We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

הערה: כל מחקרי דג הזברה ותחזוקה של בעלי החיים נעשו בקנה אחד עם הפרוטוקול שאושר על-# IACUC Mayo Clinic מכון A41213. 1. בונת DNA לTransgenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר אזור אמרגן hydroxylase בטא דופמין 5.2-kb (ד βh) 8 באמצעות שיבוט CH211-270H11 BAC (ממרכז משאבי BACPAC (BPRC)) כתבנית ה- DNA. השתמש מתאים PCR מערכת הגברה PCR ארוכה ומדויקת של תבניות DNA ארוכות ותוכניות מחזור הבאות לPCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 10 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 50 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), ואחריו 30 מחזורים של (94 ° C, 15 שניות, 53 ° C, 30 שניות, 68 ° C, 8 דקות), 68 ° C, 4 דקות (פריימר קדימה 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &quot; ופריימר ההפוכה 5&#39;- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ד βh -pDONRP4-P1R CLO הכניסהne 8 באמצעות מערכת שיבוט רקומביננטי מסחרית כגון שער multisite. לערבב 1 μl של מוצר dβh המטוהר PCR (172 ng / μl), μl 1 (150 ng / μl) וקטור תורם pDONRP4-P1R (יחד עם וקטורי שער אחרים הם מתנות נדיבות מד&quot;ר צ&#39;י-סל Chien, Univ. יוטה) , 4 μl של TE חיץ (pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים clonase BP, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לאחת Shot TOP10 E. המוסמך coli על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ד βh: מהונדס EGFP-MYCN לבנות 8 מערכת שיבוט רקומביננטי באמצעות הוזכרה בשלב 1.2. לערבב 1 μl של כל שיבוט כניסה (150 ng / μl) כולל 5.2-kb אמרגן dβh (מבנה dβh -pDONR P4-P1R), EGFP חסר קודון עצירה (מבנה PME-EGFP), ואדם MYCN cDNA (מתנה נדיבה מד&quot;ר Hogarty בבית החולים לילדים של פנסילבניה, MYCN-pDONRP2R-מבנה P3), μl 1 (150 ng / μl) של וקטור היעד שונה המכיל אתרי I-SCEI הכרה (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה), 4 μl של חיץ TE ( pH 8.0) עם 2 μl של תערובת אנזים LR Clonase, דגירה עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפוך לE. כימי המוסמך ירייה עליונה coli כגון אחת 10 ועיקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך mitf: מהונדס mitf לבנות 8 על ידי לעכל את וקטור PNP-mitf עם אנזימי הגבלת NotI וסאלי עבור 2 שעות על RT, ועל ידי subcloning 2.65-kb שוחרר (מתנה נדיבה מד&quot;ר ד Raible, Univ של וושינגטון.) קטע DNA המכיל את אמרגן mitf ורצף הקידוד של גן mitf דג הזברה לאתרי NotI וMluI של וקטור pBluescript שונה המכיל אתרי הכרת I-SCEI איגוף (מתנה נדיבה מד&quot;ר הואי Feng, אוניברסיטת בוסטון), תוך שימוש באנזים T4 DNA על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: כדי להגביר את היעילות של יצירת קווי MYCN -expressing יציבים, ד βh: נגזרים צלחת בונה DNA mitf הם coinjected לעוברי צדף שלב אחד תא הצדף מייעד סוג של דגים מוטנטים החסרים עצבית: EGFP-MYCN וmitf. melanophore במהלך פיתוח 36. כך, את המראה של תאי הפיגמנט בעוברים המוזרקים מציע שילוב של mitf: DNA mitf בונה לגנום. הוכח כי שתיים או שלושה מבני DNA coinjected ניתן cointegrated לתוך הגנום הדגים 31. לפיכך, פיגמנטציה נגרמת על ידי ביטוי mitf יכולה לשמש כסמן לאינטגרציה של dβh: transgene EGFP-MYCN ולזיהוי קל יותר של קו מהונדס יציב MYCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את βh ד: EGFP-MYCN וmitf: DNA mitfמבנים ביחס 3: 1 בנפח כולל של תגובת 15 μl עם 1 μl של אנזים I-SCEI ו0.75 μl של חיץ. ודא שהסכום הכולל של ה- DNA בתגובה אינו עולה על 750 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את עיכול I-SCEI ב RT במשך 4 שעות או O / N. ביום השני, I-SceI- מתעכל DNAs מוכן לmicroinjection או ניתן לאחסן ב -20 ° C להזרקה בעתיד. אחסן את אנזים I-SCEI ב -80 מעלות צלזיוס aliquots הקטן כדי לשמור על יעילות אנזימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone ALKF1174L האנושי וגן ALK wild-type מוקטור PCDNA3 (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג&#39;ורג &#39;בדנו-פרבר מכון הסרטן) 7 לאתרי EcoRI וNotI של וקטור pENTRY1A (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג Grabher, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה) באמצעות האנזים DNA T4 על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור βh ד: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; או dβh: מבנים מהונדסים ALKWT באמצעות מערכת רקומביננטי כאמור בפרוטוקול 1.2. בקצרה, לשלב שלושה שיבוטים כניסה, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (או ALKWT -pENTRY1A) וp3E-פולה, לתוך וקטור היעד שונה המכיל אתרי הכרה I-SCEI (מתנה נדיבה מד&quot;ר ג Grabher, קרלסרוהה מכון טכנולוגי, קרלסרוהה, גרמניה), באמצעות LR Clonase אנזים Mix, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ד βh: ALKF1174L (או dβh: ALKWT) וdβh: mCherry הבונה DNA ביחס 3: 1 וlinearize עם אנזים I-SCEI כמתואר בפרוטוקול 1.5-1.6. </li></ol> 2. Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes זכוכית עם 1.0 מ&quot;מ קוטר לכל הזריקות 37. לשבור את הקצה של micropipettes הזכוכית עם סכין גילוח לפני ההזרקה. לכייל על ידי להזריק נפח ההזרקהing H 2 O לטיפה של שמן מינרלים. מדוד את הקוטר של טיפות וכתוצאה מכך ולהתאים את microinjector (לחץ או משך דופק לחץ) כדי להבטיח שאת עוצמת הזריקה היא פחות מ -10% מכלל נפח התא של עוברי תא בשלב אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.5 μl נוסף של אנזים I-SCEI הטרי (5 יחידה / μl) ב 5 μl של פתרון הזרקה המכיל DNA בונה ממש לפני ההזרקה כדי להגביר את היעילות של transgenesis 38. הזרק 50-80 pg של מבני ה- DNA לינארית לתוך הציטופלסמה של עוברי שלב אחד תא. על מנת להבטיח את ההצלחה של הזרקה, לערבב את המדגם עם 0.25% פנול אדומים לשם ויזואליזציה. אם תאים הופכים לאדומים לאחר הזרקה, זה מצביע על microinjection הוא מוצלח. כדי להבטיח את שיעור הצלחה גבוה ליצירת דג מהונדס, אנחנו בדרך כלל להזריק רבים כמו 500 עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור דג מהונדס ביציבות להביע MYCN, coinject βh ד ינארית: EGFP-MYCN וmitf: בונה DNA mitf (ביחס 3: 1) לעוברי של דג הזברה צדף המוטציה פיגמנטציה בשלב אחד התא. הביטוי של Mitf משמש ככתב בשילוב של מבנים מהונדסים בגנום הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביטוי יתר פסיפס של ALK בwild-type או עובר מהונדס MYCN, שיתוף להזריק βh ד ינארית: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry בונה DNA (ביחס 3: 1) לאחד התאים עוברים כתוצאה מגידול של F1 הטרוזיגוטיים Tg (dβh: EGFP-MYCN) דג מהונדס עם דגי AB wild-type. כך, מחצית מצאצאים הן מהונדסים לMCYN וחצי הם wild-type. </li></ol> 3. מסך לדגים יציבים או פסיפס מהונדס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את היעילות של זיהוי קווי MYCN -expressing יציבים, להרדים עוברי צדף הזריקו בעיקר עם tricaine (0.02%)ימי t 3-5 של postfertilization ומסך לפיגמנטציה. העבר את העוברים עם פיגמנטציה לצלחת פטרי חדשה עם מים ביצה טריים ולהעלות אותם לבגרות מינית להקרנה נוספת לדגי המייסד, אשר נושאים את ד βh: transgene EGFP-MYCN בתאי הנבט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את המייסד עם שידור בתאי מין של EGFP-MYCN, דגים בוגרים F0 פיגמנט outcross עם wild-type דגי AB ומסך לעוברי EGFP חיובי ב1-2 ימים לאחר הפריה לgenotyping נוסף. הנח עובר F1 EGFP החיובי יחיד לתוך צינור PCR ולהסיר את כל הנוזלים. הוסף 50 μl של חיץ חילוץ gDNA המכיל 12.5 μl של חיץ תמוגה 4x, 35 H 2 O וμl 2.5 μl proteinase K (10 מ&quot;ג / מיליליטר) לעובר יחיד. דגירה התגובה במשך 2-3 שעות על 55 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות של דגירה על 98ºC כדי להשבית proteinase K. כדי להפוך 50 מיליליטר של חיץ תמוגה 4x, להוסיף 500 μl של 1M טריס (pH 8.4), 2.5 מיליליטר של 1M t KClo 47 מיליליטר של H 2 O. הערה: לאחר דג מהונדס יציב F0 MYCN הם התרבו עם דגי AB wild-type, כל הצאצאים הם פיגמנט. לפיכך, פיגמנטציה אינה יכולה לשמש כסמן לזיהוי הדגים החיוביים MYCN-. בעוד שבדג המהונדס MYCN, חלבון היתוך EGFP-MYCN בא לידי ביטוי בPSNS, כולל נוירונים האוהד של גרעיני צוואר רחם מעולים וגנגליון המגזרי רציף של השרשרת הסימפתטית ואינו PSNS נוירונים דופאמין, כגון הלשד המוארך ו גרעיני גולגולת 8. לפיכך, הביטוי של EGFP יכול לשמש כסמן לזיהוי עובר המהונדס היציב MYCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 μl של gDNA חולץ מן עובר F1 פיגמנט כתבנית, פריימרים MYCN -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 , ושנינות התכנית הבאות &quot;h GC-RICH מערכת PCR: מחזור 1 של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. אנחנו בדרך כלל גנוטיפ 14-16 עוברים פיגמנט מהזדווגות אחת כדי לאשר את קיומו של transgene MYCN המשולב בעוברי פיגמנט, יותר מ -6 דגי מייסד ביתר MYCN mitf וזוהו על ידי שיטה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס את שארית עוברי F1 EGFP החיובי. קליפ הסנפיר וגנוטיפ בחודש 2-3 של גיל באמצעות הפרוטוקול לעיל כדי לאשר את האינטגרציה של transgene MYCN לדגים נוספים. גזע F1 MYCN דג מהונדס יציב עם דגי AB wild-type. Co-להזריק βh לינארית ד: ALK F1174L (או dβh: ALKWT) עם dβh: mCherry הבונה DNA לעוברים אחד התאים כמתואר בפרוטוקול 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין MYCN -expressing עוברים בניסוי מתואר בפרוטוקול 2.4 באמצעות פלואוריד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ escence ולהקרין את העוברים מוזרקים בעיקר בימים 1-3 בpostfertilization לביטוי EGFP-MYCN בPSNS. ואז, בימים 2-5 בpostfertilization, להרדים את העוברים עם tricaine (0.02%) ולמיין את העוברים חיוביים או שליליים MYCN- אלה שוב מבוססים על הביטוי של mCherry בPSNS באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית. הביטוי של mCherry משמש כסמן לCoexpression של ALK ברקמות של בעלי החיים עיקרי פסיפס המוזרק. הערה: ~ 600 צאצאים כתוצאה מהרבייה של דגים מהונדסים יציבים MYCN עם דגי wild-type הוזרקו לכל קבוצה עם בונה DNA לינארית, כולל βh ד: ALK F1174L וdβh: mCherry, dβh: ALKWT וdβh: mCherry, או dβh : MCherry לבד, בהתאמה. ביטוי פסיפס של mCherry ניתן לצפות ב70-90% מהדגים שהוחדרו בעיקר. מחצית לחדשלישי של הדגים המוזרקים שרד דרך שלב הזחלים לשעון גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את כל mCherry + MYCN + וmCherry + MYCN - עוברים על פי הפרוטוקולים סטנדרטיים מהספר דג הזברה 39 ולפקח על תחילת גידול מתחיל בpostfertilization 5 שבועות. </li></ol> 4. גידול צפה בפסיפס מהונדס דגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג דגים מוזרקים בעיקר חיוביים mCherry- כל 2 שבועות החל משעת postfertilization 5 שבועות לראיות של הופעת גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי דגים עם tricaine (0.02%) ומסך לנוכחות של mCherry - וEGFP -expressing גידולים בPSNS תחת SMZ-1500 מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופית Nikon מצויד במראה מצלמה דיגיטלי DS-U1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את הגידולים מביעים את גן ALK, לבודד את mCherry- והמוני EGFP החיובי עבור genotyping ALK PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות PCR, להגביר הדנ&quot;א הגנומימופק מגידולים שפותחו עם פריימרים הבאים: ALK P7: 5&#39;-AGG-3 GC &#39;וALK P18: GC-3 CTT CAG GCT GAT GTT 5&#39;-TGT&#39; המרכז לאמנות עכשווית GGT GTC CGG AAT: מחזור 1 ותגובת PCR הבאה של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של (94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות). לאחר מכן, רצף מוצר PCR עם פריימר P7 ALK כדי לאשר נוסף לקיומה של מוטציה או ALK wild-type בגידולי mCherry-החיוביים. </li></ol>

<ol>
	<li>Tenesa, A., Dunlop, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+aetiology+of+colorectal+cancer+from+genome-wide+association+studies.">New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies.</a> Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).</li><li>Maher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+takes+centre+stage+in+cancer+profiling.">Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling.</a> Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Chung, C. C., Chanock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genome-wide+association+studies+in+cancer.">Current status of genome-wide association studies in cancer.</a> Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).</li><li>Mosse, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ALK+as+a+major+familial+neuroblastoma+predisposition+gene.">Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene.</a> Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).</li><li>Janoueix-Lerosey, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+and+germline+activating+mutations+of+the+ALK+kinase+receptor+in+neuroblastoma.">Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).</li><li>George, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+ALK+provide+a+therapeutic+target+in+neuroblastoma.">Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+Collaborates+with+MYCN+in+Neuroblastoma+Pathogenesis.">Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Amatruda, J. F., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+cancer+in+zebrafish.">Genetic models of cancer in zebrafish.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphoblastic+lymphoma+cells+express+high+levels+of+BCL2,+S1P1,+and+ICAM1,+leading+to+a+blockade+of+tumor+cell+intravasation.">T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation.</a> Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+penetrant+melanoma+in+a+zebrafish+model+is+independent+of+ErbB3b+signaling.">Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).</li><li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing's+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis.">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).</li><li>Le, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RAS+on+the+genesis+of+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Genes &amp; development. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmrk,+kras+and+myc+transgenic+zebrafish+liver+cancer+models+share+molecular+signatures+with+subsets+of+human+hepatocellular+carcinoma.">Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma.</a> PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).</li><li>Forrester, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9-transgenic+zebrafish+develop+a+myeloproliferative+neoplasm+and+provide+new+insight+into+mechanisms+of+myeloid+leukaemogenesis.">NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis.</a> British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).</li><li>Alghisi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogene+expression+to+endothelial+cells+induces+proliferation+of+the+myelo-erythroid+lineage+by+repressing+the+Notch+pathway.">Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway.</a> Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+responses+to+exogenous+DNA+in+mammalian+cells+and+its+effect+on+oligonucleotide-directed+gene+modification.">Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification.</a> Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+mutated+ALK+induces+neuroblastoma+in+transgenic+mice.">Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).</li><li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate.">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

במחקר נציג זה, השתמשנו coinjection וCoexpression של ALK מופעל חולפים עם גן כתב mCherry בMYCN -expressing דג מהונדס כדי להראות שהגנים הללו ישתפו פעולה על מנת להאיץ את תחילתה של נוירובלסטומה, עולה בקנה אחד עם הממצא הקודם שלנו בcoexpressing דגי התרכובת יציב מהונדס במידה ניכרת שני הופעל ALK ...

סרטן הם מחלות מתקדמות המסומנות על ידי ההצטברות של מוטציות פתולוגיים, מחיקות ורווחי כרומוזום לאורך זמן. מומים גנטיים אלה יכולים להשפיע על תהליכים תאיים רבים, החל ממחזור התא, המוות של תאים, חילוף החומרים וההרכבה האנרגטיים של שלד התא להדגיש תגובות כגון היפוקסיה. לפיכך, יצירת גידולים משקפים את הפעולות הקולקטיביות של סטיות גנטיות מרובות על פני ספקטרום של תהליכים ביולוגיים. מאמצים האחרונים אינטגרטיבית הגנומי מחקר, כוללים רצף הגנום כולו, רצף exome, רצף ממוקד, רצף עמוק ומחקרי עמותת הגנום, זיהו מספר גדל והולך של שינויים גנטיים רומן במהותו את כל סוגי הגידולים 1-4. במקרים רבים, הנגעים הגנטיים מתרחשים ביחד באופן לא-אקראי 5-8, המצביעים על שיתוף הפעולה שלהם בפתוגנזה של מחלה. לנתח את התפקידים שבעור של המגוון הרחב של גנים הביעו aberrantly כתוצאה fROM נגעים הגנומי אלה יש צורך לתכנן אסטרטגיות טיפוליות חדשות ולהבין את התגובות של תאים סרטניים לסוכנים אלה, אבל זה הוכיח את עצמו להיות משימה מרתיעה, הדורש מערכות מודל חיה מאוד חזקות להתנהלות של אנליזה גנומית פונקציונלית תפוקה גבוהה ב vivo. למרות יונקים, במיוחד מכרסמים, דגמים מועדפים בביולוגיה של סרטן, דג הזברה החלה למשוך תשומת לב רבה. דג הזברה החוליות (דריו rerio) נעשה שימוש כאורגניזם מודל למחקר פיתוח מאז 1960 ויושמה לראשונה לחקר פתוגנזה גידול בשינה 1982 9-11. קלות תחזוקה, גודל גוף קטן, ופוריות גבוהה להפוך את דג הזברה מודל חזק למסכים גנטיים קדימה בקנה מידה גדולה כדי לזהות מוטציות המעניקות פנוטיפים חריגים ופתולוגיים 10. השקיפות האופטית של עוברי דג הזברה היא תכונת מפתח נוספת התומכות בשימוש רחב יותר של מודל סרטן זה, כהיא מאפשרת בתחום ההדמיה vivo להתנהל כדי לאתר התפתחות גידולים בזמן אמת 9, יישום שהוא קשה יחסית במכרסמים 12. ניתוח גנומיקה השוואתית האחרון של הגנום התייחסות דג הזברה (Zv9) חשף 26206 גני המקודדים חלבונים, עם 71% שיש orthologues אדם, מתוכם 82% מתואמים עם גנים הקשורים למחלות בירושת מנדל באינטרנט בMan (OMIM) מסד הנתונים 13, 14. לוקמיה T-cell החריף לימפובלסטית (T-ALL) 15,16, מלנומה 17,18,, קרצינומה של לבלב כתוצאה מכך, דג הזברה כבר משמשת מודל סוגים שונים של סרטן, כגון: נוירובלסטומה 8, סרקומה ע&quot;ש יואינג 19, 20,21 ראדומיוסרקומה 22, קרצינומה hepatocellular 23 ומיאלואידית ממאירות 24,25, ונבחרו כמודל לסרטן השתלה שלא מבן-מינית חוקר 11,26. מהונדס יציבגישה בדג הזברה משמשת בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעה של רווח של פונקציה של גנים בהתפתחות נורמלית או היווצרות המחלה 27,28. לפתח מודל (איור 1 א) כאמור, אחד מזריק מבנה ה- DNA המכיל את הגן של עניין מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפיות לעוברי פרא-סוג אחד תאים. שלושה עד ארבעה חודשים לאחר ההזרקה, כאשר עובר המוזרקים מגיע לבגרות מינית, הם outcrossed עם דגי wild-type למסך לאלה המראים שילוב של DNA לבנות בתאי המין שלהם, שרישיונותיהם כדגי מייסד. גורמים רבים, כגון מספר העותק ואתר אינטגרציה של transgene, משפיעים על ביטוי של transgene בקווים מהונדסים יציבים. לכן, כדי לפתח מודל גידול מהונדס, קווים מהונדסים יציבים מרובים ביתר אונקוגן יחיד צריכים להיות שנוצרו ראשון והוקרנו לקו מבטא את הגן ברמה שעלולה להוביל לגידול אינדוקציה. עם זאת, אם ביטוי יתר של o מועמדncogene הוא רעיל לתאי נבט, קשה ליצור קו מהונדס יציב על ידי ישירות ביתר transgene 29. לפיכך, גישה זו יכולה להיות זמן רב, עם סיכון גבוה לכישלון כדי ליצור מודל סרטן מתאים. כאן, אנו ממחישים אסטרטגיה חלופית המבוססת על transgenesis החולף הפסיפס (איור 1) המספקת יתרונות ייחודיים על פני transgenesis היציב המסורתי למחקר גנומי פונקציונלי in vivo. בגישה זו, בונה transgene אחד או יותר הם שהוחדרו לתוך השלב אחד התא של עוברים מהונדסים או wild-type. בונה DNA המוזרקת מכילה transgenes אז הם משולבים mosaically ואקראי לדגים המוזרקים העיקריים, וכתוצאה מכך מעורבים גנוטיפים בתוך אוכלוסיות תאים מרובות בדגים בודדים 30. יתר על כן, coinjection של DNA מרובה בונה בעוברי תא אחד מוביל לשיתוף השתלבות באותו התא באתרים אקראיים, המאפשר אחד כדי TRAהספירה התאים עם ביטוי של גנים מושתלים ולחקור את יחסי הגומלין של גנים שונים בהיווצרות מחלה בבעלי החיים הפסיפס 31. כהוכחה לעיקרון, אנחנו זמניים ביטוי יתר ALK מופעל mutationally (F1174L) עם גן כתב mCherry במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של hydroxylase בטא דופמין (βh ד) האמרגן בדגי פרא-סוג ודג מהונדס ביתר MYCN. ALK, אשר מקודד טירוזין קינאז קולט, הוא הגן שעבר מוטציה הנפוצות ביותר בנוירובלסטומה בסיכון גבוה 5-7,32,33. ALK (F1174L), כאחד מהמוטציות סומטיות הפעלה התכופות והחזקות ביותר, הוא ייצוג-יתר ב MYCN- מוגבר חולי נוירובלסטומה בסיכון גבוה וsynergizes עם ביטוי יתר MYCN להאיץ יצירת גידולי נוירובלסטומה בשני עכברים הטרנסגניים יציבים ודגמי דג הזברה מהונדסים 8,34,35. על ידי פסיפסביטוי יתר חולף של ALK (F1174L) עם mCherry בדג המהונדס MYCN, אנחנו סכמנו האצת תחילת גידול שנצפתה בדגים מהונדסים יציבים ביתר שני ALK (F1174L) וMYCN, המצביע על כך את אסטרטגית transgenesis פסיפס יכולה לשמש למהירות וביעילות להעריך את התרומה היחסית של אונקוגנים רבים בייזום גידול in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Expand Long Template PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td style="width:119px;">11681834001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR-TOPO vector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:119px;">451641</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td style="width:119px;">M0202M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway LR Clonase II enzyme 
			Mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#174; BP Clonase&#174; II enzyme mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">GC-RICH PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td>12 140 306 001</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Meganuclease I-SceI&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon digital sight DS-U1 camera</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

לבדוק האם ביטוי יתר של F1174L ALK מופעל mutationally או ALK wild-type יכול לשתף פעולה עם MYCN באינדוקצית נוירובלסטומה, אנו ביטוי יתר או ALK אדם מופעל או ALK אדם wild-type תחת שליטה של אמרגן βh ד בPSNS של דג מהונדס ביתר MYCN. אחד מהמבנים הבאים, dβh - ALKF1174L או <em...

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis at JoVE.com

פסיפס טרנסגנזה של דג זברה לניתוח גנומי פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמדים בפתוגנזה של גידולים | ביולוגיה התפתחותית | וִידֵאוֹ

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

פסיפס דג הזברה Transgenesis לניתוח הגנום פונקציונלי של גנים שיתופיים מועמד בפתוגנזה גידול

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-functional-genomic-analysis

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Genetics

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K Views.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Video: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...