2 지방이 유래 줄기 세포 (ASC) 수확 및 차별화 <ol><li> 성인 남성 흰쥐의 내장과 사타구니 지방에서 ASC 수확 <ol><li> 시작 행크스 &#39;균형 식염수 지방 수확 때까지 얼음에 PS 솔루션 및 저장의 1 %의 v / v를 보충 (HBSS)의 10 ~ 15 ml의 튜브를 준비하기 전에. </li><li> 자궁 경부 전위와 잘린 쥐를 종료합니다. 내부 장기를 노출하고 출혈을 방지 쥐를 면도하고, 복부 피부를 통해 절개를합니다. 위와 장 (일반적으로 지방 노란색 일관성이 특징)과 성인 남성의 Sprague-Dawley 계 쥐의 고환 주위의 사타구니 지방을 감싸는 내장 지방을 제거합니다. 전송 일얼음 HBSS를 함유하는 튜브 E 지방. </li><li> 생물학적 안전 캐비넷 (등급 II)에서 미세하게 도달 가위 미세한 일관성까지 멸균 면도날을 이용하여 지방을 잘게 중량 / V 콜라게나 제 I 형 용액을 새로 제조 한 0.2 %의 15 ml를 함유하는 튜브로 옮기고 하루에 필터 소독. </li><li> 37 ℃에서 수욕 튜브를 전송하고 연속 교반 하에서 30 분 - 1 시간 동안 효소의 존재 하에서 소화 지방 조직을 떠난다. 밀접 소화를 모니터링하고 조직이 충분히 해리되기 전에,이 세포 생존율 및 세포 수율을 향상 멈춘다. 필터 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직을 theun는 - 해리. 참고 : 부드럽게 베이지 색 외관을 획득, 튜브를 소용돌이하면 좋은 조직 소화가 눈으로 볼 수 지방의 균일 한 일관성 발생합니다. </li><li> C 및 원심 분리기 37 °에서 소 태아 혈청을 함유하는 줄기 세포 성장 배지 15 ㎖에 첨가하여 효소를 중화상기 튜브의 하단에, 줄기 세포를 포함하는 각막 혈관 분획을 수집하기 위해, 10 분 동안 160g의 용액. </li><li> 이 단계에서, 펠릿 적혈구 1 ㎖에 재현 탁 될 수있는 혈액 세포 오염을 제거하는 용해 완충액. 1 분 동안 재현 탁 피펫 팅 한 후, 10 분 동안 160g로 신선한 줄기 세포 성장 배지 (10) 및 원심 분리기를 가하여. </li><li> 조심스럽게 바닥에 퇴적 된 세포 펠렛을 돌보는, 튜브에서 뜨는을 대기음. 줄기 세포 성장 배지 10ml에 재현 탁 세포를 75cm로 2 플라스크로 전송하고, 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. 3 일마다 매체를 변경, 통로 1-2까지 하위 합류 수준에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> SC 표현형에 ASC 차별화 <ol><li> 통로 1-2에서, 75cm 2 플라스크에서 줄기 세포 성장 배지를 제거하고 신선 처리장 1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올을 함유하는 새로운 배지 10 mL로 교체빨간색과 당일 필터 살균. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. 이 단계에서, 상기 세포의 분화를 시작하기 전에 낮은 농도 (30 %)로 접종하는 것이 중요하다. </li><li> 조심스럽게 HBSS, 기음과 세포를 씻으 350 NG / ㎖ 레티노 산 (retinoic acid)을 함유하는 10 ml의 배지로 교체합니다. 72 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. 빛에 대한 세포 매체의 노출을 최소화하려고합니다. </li><li> (단계 1.2.6 참조) 삼일 후, HBSS, 기음 조심스럽게 세포를 씻어 줄기 세포 분화 배지 10 ㎖로 교체합니다. 3 일마다 배지를 변경 부 합류 수준에서 세포를 유지한다. 참고 : (. Kingham 등 5 입증 된 바와 같이) 배양 2 주 후, ASC가 자신의 특성 표현형을 표현, SC-같은 ASC로 분화된다. 그들은 다음 행동 (29)의 눈에 띄는 변화없이 10 유로까지 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. 수확 및 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런의 해리 <ol><li> 자궁 경부 전위와 잘린 쥐를 종료합니다. 쥐를 면도하고 척추를 노출 피부를 들어 올립니다. 날카로운 가위를 사용하여 밀폐 된 장기와 혈관의 추가 돌보는 척추를 excide. 페트리 접시를 사용하여 생물 안전 캐비닛 (클래스 II)에 척추를 전송하고 지느러미 부분을 제거합니다. </li><li> 코드 조직을 노출 멸균 날카로운 수술 가위를 사용하여 종축을 따라 반으로 나눈다 척주. 이 점에서, 그것은 쉽게 DRG 신경 세포가 수확 중에 처리 할 수​​ 있도록, 흉곽 레벨보다 작은 두 개의 세그먼트 척주를 절단하는 것이 도움이된다. 미세 집게를 사용하여 부드럽게 당겨 DRG 뿌리를 제거하지 않도록주의를 기울이고, 모든 코드 조직을 제거합니다. DRG 뿌리가 척추 운하 내에서 노출되는이 방법은, 여전히 열 쌌다. 흰색 필라멘트 COMI으로 DRG를 관찰운하에서 직접 밖으로 ng를. </li><li> 신경의 뿌리를 손상하지 않도록주의를, 아주 좋은 집게를 사용하여 척추 운하에 깊은 가서 지불 척추 운하에서 전체 DRG 루트 (다만 DRG)를 잡아 당깁니다. 1 %의 PS 보충 햄의 F12 매체의 3-4 ml의를 포함하는 작은 페트리 접시 (60mm 2)에 DRG를 전송합니다. 다른 동물을 사용하는 경우, 별도의 요리를 사용합니다. </li><li> 해부 현미경, 신경교 세​​포의 오염을 감소시키기 위해 멸균 겸자 메스를 이용하여 주변 신경절 신경 뿌리 초과의 DRG 청소. 신선한 F12 매체의 1.8 ml의 작은 페트리 접시 (35mm 2)에 DRG를 전송합니다. </li><li> 1.25 % 중량 / V 콜라게나 제 4 형 원액 (0.125 %의 최종 농도)의 200 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 DRG를 배양. 조심스럽게 흡인 또는 DRG를 손상하지 않도록주의하면서 유리 피펫으로 흡인 매체. 신선한 F12 매체는 유연한 추가전술 한 바와 같이 0.125 중량 % / V 콜라게나 제 IV 형 효소와 함께 그 취지에 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 매체를 대기음 부드럽게 F12 매체와 DRG을 씻는다. F12 배지 후 1.8 ml의 트립신 200 μl를 추가 (최종 농도 0.25 %의 중량은 / v)로 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 트립신을 제거하고 효소 반응을 체포 FBS 500 ㎕를 보충 F12 배지 1 ㎖를 추가합니다. 매체를 대기음 부드럽게 혈청의 흔적을 제거하기 위해 3 회 F12 매체와 DRG을 씻는다. </li><li> 신선한 F12 매체의 2 ML을 추가 조심스럽게 유리 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 매체 DRG를 전송합니다. 부드럽게 (플라스틱 팁 대안으로 사용될 수있다) 유리 피펫으로 하 (약 8-10 시간)를 피펫 팅에 의해 DRG 뉴런 해리. </li><li> 펠릿은 관의 바닥에 침전하고 새로운 튜브에 매체를 수집 할 수 있도록. 펠렛을 포함하는 튜브에 신선한 F12 배지 2 ㎖를 추가하고 m를 반복유리 피펫 echanical 해리. 서스펜션은 균일 (약 3 ~ 4 번)이 될 때까지이 단계를 반복하고 새로운 튜브의 모든 해리 DRG를 수집합니다. 이 방법은 기계적 분해로부터 유도 응력을 감소시키고, 뉴런의 생존 능력을 향상시킨다. </li><li> 비 - 해리 된 뉴런 및 기타 이물질을 제거하기 위해 100 ㎛ 세포 여과기를 사용하여 15ml의 새로운 튜브에 생성 된 균질 현탁액을 필터. 이 단계에서는, 먼저 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 필터링하고 유리 피펫을 사용하여 더 작은 튜브 내로 용액을 전송하는 것이 편리 할 수​​도있다. 5 분 동안 110g의 현탁액을 원심 분리기. </li><li> F12 배지 500 μL에 30 %의 BSA 용액 500 μL를 첨가하여 15 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비한다. 천천히 점진적 단백질 흔적을 만들기 위해 15 ML 튜브의 벽 아래로 솔루션을 피펫. 이 단계에서, 그 번호에 대한을 사용하여 BSA을 45 ° 각도로 튜브를 잡고 천천히 풀어 유용성형 &quot;트랙&quot;에 대한 기준으로 팔콘 튜브. </li><li> 상기 튜브의 하단에 500 μl를 떠나는 단계에서 3.10 상등액을 대기음 동일한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 천천히 이전에 5 분 동안 500g 3.11에서 단계 (참조로 튜브의 번호를 사용하여)하고 원심 분리기에서 제조 된 단백질 흔적을 따라 현탁액 피펫. </li><li> 단계 4.5에서 후술하는 바와 같이, 상등액을 수정 대기음 BS 매체 (또는 SC 형 ASC / DRG 공동 배양 용 배지의 혼합 한 용액에 펠릿을 재현 탁. 주 : DRG 뉴런을 다시 일시 중단 볼륨 시드 할 원하는 최종 세포 농도 및 샘플의 수에 따라, 필요한 실제 부피로 구성 될 수있다. 한 동물은 24 웰 플레이트 실험에 대한 충분한 세포를 제공 할 것입니다. </li><li> 세포 부착을 허용하기 위해 2 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 시딩 된 샘플을 최종적 신경 성장의 50 ng를 FA / ㎖가 보충 된 신선한 배지 BS를 추가ctor에 (NGF). </li></ol> SC-같은 ASC 및 DRG 뉴런의 4. 직접 공동 문화 <ol><li> 단계 2.2.3에 설명 된대로 하위 합류 수준의 문화 SC-같은 ASC를 유지한다. DRG 수확하기 전에 스물 네 시간, 줄기 세포 분화 매체를 대기음 HBSS로 세포를 씻어. 대기음, 3 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 ml의 트립신으로 인큐베이션. </li><li> 모든 세포는 플라스크에서 분리 한 광학 현미경 검사. 조심스럽게 분리를하는 데 도움이 플라스크를 누릅니다. , 트립신 반응을 중지 5 분 동안 110g에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 수집하는 매체의 7 ML을 추가합니다. </li><li> 상등액을 대기음 줄기 세포 분화 배지 5ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 세어 필요한 최종 농도에 따라 세포 현탁액을 희석. 이상적으로, SC-20000 등 ASC 시드 / cm 2가 세포의 합류 층을 보장한다. </li><li> SC-같은 종자및 기판상의 ASC는 세포 부착을 허용하도록 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 24 시간 배양 후, 배지를 흡인하고, 단계 3.14 및 3.15에 기술 된 바와 같이 세포의 위에 DRG 신경 세포를 추가한다. 줄기 세포 분화 배지의 50 %와 BS 배지의 50 %를 함유하는 혼합 매체 변화 매체. 또한, 최종 혼합 배지에서 1-2.5 %의 FBS 농도를 감소시키는 것은 DRG 해리로부터 유도 위성 세포 오염의 확산을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2의 공 배양 샘플을 품어 미래의 시험에 필요한 시간 동안 배양 유지한다. </li></ol>

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G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+enhance+peripheral+nerve+regeneration.">Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration.</a> Journal of Plastic, Reconstructive &amp; Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).</li><li>Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+regeneration+of+peripheral+nerves+through+bioengineered+nerve+grafts.">Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts.</a> Neuroscience. 181, 278-291 (2011).</li><li>Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+decellularized+allogeneic+artery+conduits+with+autologous+transdifferentiated+adipose-derived+stem+cells+for+facial+nerve+regeneration+in+rats.">Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).</li><li>Zhang, Y., Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nerve+graft+constructed+with+xenogeneic+acellular+nerve+matrix+and+autologous+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).</li><li>Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+adipose+tissue+engineering.">Stem cells and adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).</li><li>Bottenstein, J. E., Sato, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+rat+neuroblastoma+cell+line+in+serum-free+supplemented+medium.">Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).</li><li>Mantovani, C., Raimondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+molecular+and+functional+differences+of+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+stem+cells+isolated+from+rats+of+different+ages.">Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages.</a> Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).</li><li>Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+adipose-derived+stem+cells+act+synergistically+with+RGD-modi+fi+ed+surfaces+to+improve+neurite+outgrowth+in+a+co-culture+model.">Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+Molecules+Enhance+the+Neurotrophic+Effect+of+Schwann+Cell-Like+Differentiated.">Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated.</a> Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).</li><li>Fudge, N. J., Mearow, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-associated+gene+expression+in+adult+sensory+neuron+populations+cultured+on+a+laminin+substrate.">Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate.</a> BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).</li><li>Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+rigidity+and+ligand+density+influence+neuronal+response+in+methylcellulose-laminin+hydrogels.">Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels.</a> Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).</li><li>Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21:+Use+of+stem+cells+for+improving+nerve+regeneration.">Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration.</a> Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).</li><li>Richardson, J. a., Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+dorsal+root+ganglion+neurites+and+Schwann+cells+by+isolated+Schwann+cell+topography+on+poly(dimethyl+siloxane)+conduits+and+films.">Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films.</a> J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).</li><li>Seggio, a. M., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-aligned+Schwann+cell+monolayers+demonstrate+an+inherent+ability+to+direct+neurite+outgrowth.">Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth.</a> J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).</li><li>Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+polycaprolactone+films+via+surface-initiated+atom+transfer+radical+polymerization+for+covalently+coupling+cell-adhesive+biomolecules.">Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules.</a> Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).</li><li>Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+molecules+mediate+both+Schwann+cell+proliferation+and+activation+to+enhance+neurite+outgrowth.">ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).</li></ol>

The authors confirm that there are no conflicts of interest associated with this publication.

차 문화가 생체 내에서 axotomy 후 신경 세포의 재생을 연구하는 DRG 뉴런은 자주 신경 세포들 사이에서 사용된다. 여기에서 성인 쥐 DRG 수확 정확한 프로토콜 뉴런 생존을 손상시키지 않고 주변 환경 위성 세포 집단을 줄이는 목적으로 제시된다. SC-같은 표현형로 ​​분화 ASC으로 세포 치료에 대한 SC에 대한 유효한 대안, SC-같은 ASC / DRG 공동 문화 시스템은 상세하게 설명한다. 33 - 널리 라미닌 (또는 라미닌 유래 펩티드 서열) 신경 세포의 생존 및 신경 돌기의 형성 (31)에 유익한 영향을 미칠 것으로 알려져있다. DRG 신경 세포 배양을 수행 할 때 이것은 따라서 신경 세포의 기능의 손실을 방지하기 위해 이전에 코팅 라미닌 각각의 기판을 의뢰한다. 라미닌 코팅의 개념은 또한 설계를위한 기판을 생체에 적용예컨대 폴리 조직 공학 구조물, - 카프로 락톤 (PCL)은 자주 신경 도관 (30)의 제조에 사용된다. 또한, 이전의 연구는 섬유소 행렬은 세 가지 차원 (11)의 연결을 문화에 적합한 물질이라는 것을 보여 주었다. 단백질 코팅 외에도 공동 배양 모델 DRG 신경 세포의 생존과 손상 후 말초 신경계에서 신경 및 SC 사이에 발생하는 상호 작용을 연구하기위한 가치있는 적합한 환경 조건을 제공한다. 세포는 손상 부위에서자가 세포의 모집 시간을 단축하기 위해 신경 디바이스를 사용하여 생체 내에서 이식 될 수있다. 이 세포 노화 / 죽음과 근육의 위축으로 이어질 수 있습니다 심각한 부상에서 특히 중요하다. SC는 말초 신경 재생과 수초, 제한된 가용성 및 느린 확산 속도의 과정에 관여하는 가장 중요한 신경 교세포 있지만 이들에 부적합하게조직 공학 응용 프로그램 (34). ASC는 그들의 풍부하고 SC 표현형으로 분화 할 수있는 능력, 특정 아교 세포 마커를 발현 및 기본 SC 19 기능적 유사성을 보여주는에 유효한 대안이다. ASC는 공존 배양 시스템에 의한 DRG 뉴런 형성 및 신경 돌기의 연장에 도움이 될 수있는 단백질, 성장 인자 5를 생산할 수있다. 그러나, 두 개의 서로 다른 공동 문화 시스템은 실험의 요구 기능으로 설정할 수 있습니다. 본 논문에서 제안 된 방법은 실험실 11 노포 프로토콜 개정판이며 제 2 셀 타입 (DRG 뉴런)이 시딩되는 두 세포 형 사이에 직접 접촉 (직접 공 배양)를 포함 기타 (SC 형 ASC)의 위에. 이 접근법은 신경 세포 배양 물 (35)을 시드 때 기판상의 폐해 전지 층의 존재의 중요성을 입증 이전 연구 결과에 기초 <sup&gt; - (37). 이 효과는 줄기 세포 표면에서 ASC 및 다른 큐들로부터 증착 DRG 인테그린을 ​​통하여 세포 - 세포 상호 작용 및 ECM 분자로 인한 것 같다. 또한 매체에있어서 혈청 단백질의 감소는 ASC 기능에 영향을주지 않고, DRG 뉴런의 해리로부터 도출 할 수 위성 세포 오염의 확산을 감소하는 것이 관찰되었다. 그러나, SC의 작은 집단을 포함 위성 셀들은, 또한 완전히 공동 배양 시스템 존재할 것이다 DRG 뉴런 거의 남은 세포 배양 물로부터 제거하기 어렵다. 이들 작은 하위 집단은 또한 손상 후 생체에 존재하는자가 세포를 회수하고, 체외 공부하는 동안 수초 프로세스에 참여할 수 있습니다하는 것이 중요하다. 두 번째 방법 (여기서 제시되지 않음) 개의 상이한 세포 유형 간의 직접 접촉 (간접 공 배양)을 피하고, 세포 배양 인서트의 사용을 포함한다. HowevER, 이는 신경 재생 (긴 신경 돌기를 개발하는 신경 세포의 능력이 감소) 중 생체 조건의 반영하지 않고 있지만, 다른 (38) 상에 소정의 세포 집단에 의해 배지에서 방출 확산 성 요인의 영향을 조사하기 위해 사용되는 .

말초 신경 손상은 영국에서 약 9,000가지 경우는 주로 젊은 매년 발생하고 인구 1 일에 일반적이다. 미세 수술 신경 수리 기술에도 불구하고, 기능의 정상 회복이 손상 손 감각, 감소 된 운동 기능과 잦은 통증과 감기 편협 2 결과와 얻기 어려운 것입니다. 이러한 부상은 심오하고 영구적 인 환자에 미치는 영향과 60 % 미만이 3 일 반환과, 일상 생활의 활동을 수행 할 수있는 능력을 가지고있다. 부상, 표현형 및 신경 세포의 형태와 슈반 세포 축삭 발아 수있는 적합한 환경을 만들기 위해 (SC)의 변화에​​ 따라. 절단 한 경우에는 신경 근위 및 원위 덩어리들로 분할되고; 회생 절차가 말초 그루터기 동안, 발생하는 지점 인 근위 그루터기는 SC의 분리 그러자 Wallerian의 변질부상 축삭, 드 차별화 증식에서. 이것은 미엘린 파편을 제거하고 신경 재생성 4,5- 대한 원위 루터 제조 향해 기본이다. 축삭의 발아는 말초 그루터기에서 SC가 발표 한 신경 영양 요소와 케모카인의 생산에 의해 지원 및 Wallerian 변성 6,7 다음 남겨 기저판에 의해 인도된다. SC는 Büngner의 밴드를 형성하는 재생 축삭, 나란히 정렬하는 원조 endoneurial 튜브 외부 분기 감소 대상 기관으로 축삭의 성장. reinnervation 다음, SC는 재생 된 축삭 포장 새로운 수초를 형성하지만, 감각과 운동 기능을 부분적으로 만 8 복원됩니다. 배근 신경절 (DRG)는 감각 신경 세포가 주변 장기에 분포 포함하는 척추의 척추 사이 구멍에있는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 적합한 시험 관내 개조로서 사용될 수있다수초 형성의 조사를 포함하여 11 일 - 신경 재생 (9)의 연구를위한 엘. 특히, 성인 DRG 뉴런은 이러한 세포의 생체 내 특성을 모방 및 조직 공학에서 말초 신경 수리를 위해 새로운 전략을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 공동 배양은 시험관 내에서, 특히 두 개 이상의 세포 유형의 생체 내 상호 작용 환경을 시뮬레이트 동적 시스템을 나타낸다. 이들 세포 공동 배양 모델의 장점 중 하나는 세포 외 환경에 작용 될 수있는 유연성과 높은 제어이다. 14 - DRG 뉴런은 말초 신경계 (10,12)의 두 세포 형 사이에 발생하는 실제의 상호 작용을 모방하는 SC와 공동 배양 시스템에서 자주 사용되어왔다. 이는 SC는 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 현저하게 개선 할 수 성장 인자를 분비하는 것으로 입증되었다DRG 뉴런의 능력은 생존과 신경 돌기를 15, 16 새싹합니다. 그러나, SC는 세포 배양 기술의 발전에도 불구하고, 그것을 조직 공학 어플리케이션에 적합한 세포 수를 생성하기 위해 여전히 어렵고, 증식, 긴 시간을 필요로하고. 또한, 건강한 신경의 희생자가 SC 수확 필요로한다. 따라서 소싱 SC의 차이는 두 조직 공학 및 신경 재생의 시험 관내 시험에서 중요하다. 이러한 관점에서, ASC는 말초 신경 17,18 수리에 사용되는 조직 공학적 구조의 개발을위한 유용한 대안으로 간주 될 수있다. 이전 작업은 S-100, P75 및 신경교 원 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) (19)뿐만 아니라, 미엘린 단백질 제로 (P0)와 같은 특성 신경교 - 마커 (20)를 발현하는, SC 형 ASC로 분화하는 이러한 세포의 능력을 입증 . 뇌 유래 신경 영양 인자로서 신경교 성장 인자의 분비 (BDNF)은 신경 성장 인자 (NGF) 및 아교 세포 유래 신경 영양 인자 (GDNF)도 21, 22을 관찰 하였다. 26 - 시험관 내에서 모두에 의해 입증 및 생체 내에서 23 일 연구 따라서, SC 형 ASC는, 말초 신경 재생의 프로모터로서 사용될 수있다. 또한, ASC는 다른 줄기 세포 유형에 비해 더 많은 수의 최소 침습 절차를 수확 할 수있다; 지방 조직에서 줄기 세포의 빈도는 100- 골수 (27)보다 1000 배이며, 이들은 SC 골수 간엽 줄기 세포에 비해 더 높은 증식률을 갖는다. 이 작품은 각각 해리 DRG 뉴런과 ASC의 고효율 수확을 수행하기위한 세부 프로토콜, 후자는 SC-유사 세포로 분화되는 것을를 제공하는 것을 목표로하고있다. 이러한 두 종류의 세포 공동 배양 따라서 DRG 네브라스카의 능력에 대한 추후 연구에 사용될 수있는 매우 실용적인 시스템을 제공하는 것이다urons는 신경 돌기 신경 조직 공학에 대해 서로 다른 발판에 수초 형성의 메커니즘을 새싹합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">100 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:116px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;">70 &#956;m strainers (ref. 352350) can be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">15 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">50 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.547.004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">75 cm2 flasks</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">BC301</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Retinoic Acid &#62;98% HPLC</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">ARA-C supplement</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6645</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic (154 aa)</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9205</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Collagenase type I</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17100-017</td>
			<td style="width:167px;">Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:216px;">Collagenase type IV</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">LS004188</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:119px;">FB-1001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Forskolin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3917</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB50253</td>
			<td style="width:167px;">Sharp material to be disposed accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="253">
			<td height="253" style="height:253px;width:216px;">Glial Growth Factor-2 (GGF-2)</td>
			<td style="width:116px;">Acorda Therapeutics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-&#946;1 (R &#38; D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nutrient Mix F12 HAM</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6658</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">N-2 supplement (100x)</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands&#160; (NGF)</td>
			<td style="width:116px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">NC011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Recombinant Human PDGF-AA</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-13A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin (2x bovine pancreatic)</td>
			<td style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003703</td>
			<td style="width:167px;">This is used for DRG dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td style="width:167px;">Prepare the solution in the biological cabinet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

해리 DRG 신경 세포 배양 신경 재생의 연구를위한 시험 관내 모델에 적합한를 나타낸다. 그러나, 처리되지 않은 기판은 DRG 부착 및 신경 돌기의 확장에 적합한 환경을 제공하지 않습니다. SC 형 ASC는이 배지에서 릴리스되면 신경 돌기 발아 DRG 뉴론의 기능을 향상시킬 수있는 성장 인자 및 케모카인 (19)를 제조 할 수있다. 배양 시스템에서 SC-ASC 등의 존재 따라서 DRG 기능 조절에 중요​​한 역할을 할 수있다. 이 프로토콜 (도 1) 신경 세포는 이전에 시드 SC 형 ASC와 직접 접촉되는 동안 얻을 SC 상 및 ASC DRG 뉴런의 직접적인 공존 배양을 수행하는 절차를 도시한다. 이 절차와 관련된 주요 어려움은 다른 동물에서 수확 DRG 뉴런의 수의 높은 가변성이다. 이러한 이유로, 결과는 비교 예 때로는 어려울 수 있습니다E 및 특별한주의 항상 각 실험에서 유사한 세포 밀도를 얻기 위해 시드 절차 중에 기울여야한다. 프로토콜은 BSA 구배 (단계 3.11)를 사용 DRG 신경 세포로부터 해리 나머지 위성 세포의 적어도 수를 줄이기 위해 최적화되었다. Kingham 외. (11)에 의해 설명 된 바와 같이 또한, 사이토 신 아라비 노스 (ARA-C) 보충제, 상기 위성 세포 집단을 최소화하기 위해 BS 배지에 첨가 할 수있다. 그러나, 처리 시간의 선택은 또한 배양 배지에서 ARA-C 보충의 존재에 의해 영향 DRG와 같은 SC-ASC 활력, 조심스럽게 균형을 할 필요가있다. 따라서, 위성 무 세포 시스템을 달성하는 것은 매우 어렵다. 기질로서 카프로 락톤 (PCL) 필름 -도 2는 미처리 화학적 변성 폴리 이용한 공 배양 모델에서 돋 DRG 신경 돌기를위한 SC-ASC 등의 중요성을 보여준다. DRG 뉴런했다 마이단계 4.5에 기재된 바와 같이, BS 배지의 50 %와 줄기 세포 분화 배지의 50 %를 함유하는 혼합 용액을 사용하여, 존재 또는 SC-ASC 등의 부재하에 3 일 동안 배양 ntained. 이 기간 후, 세포를 4 % 파라 포름 알데히드에서 수정 및 β-tubulin의 III (DRG 뉴런)와 S100 (SC-같은 ASC) 세포 형태를 조사하고 신경 돌기를 돌출하는 DRG 뉴런의 기능을 연구하기로 염색. 신경 돌기의 형성은 명확 공존 배양 시스템 (도 2c)에서 개선 된 반면 어떤 신경 돌기는, SC 형 ASC (도 2a)의 부재하에 처리되지 않은 표면 상에 관찰되지 않았다. 평균적으로, 전지 본체 당 신경 돌기의 수는 현저하게 줄기 세포의 존재하에 0에서 3까지 증가 하였다. 이러한 결과의 확인은 또한도 3에 도시 된 전자 현미경 (SEM) 분석을 주사하여 주어졌다. 특히, SEM 이미지는 신경 돌기 발아 DRG 뉴런의 결합 능력은 우선적으로 발생하는 것을 보여SC-같은 ASC와 같은 그림 3C에 노란색 화살표로 표시. 이는 신경 돌기의 형성과 신장에 현저한 효과를 갖는, DRG 신경 세포를 함유하는 배양 시스템 (라미닌 유래 펩타이드 포함) 라미닌 수정 기판의 사용이 빈번하게 신경 세포 배양에 적합한 조건으로 정의되었음을 지적되어야 30-32 . 그러나,도 2D 및도 3d에 도시 된 결과는 생화학 큐들의 조합이 상기 DRG 뉴런의 응답을 향상시킬 수 있음을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> 직접 DRG-SC-같은 ASC 공동 배양 시스템 그림 1. 준비. DRG 뉴런과 ASC는 척추와 성인 말의 내장과 사타구니 지방에서 각각 유래전자 흰쥐. 효소 반응의 연쇄를 통한 지방 조직의 소화 후에는 ASC SC 유사 세포로 분화되고, 필요할 때까지 서브 - 컨 플루 언트 상태에서 유지 하였다. SC-같은 ASC는 DRG 수확 이전에 각각의 기판 (24) 시간에 미리 씨앗을 품고있다. 날 DRG 뉴런 추출되고 효소 및 기계적 동작의 시리즈를 통해 해리. 신경 세포는 이전에 접종 SC-같은 ASC의 상단에 시드 및 분석까지 문화에 유지 (혼합 매체 줄기 세포 분화 매체의 50 % 수정 BS 매체의 50 % 포함). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오 것은 큰 볼 이 그림의 버전입니다.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> 다양한 배양 조건에서 DRG 뉴런의 그림 2. 형광 이미지.(A) 치료 PCL 필름 (B) RGD-수정 PCL 필름 (C) 공동 배양 SC-같은 치료 PCL 영화에 ASC와 (D) 공동 배양 RGD-수정 PCL 필름에 SC-같은 ASC와. 세포 변성 BS 배지의 50 %와 줄기 세포 분화 배지의 50 %를 함유하는 혼합 용액을 사용하여 3 일 동안 배양 유지되었다. 이 시간 후에, 세포를 4 % 파라 포름 알데히드에 고정시키고 트리톤 X 용액에 투과 가능하고 비특이적 결합 부위는 1 % BSA로 차단 하였다. 및 S-100에 대한 SC-같은 ASC (AlexaFluor568 적색) 항체; 신경 세포는 β-tubulin의 III (녹색 FITC)에 염색 하였다. 마지막으로 핵은 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 이미지는 형광 현미경 (올림푸스 BX60, Japan)를 사용하여 획득 하였다. 허가와 (재 인쇄 드 루카 등. (30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 적이있는를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> 다양한 배양 조건에서 DRG 뉴런의 그림 3. SEM 이미지 (A) 치료 PCL 필름 (B) RGD-수정 PCL 필름;. (C) 공동 배양 처리되지 않은 PCL 필름에 SC-같은 ASC와 (D) 공동 배양 RGD 수정 PCL 필름에 SC-같은 ASC와. 노란 화살표는 공동 배양 시스템에서의 직접적인 상호 작용을 확인 SC-ASC와 같은 DRG 사이의 접촉 지점을 나타낸다. 세포는 3 일 동안 문화를 유지하고 2.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)에서 수정되었습니다. 그레이딩 에탄올 시리즈 (50 %, 70 %, 90 %, 100 %)에서 탈수 후, 최종적으로 세포를 헥사 메틸 디 실라 잔으로 세정하고, SEM 분석을위한 스퍼터링 스텁과 금에 장착하기 전에 건조시킨다. 이미지 가속 부피와 SEM (자이스 EVO60, UK)를 이용하여 취득한10kV를의 다케. (드 루카 등. (30)의 허가를 다시 인쇄. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

21.1K 조회수.  EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI.  도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다. 

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

축축한 억제 및 재생을 연구하는 쥐 모델의 안면 신경 수술

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...