הפרטים המפורטים בפרוטוקול זה, מתייחסים לדור שווה ערך לעור אנושי, שלעתים קרובות מאתגר מבחינה טכנית. אלמנטים חדשים של פרוטוקול שווה ערך לעור אנושי, כגון כלי דם והדמיה נפחית כלולים. הטכניקה מאפשרת בנייה פשוטה של מודל עור התואם באופן הדוק יותר רקמת in-vivo לחקר מחלות, הזדקנות ורפואה מותאמת אישית.
החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול זה הוא מעבר בין שקיעה לממשק נוזלי-אוויר. סביר להניח שיידרשו מספר ניסויים כדי למטב את רמות התזמון והמדיה לקבלת תוצאות עקביות. כדי להתחיל, להוסיף 516 מיקרוליטרים של מדיה לצינור קר כתרים, ומיד להוסיף 375 microliters של קולגן קר באמצעות פיפטה 1000-microliter תזוזה חיובית.
הסר את קצה פיפטה ריק ולעבור פיפטה 250 מיקרוליטר חיובית מוכן לערבב. מערבבים במהירות, אך בעדינות כדי למנוע היווצרות בועה עודפת. שמירה על הקצה בתמיסה, לערבב באופן אחיד מעמדות שונות של הצינור עד הפתרון הוא של צבע הומוגני, אשר בדרך כלל לוקח בערך חמישה מחזורי פיפטה או 10 שניות.
מיד לפזר 125 microliters של קולגן תאי על הממברנה של 12-טוב תרבות להוסיף. כדי להבטיח כיסוי אחיד, הטה את הצלחת והשתמש בקצה פיפטה כדי לצבוע את הממברנה על ידי הפצה עדינה של קולגן מסביב. מיד להעביר את צלחת 12 באר לחממה 37 מעלות צלזיוס תרבות התא לתת לו ג'ל לפחות 20 דקות.
לאחר תקופת הג'לציה, מוציאים מהחממה את צלחת ה-12 באר של קולגן תאי. הסר את הצינור 1.7 מיליליטר מכוסה מקרח רטוב, ולאחר מכן להסיר את קולגן מלאי מקירור ומניחים אותו על קרח רטוב עם המכסה פתוח. מוסיפים 516 מיקרוליטרים של השעיית תאים מקוררים לצינור הקר.
השתמש פיפטה 1000-microliter באופן מיידי פיפטה 375 microliters של פתרון קולגן קר ישירות לתוך הפתרון בתוך הצינור כתרים. לגרש את כל הקולגן מן פיפטה לתוך הצינור ולזרוק את קצה פיפטה תזוזה חיובית. מיד לעבור פיפטה 250-microliter ולערבב את פתרון קולגן פעם מעורב, להעביר 250 microliters של פתרון קולגן הסלולר על תמיכות קולגן תאיים 12-באר להוסיף תרבות, ולאחר מכן להעביר את צלחת 12-well לחממה תרבית תאים 37 מעלות צלזיוס.
לאחר זמן ג'ל של 30 דקות, להטות בעדינות את הצלחת כדי להעריך את הג'לציה ולוודא כי הקולגן התגבש. הוסף 500 מיקרוליטרים ו- 1000 מיקרוליטרים של מדיית תערובת לתא העליון ולתא התחתון של הכנס, בהתאמה. ודאו שג'ל הקולגן שקוע, והוסיפו עוד מדיה במידת הצורך.
מניחים את צלחת הבאר באינקובטור תרבות התא עבור דגירה לילה. ביום שקיעה שבע, להשתמש פיפטה ידנית כדי לאסוף ולהשליך מדיה מן התא התחתון העליון של כל מבנה היטב. כדי לאסוף מדיה תקועה ישירות מתחת לקרום חדיר, למקם את קצה פיפטה מתחת לקרום, לדפוק את הכנס מחוץ למקום באופן זמני.
הוסף מיליליטר אחד של העור האנושי שווה ערך או מדיה HSE בתוספת 5%FPS לתא התחתון של כל באר ו 200 microliters של השעיית תאים לתא העליון של כל באר. זרעו את הקרטינוציטים ישירות על משטח המבנה העורי ואפשרו להם להסתפק במשך שעתיים באינקובטור. שעתיים לאחר זריעת keratinocytes, בזהירות להוסיף 300 microliters של מדיה HSE, בתוספת 5%FPS לתא העליון של כל מבנה היטב.
לאחר טעינת המדיה, הנח את המבנה בחזרה לאינקובטור. באמצעות פיפטה ידנית, הרם כל מבנה לממשק נוזלי האוויר שלו, או ALI, על-ידי הסרת פסולת מדיה מהתא העליון בלבד. נסו להתקרב ככל האפשר לשכבת האפידרמיס מבלי לגעת בה או לפגוע בה.
להטות את הצלחות מעט בזוויות שונות כדי לאסוף את המדיה, ולאחר מכן להוסיף כשני מיליליטר של מים סטריליים לבארות שמסביב בצלחת כדי לשמור על לחות עקבית. בדוק את הצלחת כמה שעות מאוחר יותר כדי לוודא את keratinocytes הם עדיין ב ALI. הסר מדיה כלשהי בתא העליון, תוך מעקב אחר כמות המדיה המוסרת מכל באר.
שכבות האפידרמיס צריך להיראות hydrated, לא יבש, אבל לא צריך להיות מדיה במאגר על גבי המבנה. כדי להכין את המבנה עבור כתמים immunofluorescent, להפוך להוסיף במהופך ומניחים אותו על הבאר שלה על צלחת היטב. לייצב את הכנס ביד אחת תוך שימוש במלקחיים עדינים או סכין מדויקת כדי לחתוך כמחצית מהיקף הממברנה.
חותכים קרוב ככל האפשר לדיור הפלסטיק. באמצעות מלקחיים קצה עדין, לתפוס את הקצה של דש קרום לחתוך בעדינות לקלף את הממברנה הנקבובית את הכנס, כמו גם את מבנה VHSE. אם המבנה נתקע בצד התא, השתמש במלקחיים העדינים או בסקופולה קטנה כדי להעביר אותו לבאר.
לאחר VHSE הוא בבאר, להשליך את כל החלקים הנותרים של קרום הכנס ולשמור את התרבות להוסיף דיור בכל באר להחזיק את VHSEs במצב שקוע במהלך הכתמה. יומיים לפני ההדמיה, הכינו פוליאדימיאתילסילוקסן או PDMS. מניחים כל כלי ערבוב נקי על איזון שקילה ו tare את קנה המידה.
הוסף את הבסיס ולאחר מכן הוסף את ההצלבה. מערבבים את הפתרון במרץ במשך ארבע דקות לפחות, ויוצרים בועות קטנות. לאחר ערבוב מספיק, יוצקים את PDMS לתוך צלחת פטרי 90 או 100 מילימטר.
דגה את ה-PDMS בתא ואקום עד שכל הבועות ייעלמו וה-PDMS יהיה ברור. שחררו את הוואקום באיטיות והסירו את ה-PDMS. מניחים את המנה לתוך תנור לרפא לילה ב 50 עד 60 מעלות צלזיוס, לוודא כי המנה יושבת שטוחה עבור PDMS לרפא באופן שווה.
יום אחד לפני ההדמיה, השתמש באגרוף פלדה או בסכין דיוק כף יד כדי להכות או לחתוך באר עגולה מגיליון PDMS, בערך באותו גודל כמו מבנה VHSE. חותכים תיקון מרובע סביב הבאר המעגלית כדי ליצור באר PDMS אחת. באמצעות כיסוי זכוכית להחליק בגודל דומה כמו PDMS גם להוסיף דבק ציאנואקרילאט למשטח התחתון של PDMS למרוח באופן שווה עם קצה פיפטה חד פעמי.
מרכז את הזכוכית ולחץ עליה היטב על ה- PDMS תוך השארת חלון זכוכית שקוף בתוך העיגול המנוקב. תן את הדבק להתייבש לילה לפני השימוש. אפיון האפידרמיס והדרמיס מראה סמנים אימונופלואורסצנטיים מתאימים לעור האדם במבני VHSE.
ציטוקרטין 10 הוא סמן קרטינוציט דיפרנציאציה מוקדם שבדרך כלל מסמן את כל שכבות suprabasal המקבילות לעור. Involucrin ו filaggrin הם סמני בידול מאוחרים קרטינוציטים ולסמן את השכבות העליונות ביותר suprabasal המקבילות לעור. ניקוי VHSE מותר הדמיה פשוטה בהגדרה אחת וביטל את הצורך לכוון מחדש את המבנה כדי לדמיין את הדרמיס ואפידרמיס בנפרד.
תמונות נפחיות מאפשרות ליצור עיבודים תלת-ממדיים למיפוי כלי דם בכל מבנה. ערימות תמונות נטענו לתוכנה חישובית ואלגוריתם מותאם אישית שימש לעיבוד וכימות תלת-ממדיים. השלד קבע את המרכז הסופי של כל כלי מסומן קולגן IV ואת הנתונים וכתוצאה מכך שימש לחישוב קוטר כלי הדם, כמו גם שבר כלי הדם.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אפיון כגון ניתוח מחסום, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, פרופילי שומנים ואחרים כדי להבין כיצד כלי הדם משפיעים באופן ספציפי על התבגרות אפידרמיס ויציבות. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים רלוונטיים לרקמות וסוגי תאים במודל עור שעבר כלי דם. היא מתאימה במיוחד למחקר ברפואה מזדקנת ומותאם אישית.
