The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project &#8220;M&#228;rkte von &#220;bermorgen&#8221; (SkinHeal).

הערה: הפרוטוקול מיועד לייצור של 24 שווי עור בעובי מלא. אדם fibroblasts עורי וקרטינוציטים אפידרמיס בודדו מביופסיות עור על פי פרוטוקול שפורסם בעבר. 21,22 הסכמה מדעת הושגה מראש והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד במחקר אנושי של יוליוס-מקסימיליאן-האוניברסיטה וורצבורג (182 להצביע / 10). 1. הפקה של Dermal רכיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר קולגן עם 0.1% חומצה אצטית לריכוז סופי של 6 מ&quot;ג / מיליליטר. לפתרון נטרול ג&#39;ל, לערבב 232.5 מיליליטר 2x DMEM, 7.5 מיליליטר סרום עגל עוברי, 7.5 מיליליטר 3 M HEPES, 2.5 מיליליטר כונדרואיטין סולפט (5 מ&quot;ג / מיליליטר). שמור על פתרון ג&#39;ל נטרול ופתרון קולגן על קרח. לחשב 500 μl של ג&#39;ל למקבילה להוסיף / עור. הערה: כפתרון נטרול ג&#39;ל יהיה מעורב עם שני חלקים של prepa פתרון קולגןמחדש כמות כפולה של קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 24 מוסיף לצלחת גם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend fibroblasts עורי האנושי (HDF) ב 10 מיליליטר DMEM, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 270 XG ולספור את התאים. לחלץ את הסכום הדרוש של HDF (5 x 10 4 תאים לכל 500 ג&#39;ל קולגן μl) ו צנטריפוגות התאים למשך 5 דקות ב 270 x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant וזהירות resuspend HDF ב 4 מיליליטר מקורר פתרון נטרול ג&#39;ל מבלי לייצר בועות אוויר. משלב זה לוודא לעבוד מהר ככל האפשר, כדי למנוע הַקשָׁאָה המוקדמת של ג&#39;ל קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הפתרון עם 8 מיליליטר של תמיסת קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח קולגן תאים-התערובת עם פיפטה ורבה שלבים-למלא במהירות 500 μl של תערובת בכל הוספה. דגירה ג &#39;לים 20 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) להתממש ג&#39;לי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את ג&#39;לי 2 מיליליטר הנשר בינוני השתנה Dulbecco 10% בסרום (DMEM) + עגל עוברי (FCS) בכל טובדגירה זה למשך 24 שעות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li></ol> 2. תוספת של אדם עוריות קרטינוציטים (HEK) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני לאחר 24 שעות. לפזר חלבון אנושי פיברונקטין עם מים ultrapure לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. כיסוי כל עורי שווה ערך עם 25 μl של פתרון פיברונקטין. דגירה ג&#39;לי למשך 30 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, resuspend HEK ב 10 מיליליטר קג&quot;מ-2 ולהגדיר ריכוז תא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם קג&quot;מ-2 FCS% מוכנים 5 +. הזרעים 1 x 10 5 HEK על כל ג&#39;ל. דגירה ג &#39;לים 45 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) כדי לאפשר לתאים לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Submerse ג&#39;לי עם קג&quot;מ-2 FCS מוכן + 5% ותרבותם בחממה (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 3. תרבות השווה עור בעובי מלא (FTSE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FTSE תרבות ל6-7 ימיםיורד FCS-ריכוז (5%, 2%, ו 0% FCS). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עם הריכוז נמוך יותר FCS הבא. לשם כך, להסיר לחלוטין את בינונית ומוסיף 1.6 מיליליטר של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, להסיר בינוני לחלוטין. הערה: אל תיגעי במשטח FTSE עם קצה פיפטה תוך כדי כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל להכניס לתוך היטב 1 של צלחת 6 היטב עם מלקחיים סטרילית. להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני רכבת אווירית לכל טוב, להבטיח שלא להרטיב את משטח FTSE. שנה בינונית כל 2-3 ימים למשך 14 יום נוסף. הערה: רמת המילוי של המדיום היא עד המניסקוס של FTSE. </li></ol> 4. ניתוח היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון ופרפין-הטבעה של FTSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות, להעביר מוסיף ב 24 צלחות גם טריות ולתקן רקמות על ידי הוספת 1.6 מיליליטר של 4% paraformaldehyde לכל היטב דגירה הרקמות לשעה 2 ב RT. זהירות! Paraformaldehyd הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסת מנוע קטר. העברהFTSE לקלטת הטבעת רקמות. הסר מקבע הנותר על ידי שטיפה במים ומייבשים את הרקמות באמצעות ריכוזי אתנול עולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את המקבילה העור על ידי חתך אנכי באמצע. מניחים שתי חתיכות בתבנית מתכת מלאות פרפין עם משטחי חיתוך כלפי מטה. הוסף את קלטת הרקמה על גבי העובש כגיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 3-5 פרוסות מיקרומטר ולצוף על אמבט מים C ° 40 להִצטָרְרוּת, הר שקופיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ מתאימות. פרוסות יבשים ביסודיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת Hematoxylin וEosin (H &amp; E) וimmunohistochemical (IHC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחליק לתוך מדף דגירה עבור שעה 1 ב 60 ° C. ודא שפרפין הוא נמס. כתם rehydrated פרוסות עם H &amp; E כמכתים סקירה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצביעת H &amp; E להכין cuvettes צביעת זכוכית 4x עם xylol, 3x עם אתנול 96%, 2x עם אתנול 70%, 1x עם 50% אתנול, 4x מים ללא יונים, hematoxylin 1x, 1x HCl-ethanol (13.7 מיליליטר 1 M HCl מודעה 200 מיליליטר 50% אתנול), 1x מים כרטיסייה, 1x eosin (eosin 1 גרם ל -100 מיליליטר מים deionized) ו2x 2-propanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופיות 10 דקות בי xylol ו -10 דקות בxylol השנייה לdeparaffinize ורעננותם שקופיות. טובלים שקופיות 3x באתנול 96% אני, 3x באתנול 96% השני, 3x באתנול 70% ו3x באתנול 50%. סובב שקופיות במים ללא יונים. כדי לבדל את צבע hematoxylin, 2x לטבול בHCl-אתנול. יש לשטוף במים ללא יונים. כלְּחִילָה, מקום מחליק 5 דקות במי כרטיסייה. עבור מכתים eosin, מקום שקופיות 1 דקות בeosin ולשטוף לאחר מכן במים ללא יונים. להתייבשות, מגלשות לטבול 2x באתנול 70%, 2x ב 96% אתנול ולמקם אותם במשך 5 דקות באני 2-propanol, במשך 5 דקות ב2-propanol השני, 5 דקות בxylol אני ו5 דקות בxylol השנייה. לאחר צביעת H &amp; E, גרעיני תאים הם מוכתמים בכחול, ציטופלסמה ומטריצה ​​תאית מוכתמים באדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחזור אנטיגן, להסיר פרפין עם קסילן ורעננותם פרוסות לצביעה. פרוסות מקוםבסיר אדים ומבשלים פרוסות deparaffinized וrehydrated במשך 20 דקות במחוממים מראש 10 מ&quot;מ חיץ ציטרט (pH 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בחיץ כביסה (חיץ + Polysorbat 0.5% PBS 20) ופרוסות המעגל עם עט נוזל דוחה שקופית סמן או עט יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות בתא לחות. לחסום peroxidase אנדוגני, על ידי הוספת 3% מי חמצן פתרון 100 μl על כל פרוסה. זהירות! מאוד מסוכן במקרה של מגע עם עור ועיניים. ידית עם ציוד מגן אישי. לשטוף שקופיות בכביסת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדן ראשוני דגירה במשך השעה 1 בRT. לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם חיץ כביסה. מכאן והלאה, יש לשמור דגימות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת איתור יוטין-streptavidin לצורך זיהוי של אנטיגן-נוגדן ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain גרעינים עם Hematoxylin דקות 1. מייבשים והר שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. </li></ol></li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 5. פגיעה על ידי שימוש במכשיר האוטומטי הפציעה (AWD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את AWD על ידי חיטוי אזור העבודה עם אתנול 70% ואור אולטרה סגול. ודא שראש הקידוח בגודל הרצוי (למשל, 1 מ&quot;מ) מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שווי עור לאזורים מיועדים של מדגם צלחת מוביל autoclaved באמצעות מלקחיים סטרילית. מניחים את מדגם צלחת ספק לשקע מתחת לראש הקידוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הבקרה כדי להגדיר פרמטרים פצעו כדלקמן: מהירות ספין: 15,000 סל&quot;ד; חדירה: 1.5 מ&quot;מ; הנעה: 100 הרץ. פרמטרים אלו צריכים להיות מוגדרים לכל סוג מדגם בנפרד. העברה פצעה פרמטרים לAWD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל פצע הליך. הסר מדגם צלחת מוביל מהשקע. העברת פצועים FTSE בחזרה למוסיף משמש לתרבות באמצעות מלקחיים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם התרבות של FTSE נפצע בחממה (37 ° C, 5% CO 2) לחקירה של התחדשות. אלternatively, להשתמש במודלים לניתוח היסטולוגית בכל עת. </li></ol>

<ol>
	<li>Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin:+an+indispensable+barrier.">The skin: an indispensable barrier.</a> Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).</li><li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+wound+healing.">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89, 219-229 (2010).</li><li>Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wound+healing+process.">The wound healing process.</a> Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).</li><li>Cory, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch-wound+assay.">Scratch-wound assay.</a> Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).</li><li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).</li><li>Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+in+vitro+model+of+tissue-engineered+human+skin+to+study+keratinocyte+attachment+and+migration+in+the+process+of+reepithelialization.">Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization.</a> Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).</li><li>Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bilayered+living+skin+construct+for+clinical+applications.">Development of a bilayered living skin construct for clinical applications.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).</li><li>Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+3D+organotypic+cultures+using+human+neonatal+epidermal+cells.">Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells.</a> Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).</li><li>Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+substitutes+from+cultured+cells+and+collagen-GAG+polymers.">Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers.</a> Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).</li><li>El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+PEGT/PBT+as+a+dermal+scaffold+for+skin+tissue+engineering.">The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering.</a> Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).</li><li>Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+growth+regulation+in+fibroblast+cocultures+via+a+double+paracrine+mechanism.">Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).</li><li>Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+burn+wound+model.">Development of an in vitro burn wound model.</a> Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).</li><li>Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+wound+model+based+on+the+co-culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+and+human+dermal+fibroblasts.">A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts.</a> Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).</li><li>Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+model+of+partial+thickness+scald+burns+in+mice.">A standardized model of partial thickness scald burns in mice.</a> J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).</li><li>Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+type,+but+neither+race+nor+gender,+influence+epidermal+permeability+barrier+function.">Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function.</a> Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).</li><li>Pilcher, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+collagenase-1+expression+requires+an+epidermal+growth+factor+receptor+autocrine+mechanism.">Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism.</a> J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).</li><li>Blank, I. H., Miller, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+the+epidermis+from+the+dermis.">A method for the separation of the epidermis from the dermis.</a> J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).</li><li>El Ghalbzouri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+facilitate+re-epithelialization+in+wounded+human+skin+equivalents.">Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents.</a> Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).</li><li>Vaughan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+laser-wounded+skin+equivalent+model+to+study+the+effects+of+aging+in+vitro.">A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro.</a> Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).</li><li>Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+model+of+wound+healing+based+on+transplanted+tissue-engineered+skin.">In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin.</a> Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).</li><li>Bell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstitution+of+living+skin.">The reconstitution of living skin.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> Br J Dermatol. 111, 219-222 (1984).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בתאים במבחנה, בדרך כלל, הרחיבו בתרביות תאים הדו-ממדי, שבו תאים לדבוק משטחי פלסטיק. עם זאת, תנאי התרבות אלה אינם משקפים את התנאים תלת ממדים הפיסיולוגיים שבו תאים לגדול in vivo. בתנאים תלת-ממדיים, תאים יכולים ליצור קבצים מצורפים תא-תא ותא-מטריצה ​​טבעיות ולהעביר בשלושה ממדים. במיוחד בפצע עורי ריפוי הדמיון של המצב בvivo הוא ציר מרכזי להפיק נתונים משמעותיים, כמו נדידת תאים ודור מטריצה ​​הם מרכיבים מרכזיים של ריפוי פצעים. כדי לחקות את התנאים אלה פיתחנו FTSE שמורכבים מתאים ראשוניים אנושיים ומשקפים הן את עורי ושכבת אפידרמיס של העור. במהלך שבועיים של התרבות בממשק האוויר נוזלי, HEK ליצור האפידרמיס מורכב מכמה שכבות של קרטינוציטים בשלבי התמיינות שונים ושכבה קרנית. Furthermore, שכבת הדרמיס מורכבת מHDF, שמוטמעים בקולגן אני הידרוג&#39;ל. במהלך זמן התרבות, HDF לשפץ את רכיב עורי, מה שגורם התכווצות משמעותית של הדגמים (איור 2). כדי להכין את הפצעים לשחזור וסטנדרטיים, שפיתחנו AWD. המכונה המחשב נשלט יכולה להגדיר פציעות עורית מוגדרות ומדויקות (איור 4). בהתאם לנועדה מחקר, עומק, צורה וגודל של הפגיעה יכולה להיות מותאם. עם זאת, בשל המפרט הטכני של AWD והמורפולוגיה של FTSE, מומלץ להגדיר חדירה מינימאלית של 100 מיקרומטר שחזור. AWD פועל בתנאים סטריליים בתיבה-מערכת סגורה וניתן לעקר את כל הרכיבים על ידי מעוקר, פתרונות חיטוי או אור אולטרה סגול. כהכנה להליך פצע הדגימות צריכים להיות מועברות לצלחת ספק מדגם. צלחת זה מקלהמיקום מדויק של הדגימות. יתר על כן ההדבקה בין המדגם וצלחת ספק מדגם מספיק כדי לשמור על הדגימות במקום במהלך הליך הפציעה. הליך הפציעה עצמו יכול להיות במעקב אופטי דרך חלון קדמי או על ידי מצלמה ברזולוציה גבוהה שמתעדת את כל השלבים ממצב מקרוב. בניגוד למערכות אחרות המשתמשות בלייזרים לחפור רקמה ליצירת פצע, AWD מעסיק תרגיל מסתובב. לפיכך, אין חום מוחל במהלך ההליך, שהוא זְכוּת מְיוּחֶדֶת חיונית לחקור פצעים מכאניים. בנוסף, צורה מסוימת של ראש הקידוח מבטיחה הסרת חומר מערוץ הפצע. באמצעות פרמטרים פציעה אמפירי נקבעו שהוזכרו לעיל ההליך פצע יכול להיות מותאם כדי לענות על מאפיינים פיסיולוגיים ספציפיים של כל אחד FTSE או דגימות עור ילידים. בדרך זו ניתן למזער תופעות לוואי לא רצויות כמו ניתוק מכוון של שכבות אפידרמיס ופציעת שחזור שבוצעה עם שיעור הצלחהשל 90%. מחקר זה מוכיח כי FTSE פיתח לחקות חלקית את המצב בvivo של עור בצורה מדויקת ולכן יכול להיות מועסק כמודל ללימודי ריפוי פצע. למרות שהיבטים חשובים של תהליך ריפוי הפצע כגון ההשפעה של המערכת החיסונית בכלי הדם, קריש הדם וחסרים במודל, האינטראקציה אפידרמיס-mesenchymal ותא-מטריצה ​​סכמה בסביבה סטנדרטית מאוד תלת-ממדי. בנוסף, נוכל להראות שAWD יוצר פצעים סטנדרטיים בדגמי עור. בשילוב, ניתן להשתמש בשתי הטכנולוגיות לחקור ריפוי פצעים וההשפעה של חומרים ותרופות התומכים בתהליך הריפוי. כדי לחקות את המצב בvivo באופן הדוק יותר, ניתן להאריך FTSE על ידי תאים אחרים כמו מלנוציטים, תאים סרטניים בעור או תאי האנדותל מיקרו-וסקולרית.

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף. זה יוצר חיץ בין הסביבה החיצונית והאיברים הפנימיים. יתר על כן, העור מגן על הגוף מפני אובדן נוזלים, השפעות סביבתיות, פציעות ודלקות ומסייע בויסות טמפרטורת גוף 1. בשל מיקומו החשוף, העור מושפע לעתים קרובות על ידי טראומה מכאנית, תרמית או כימית. למרות העור הוא בדרך כלל מסוגל תיקון עצמי, גורמים רבים מקומיים כגון זיהום, חמצון, והסתפקות ורידים יכולים להוביל לריפוי פצעים לקוי. ריפוי פצע יכול להיות גם הפריע ידי גורמים מערכתיים כמו השמנת יתר, אלכוהוליזם, עישון, תרופות, תזונה ומחלות כמו סוכרת. 2 התהליך של ריפוי פצע יכול להיות מחולק לשלבים 3: (i) השלב הדלקתי, (ii) השגשוג ו( iii) שלב שיפוץ. על פגיעה בעור, אות-מפל מורכב מתחיל, שהוביל לסגירת הפצע. 3לאחר פציעה, הפצע מדמם וקריש דם נוצר. Fibroblasts לעבור לקריש הדם ולהחליף אותו עם רקמה חדשה ששופצה לאחר מכן במשך שנים. ההבנה הנוכחית של תיקון עורית תהליכים ביולוגיים הבסיסי היא מוגבלת. מודלים של בעלי חיים וחזיר קטנים ששמשו ללמוד ריפוי פצע. עם זאת, תוצאות אלה לא יכולים להיות מועברות ישירות לבני אדם בשל הבדלי מינים ספציפיים. בנוסף לדגמים אלה in vivo, כמה היבטים של ריפוי פצע ניתן ללמוד על ידי הדמיה של מצב פצע באמצעות גירוד של תרבויות monolayer במבחנה המבוסס על שורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים. 4 דגמים מגרדים אלה טופל מאוד אבל לא מספיק משקפים את פיזיולוגיה מורכבת in vivo. 5 מלבד דגמים דו-ממדיים, שווה עור אנושי תלת ממדים פותחו עבור מחקר דרמטולוגיים. חלק עורי של מודלים אלה הם generated באמצעות פיגומים שונים, כולל הדרמיס decellularized, 6 הידרוג קולגן, 7,8 glycosaminoglycans 9 או חומרים סינטטיים. 10 העסקת שווה עור אלה, התפקיד של אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 11, epithelialization מחדש, crosstalk הסלולרי בין fibroblasts וקרטינוציטים ו השפעה של גורמי גדילה שונים ניתן ללמוד. יתר על כן, מודלים אלה הם שימושיים כדי לצבור ידע חדש על איך fibroblasts להעביר לאזור הפצוע ואיך chemotactic גורמים משפיעים התחדשות רקמות. 12 לא רק הדור של מודל ריפוי הפצע עצמו הוא מאתגר, אלא גם להקים פצע סטנדרטי מאוד במודל הוא בעייתי. טכניקות נפוצות ליצירת פצעי בדיקות מאפס, 13 כוויות, שחיקה קלטת 14, 15 פגיעת תרמית, 16 שלפוחיות יניקה, חנקן נוזלי 17, 18 לייזרים, 19 </sup&gt; אזמלים, 18 meshers 6 ואגרופי ביופסיה. 20 רוב השיטות אלה יש את אותו חסרונות. פציעות מיושמות באופן ידני קשות כדי לתקנן ולהתרבות בין בדיקות מרובות. גודל, צורה ועומק של הפצע משתנים בין מחקרים ובכך לפגוע באיכות של נתוני מחקר. השימוש בליזר לפציעת עור מוגדר יכול להיות סטנדרטי בקלות יחסית, אך מוביל למצב מחקה פצעי כוויות. חום מיושם על ידי לייזר יכול לגרום denaturation החלבון, צבירת טסיות דם או כלי התכווצות, מה שעלול להוביל לרקמות נמקית. בגישה חלופית, שפיתחנו מכשיר אוטומטי פציעה (AWD), אשר מאפשר לנו ליצור פצעי cutaneous מוגדרים ומדויקים בתנאים סטריליים. פרמטרים פצעו, כמו עומק ומהירות של חדירה, כמו גם מהפכות של ראש המקדח יכולים להיות מוסדרים. במחקר זה, אנחנו בשילוב עם AWD שווה עור בעובי מלא בבית פיתח (ftSE) שניתן להשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי et al Gangatirkar. 8 שכבת הדרמיס של העור שווה הערך מורכב מfibroblasts האנושי עורי (HDF), ששובצו בקולגן אני הידרוג&#39;ל. בשכבת הדרמיס, קרטינוציטים אדם אפידרמיס (HEK) הם זורעים. בתוך שבועיים בממשק האוויר הנוזלי HEK לבנות את האפידרמיס מורכב מכמה שכבות תאים חיוניות ושכבה קרנית. חוץ מזה הדור של מודל זה, מחקר זה מציג את השימוש של AWD כדי ליצור פצעים מוגדרים ומדויקים בFTSE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS&#160;</td>
			<td style="width:135px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-003</td>
			<td align="right">0.05%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)</td>
			<td style="width:135px;">Produced in house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fibronectin Human Protein, Plasma (50 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Inserts</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">140627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">6 well plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">24 well plate</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:135px;">R. Langenbrinck</td>
			<td style="width:119px;">03-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fibroblasts culturing (500 ml):</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">DMEM, high glucose</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>89% (445 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Bio &#38; Sell</td>
			<td style="width:119px;">FCS.ADD.0500</td>
			<td>10% (50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinozyten culture medium (500 ml):&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-20111</td>
			<td>89% (445 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-39011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Gel neutralization solution (250 ml):</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine</td>
			<td style="width:135px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">G0001,3010</td>
			<td>93% (232,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4384-1g</td>
			<td>1% (2,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Bio &#38; Sell</td>
			<td style="width:119px;">FCS.ADD.0500</td>
			<td>3% (7,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">HEPES</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H3375-1kg</td>
			<td>3% (7,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin model submers medium (500ml):&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-20111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-39011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:135px;">Bio &#38; Sell</td>
			<td style="width:119px;">FCS.ADD.0500</td>
			<td>5%-2% (25 ml-10 ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin model air-liquid interface medium (500 ml):&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-39011</td>
			<td>adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:329px;">CaCl2 (300 mM)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C7902-500g</td>
			<td>&#160;0,62% (3,1 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Histology:</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td style="width:135px;">DCS</td>
			<td style="width:119px;">PD000KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Vimentin antibody</td>
			<td style="width:135px;">Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CK14 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td>HPA023040-100&#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CK10 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Filaggrin antibody</td>
			<td style="width:135px;">Abcam</td>
			<td>ab81468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">H&#38;E staining</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Mayer&#180;s Haemalaun</td>
			<td style="width:135px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0884,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>296325-4X2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>32205-4X2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">HCl</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Eosin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2-Propanolol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M1289-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

HDF המבודד וHEK שונה הן במורפולוגיה ובביטוי של סמנים אופייניים. HDF הראה מורפולוגיה ציר בצורה אופיינית, ואילו מורפולוגיה של HEK יכולה להיות מתוארת על ידי מורפולוגיה מרוצפת. התאים התאפיינו במכתים immunohistochemical (איור 1) לפני השימוש בהם לFTSE. HDF הם חיובי עבור vimentin (איור 1 א), סמן לfibroblasts. העיקרי HEK להביע מאוד cytokeratin-14 מוקדם חלבון בידול (איור 1), אך כמעט לא חלבון בידול keratinocyte מאוחר cytokeratin-10 (איור 1 ג). בעקבות התרבות העיקרית, אנחנו מנותקים מתאי צלוחיות תרבית תאים והשתמשנו בהם לייצור FTSE. FTSE היה בתרבית למשך 7 ימים תחת תנאי submers בינוניים (איור 2 א) ואחריו תרבות 14 ימים בממשק האוויר הנוזלי (איור 2). במהלך תהליך זה, וחוזה TSE באופן משמעותי. בתוך 21 ימים HEK הם מתרבים (איור 2 ג-E). על ידי שינוי ברמה בינונית באופן כזה שעל פני השטח של הדגמים חשופים לאוויר ועל ידי ריכוז סידן גובר, HEK מומרץ להתמיין לאפידרמיס רב-תאי שמורכב מכמה שכבות תאים חיוניות של קרטינוציטים במדינות בידול שונים ושכבה קרנית (איור 2E). השוואת צביעת Haematoxylin &amp; Eosin של FTSE (איור 2E) עם עור אנושי ילידים (איור 2F) הוא הופך להיות ברור שאדריכלות היסטולוגית מחקה FTSE של העור. זה יכול להיות ביטוי נוסף בstainings immunohistochemical (איור 3). HDF בי הידרוג&#39;ל קולגן יכול להיות מוכתם עם נוגדנים עיקריים נגד vimentin (איור 3 א, ה). קרטינוציטים יוצרים שכבת אפידרמיס המורכבת מcytokeratin-14 כיוון חיוביתאי דואר (איור 3 ב, ו) וסמן הבידול מאוחר cytokeratin-10 באו לידי ביטוי בשכבות על-בסיס (איור 3 ג, ז). יתר על כן, השכבה הקרנית הוא חיובי לפילגרין (איור 3D, H). בעקבות תקופת תרבות 21 יום, AWD היה לשמש ליצירת פצעי cutaneous בFTSE. כפי שניתן לראות באיור 4 א, ​​AWD בנוי כקופסה-מערכת סגורה, כדי להבטיח תנאים סטריליים. באיור 4, ציור סכמטי של תהליך הפציעה בא לידי הביטוי. FTSE קבוע על צלחת ספק מדגם. התהליך כולו הפציעה, לרבות קביעת פרמטרים כגון הקטנת מהירות ומהפכות של ראש המקדח (איור 4D), כמו גם את עומק החדירה מבוקר מחשב סייע. ההליך פצע ניתן לנטר אופטי דרך חלון קדמי או על ידי מצלמה ברזולוציה גבוהה שמתעדת את כל השלבים במהלך הפציעה<html> הליך. גודל, צורה ועומק של פציעת הפצע יכולים להיות מותאם באופן אינדיבידואלי (איור 4C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52576/52576fig1.jpg" /> אפיון איור 1. של תאים המשמשים לבניית שווה עור בעובי מלא. מכתים immunohistochemical של fibroblasts עורי האנושי הראשוני לvimentin () ושל קרטינוציטים אפידרמיס לחוט להט הבידול המוקדם קרטין cytokeratin-14 (B) וcytokeratin נימה הבידול מאוחר -10 (C). צביעה חיובית מוצגת על ידי צבע חום. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52576/52576fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> 6 / 52576fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. שינויים בתנאי תרבות והתבגרות שווים עור בעובי מלא. תמונות מקרוסקופית של עור בעובי מלא ושווי תרבית למשך 7 ימים בתנאי submers () ו -14 ימים בממשק האוויר הנוזלי (B). השוואה של מכתים Haematoxylin &amp; Eosin שווה עור בעובי מלא בשלבי התפתחות שונים: לאחר 7 ימים (C), 14 ימים (7 ימים בממשק האוויר הנוזלי, D) ו- 21 ימים (14 ימים בממשק האוויר נוזלי, E). צביעת Haematoxylin &amp; Eosin של עור האם של אדם (F). ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52576/52576fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> pg &quot;/&gt; אפיון איור 3. שווים עור בעובי מלא השוואה של מכתים immunohistochemical שווה עור בעובי מלא. (- D) ועור אנושי ילידים (E - H) לvimentin (A, E), cytokeratin-14 (B, F), cytokeratin-10 (C, G) ופילגרין (D, H). ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52576/52576fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52576/52576fig4.jpg" /> איור 4. התקן אוטומטי פציעה לפציעה מבוקרת בעור שווה בעובי מלא. מכשיר הפציעה האוטומטית (AWD) מספק conditio סטריליns במהלך ההליך המבוקר פציעה (). מחשב מחובר (CPU) שולט AWD. שווה מלא עור עובי (ftSEs) מונחים על צלחת ספק מדגם (SCP), סטיות במורפולוגיה המדגם השוותה על ידי מחסום מהירות אור (LB), אשר מפעיל את הליך הפציעה. צורת הפצע תלויה בראש הקידוח משמש (DH). הקוטר נע בין 1 מ&quot;מ (C, תמונה עליונה) עד 2 מ&quot;מ (C, תמונה תחתונה). הליך הפציעה הוא פיקוח ויכול להיות מוקלט לתיעוד וניהול איכות (D). Hematoxylin וEosin מוכתם חתך של מקביל עור בעובי מלא פצועה עם מכשיר הפציעה האוטומטית באמצעות ראש 1 מ&quot;מ קידוח (E). כל הברים בקנה מידה מצביעים על 2 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52576/52576fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding at JoVE.com

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K Views.  University Hospital Würzburg. The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility. 

Video: Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic experimentation is a stable fluid handling system capable of accurately providing an inlet flow rate or inlet pressure. Here, we have developed a syringe pump system capable of controlling and regulating the inlet fluid pressure delivered to a microfluidic device. This system was designed using low-cost materials and additive manufacturing principles, leveraging three-dimensional (3D) printing of thermoplastic materials and off-the-shelf components whenever possible. This system is composed of three main components: a syringe pump, a pressure transducer, and a programmable microcontroller. Within this paper, we detail a set of protocols for fabricating, assembling, and programming this syringe pump system. Furthermore, we have included representative results that demonstrate high-fidelity, feedback control of inlet pressure using this system. We expect this protocol will allow researchers to fabricate low-cost syringe pump systems, lowering the entry barrier for the use of microfluidics in biomedical, chemical, and materials research.

Here we present a protocol to construct a pressure-controlled syringe pump to be used in microfluidic applications. This syringe pump is made from an&#160;additively manufactured body, off-the-shelf hardware, and open-source electronics. The resulting system is low-cost, straightforward to build, and delivers well-regulated fluid flow to enable rapid microfluidic research.

תלת מימדי הדפסה של חומרים תרמופלסטיים כדי ליצור אוטומטית משאבות מזרק עם בקרת משוב עבור יישומים Microfluidic

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...