The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project &#8220;M&#228;rkte von &#220;bermorgen&#8221; (SkinHeal).

הערה: הפרוטוקול מיועד לייצור של 24 שווי עור בעובי מלא. אדם fibroblasts עורי וקרטינוציטים אפידרמיס בודדו מביופסיות עור על פי פרוטוקול שפורסם בעבר. 21,22 הסכמה מדעת הושגה מראש והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד במחקר אנושי של יוליוס-מקסימיליאן-האוניברסיטה וורצבורג (182 להצביע / 10). 1. הפקה של Dermal רכיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר קולגן עם 0.1% חומצה אצטית לריכוז סופי של 6 מ&quot;ג / מיליליטר. לפתרון נטרול ג&#39;ל, לערבב 232.5 מיליליטר 2x DMEM, 7.5 מיליליטר סרום עגל עוברי, 7.5 מיליליטר 3 M HEPES, 2.5 מיליליטר כונדרואיטין סולפט (5 מ&quot;ג / מיליליטר). שמור על פתרון ג&#39;ל נטרול ופתרון קולגן על קרח. לחשב 500 μl של ג&#39;ל למקבילה להוסיף / עור. הערה: כפתרון נטרול ג&#39;ל יהיה מעורב עם שני חלקים של prepa פתרון קולגןמחדש כמות כפולה של קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 24 מוסיף לצלחת גם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend fibroblasts עורי האנושי (HDF) ב 10 מיליליטר DMEM, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 270 XG ולספור את התאים. לחלץ את הסכום הדרוש של HDF (5 x 10 4 תאים לכל 500 ג&#39;ל קולגן μl) ו צנטריפוגות התאים למשך 5 דקות ב 270 x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant וזהירות resuspend HDF ב 4 מיליליטר מקורר פתרון נטרול ג&#39;ל מבלי לייצר בועות אוויר. משלב זה לוודא לעבוד מהר ככל האפשר, כדי למנוע הַקשָׁאָה המוקדמת של ג&#39;ל קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הפתרון עם 8 מיליליטר של תמיסת קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח קולגן תאים-התערובת עם פיפטה ורבה שלבים-למלא במהירות 500 μl של תערובת בכל הוספה. דגירה ג &#39;לים 20 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) להתממש ג&#39;לי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את ג&#39;לי 2 מיליליטר הנשר בינוני השתנה Dulbecco 10% בסרום (DMEM) + עגל עוברי (FCS) בכל טובדגירה זה למשך 24 שעות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li></ol> 2. תוספת של אדם עוריות קרטינוציטים (HEK) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני לאחר 24 שעות. לפזר חלבון אנושי פיברונקטין עם מים ultrapure לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. כיסוי כל עורי שווה ערך עם 25 μl של פתרון פיברונקטין. דגירה ג&#39;לי למשך 30 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, resuspend HEK ב 10 מיליליטר קג&quot;מ-2 ולהגדיר ריכוז תא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם קג&quot;מ-2 FCS% מוכנים 5 +. הזרעים 1 x 10 5 HEK על כל ג&#39;ל. דגירה ג &#39;לים 45 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) כדי לאפשר לתאים לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Submerse ג&#39;לי עם קג&quot;מ-2 FCS מוכן + 5% ותרבותם בחממה (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 3. תרבות השווה עור בעובי מלא (FTSE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FTSE תרבות ל6-7 ימיםיורד FCS-ריכוז (5%, 2%, ו 0% FCS). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עם הריכוז נמוך יותר FCS הבא. לשם כך, להסיר לחלוטין את בינונית ומוסיף 1.6 מיליליטר של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, להסיר בינוני לחלוטין. הערה: אל תיגעי במשטח FTSE עם קצה פיפטה תוך כדי כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל להכניס לתוך היטב 1 של צלחת 6 היטב עם מלקחיים סטרילית. להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני רכבת אווירית לכל טוב, להבטיח שלא להרטיב את משטח FTSE. שנה בינונית כל 2-3 ימים למשך 14 יום נוסף. הערה: רמת המילוי של המדיום היא עד המניסקוס של FTSE. </li></ol> 4. ניתוח היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון ופרפין-הטבעה של FTSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות, להעביר מוסיף ב 24 צלחות גם טריות ולתקן רקמות על ידי הוספת 1.6 מיליליטר של 4% paraformaldehyde לכל היטב דגירה הרקמות לשעה 2 ב RT. זהירות! Paraformaldehyd הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסת מנוע קטר. העברהFTSE לקלטת הטבעת רקמות. הסר מקבע הנותר על ידי שטיפה במים ומייבשים את הרקמות באמצעות ריכוזי אתנול עולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את המקבילה העור על ידי חתך אנכי באמצע. מניחים שתי חתיכות בתבנית מתכת מלאות פרפין עם משטחי חיתוך כלפי מטה. הוסף את קלטת הרקמה על גבי העובש כגיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 3-5 פרוסות מיקרומטר ולצוף על אמבט מים C ° 40 להִצטָרְרוּת, הר שקופיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ מתאימות. פרוסות יבשים ביסודיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת Hematoxylin וEosin (H &amp; E) וimmunohistochemical (IHC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחליק לתוך מדף דגירה עבור שעה 1 ב 60 ° C. ודא שפרפין הוא נמס. כתם rehydrated פרוסות עם H &amp; E כמכתים סקירה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצביעת H &amp; E להכין cuvettes צביעת זכוכית 4x עם xylol, 3x עם אתנול 96%, 2x עם אתנול 70%, 1x עם 50% אתנול, 4x מים ללא יונים, hematoxylin 1x, 1x HCl-ethanol (13.7 מיליליטר 1 M HCl מודעה 200 מיליליטר 50% אתנול), 1x מים כרטיסייה, 1x eosin (eosin 1 גרם ל -100 מיליליטר מים deionized) ו2x 2-propanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופיות 10 דקות בי xylol ו -10 דקות בxylol השנייה לdeparaffinize ורעננותם שקופיות. טובלים שקופיות 3x באתנול 96% אני, 3x באתנול 96% השני, 3x באתנול 70% ו3x באתנול 50%. סובב שקופיות במים ללא יונים. כדי לבדל את צבע hematoxylin, 2x לטבול בHCl-אתנול. יש לשטוף במים ללא יונים. כלְּחִילָה, מקום מחליק 5 דקות במי כרטיסייה. עבור מכתים eosin, מקום שקופיות 1 דקות בeosin ולשטוף לאחר מכן במים ללא יונים. להתייבשות, מגלשות לטבול 2x באתנול 70%, 2x ב 96% אתנול ולמקם אותם במשך 5 דקות באני 2-propanol, במשך 5 דקות ב2-propanol השני, 5 דקות בxylol אני ו5 דקות בxylol השנייה. לאחר צביעת H &amp; E, גרעיני תאים הם מוכתמים בכחול, ציטופלסמה ומטריצה ​​תאית מוכתמים באדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחזור אנטיגן, להסיר פרפין עם קסילן ורעננותם פרוסות לצביעה. פרוסות מקוםבסיר אדים ומבשלים פרוסות deparaffinized וrehydrated במשך 20 דקות במחוממים מראש 10 מ&quot;מ חיץ ציטרט (pH 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בחיץ כביסה (חיץ + Polysorbat 0.5% PBS 20) ופרוסות המעגל עם עט נוזל דוחה שקופית סמן או עט יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות בתא לחות. לחסום peroxidase אנדוגני, על ידי הוספת 3% מי חמצן פתרון 100 μl על כל פרוסה. זהירות! מאוד מסוכן במקרה של מגע עם עור ועיניים. ידית עם ציוד מגן אישי. לשטוף שקופיות בכביסת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדן ראשוני דגירה במשך השעה 1 בRT. לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם חיץ כביסה. מכאן והלאה, יש לשמור דגימות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת איתור יוטין-streptavidin לצורך זיהוי של אנטיגן-נוגדן ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain גרעינים עם Hematoxylin דקות 1. מייבשים והר שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. </li></ol></li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 5. פגיעה על ידי שימוש במכשיר האוטומטי הפציעה (AWD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את AWD על ידי חיטוי אזור העבודה עם אתנול 70% ואור אולטרה סגול. ודא שראש הקידוח בגודל הרצוי (למשל, 1 מ&quot;מ) מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שווי עור לאזורים מיועדים של מדגם צלחת מוביל autoclaved באמצעות מלקחיים סטרילית. מניחים את מדגם צלחת ספק לשקע מתחת לראש הקידוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הבקרה כדי להגדיר פרמטרים פצעו כדלקמן: מהירות ספין: 15,000 סל&quot;ד; חדירה: 1.5 מ&quot;מ; הנעה: 100 הרץ. פרמטרים אלו צריכים להיות מוגדרים לכל סוג מדגם בנפרד. העברה פצעה פרמטרים לAWD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל פצע הליך. הסר מדגם צלחת מוביל מהשקע. העברת פצועים FTSE בחזרה למוסיף משמש לתרבות באמצעות מלקחיים סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם התרבות של FTSE נפצע בחממה (37 ° C, 5% CO 2) לחקירה של התחדשות. אלternatively, להשתמש במודלים לניתוח היסטולוגית בכל עת. </li></ol>

<ol>
	<li>Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin:+an+indispensable+barrier.">The skin: an indispensable barrier.</a> Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).</li><li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+wound+healing.">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89, 219-229 (2010).</li><li>Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wound+healing+process.">The wound healing process.</a> Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).</li><li>Cory, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch-wound+assay.">Scratch-wound assay.</a> Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).</li><li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).</li><li>Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+in+vitro+model+of+tissue-engineered+human+skin+to+study+keratinocyte+attachment+and+migration+in+the+process+of+reepithelialization.">Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization.</a> Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).</li><li>Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bilayered+living+skin+construct+for+clinical+applications.">Development of a bilayered living skin construct for clinical applications.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).</li><li>Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+3D+organotypic+cultures+using+human+neonatal+epidermal+cells.">Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells.</a> Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).</li><li>Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+substitutes+from+cultured+cells+and+collagen-GAG+polymers.">Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers.</a> Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).</li><li>El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+PEGT/PBT+as+a+dermal+scaffold+for+skin+tissue+engineering.">The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering.</a> Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).</li><li>Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+growth+regulation+in+fibroblast+cocultures+via+a+double+paracrine+mechanism.">Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).</li><li>Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+burn+wound+model.">Development of an in vitro burn wound model.</a> Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).</li><li>Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+wound+model+based+on+the+co-culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+and+human+dermal+fibroblasts.">A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts.</a> Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).</li><li>Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+model+of+partial+thickness+scald+burns+in+mice.">A standardized model of partial thickness scald burns in mice.</a> J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).</li><li>Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+type,+but+neither+race+nor+gender,+influence+epidermal+permeability+barrier+function.">Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function.</a> Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).</li><li>Pilcher, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+collagenase-1+expression+requires+an+epidermal+growth+factor+receptor+autocrine+mechanism.">Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism.</a> J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).</li><li>Blank, I. H., Miller, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+the+epidermis+from+the+dermis.">A method for the separation of the epidermis from the dermis.</a> J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).</li><li>El Ghalbzouri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+facilitate+re-epithelialization+in+wounded+human+skin+equivalents.">Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents.</a> Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).</li><li>Vaughan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+laser-wounded+skin+equivalent+model+to+study+the+effects+of+aging+in+vitro.">A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro.</a> Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).</li><li>Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+model+of+wound+healing+based+on+transplanted+tissue-engineered+skin.">In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin.</a> Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).</li><li>Bell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstitution+of+living+skin.">The reconstitution of living skin.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> Br J Dermatol. 111, 219-222 (1984).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בתאים במבחנה, בדרך כלל, הרחיבו בתרביות תאים הדו-ממדי, שבו תאים לדבוק משטחי פלסטיק. עם זאת, תנאי התרבות אלה אינם משקפים את התנאים תלת ממדים הפיסיולוגיים שבו תאים לגדול in vivo. בתנאים תלת-ממדיים, תאים יכולים ליצור קבצים מצורפים תא-תא ותא-מטריצה ​​טבעיות ולהעביר ?...

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף. זה יוצר חיץ בין הסביבה החיצונית והאיברים הפנימיים. יתר על כן, העור מגן על הגוף מפני אובדן נוזלים, השפעות סביבתיות, פציעות ודלקות ומסייע בויסות טמפרטורת גוף 1. בשל מיקומו החשוף, העור מושפע לעתים קרובות על ידי טראומה מכאנית, תרמית או כימית. למרות העור הוא בדרך כלל מסוגל תיקון עצמי, גורמים רבים מקומיים כגון זיהום, חמצון, והסתפקות ורידים יכולים להוביל לריפוי פצעים לקוי. ריפוי פצע יכול להיות גם הפריע ידי גורמים מערכתיים כמו השמנת יתר, אלכוהוליזם, עישון, תרופות, תזונה ומחלות כמו סוכרת. 2 התהליך של ריפוי פצע יכול להיות מחולק לשלבים 3: (i) השלב הדלקתי, (ii) השגשוג ו( iii) שלב שיפוץ. על פגיעה בעור, אות-מפל מורכב מתחיל, שהוביל לסגירת הפצע. 3לאחר פציעה, הפצע מדמם וקריש דם נוצר. Fibroblasts לעבור לקריש הדם ולהחליף אותו עם רקמה חדשה ששופצה לאחר מכן במשך שנים. ההבנה הנוכחית של תיקון עורית תהליכים ביולוגיים הבסיסי היא מוגבלת. מודלים של בעלי חיים וחזיר קטנים ששמשו ללמוד ריפוי פצע. עם זאת, תוצאות אלה לא יכולים להיות מועברות ישירות לבני אדם בשל הבדלי מינים ספציפיים. בנוסף לדגמים אלה in vivo, כמה היבטים של ריפוי פצע ניתן ללמוד על ידי הדמיה של מצב פצע באמצעות גירוד של תרבויות monolayer במבחנה המבוסס על שורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים. 4 דגמים מגרדים אלה טופל מאוד אבל לא מספיק משקפים את פיזיולוגיה מורכבת in vivo. 5 מלבד דגמים דו-ממדיים, שווה עור אנושי תלת ממדים פותחו עבור מחקר דרמטולוגיים. חלק עורי של מודלים אלה הם generated באמצעות פיגומים שונים, כולל הדרמיס decellularized, 6 הידרוג קולגן, 7,8 glycosaminoglycans 9 או חומרים סינטטיים. 10 העסקת שווה עור אלה, התפקיד של אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 11, epithelialization מחדש, crosstalk הסלולרי בין fibroblasts וקרטינוציטים ו השפעה של גורמי גדילה שונים ניתן ללמוד. יתר על כן, מודלים אלה הם שימושיים כדי לצבור ידע חדש על איך fibroblasts להעביר לאזור הפצוע ואיך chemotactic גורמים משפיעים התחדשות רקמות. 12 לא רק הדור של מודל ריפוי הפצע עצמו הוא מאתגר, אלא גם להקים פצע סטנדרטי מאוד במודל הוא בעייתי. טכניקות נפוצות ליצירת פצעי בדיקות מאפס, 13 כוויות, שחיקה קלטת 14, 15 פגיעת תרמית, 16 שלפוחיות יניקה, חנקן נוזלי 17, 18 לייזרים, 19 </sup&gt; אזמלים, 18 meshers 6 ואגרופי ביופסיה. 20 רוב השיטות אלה יש את אותו חסרונות. פציעות מיושמות באופן ידני קשות כדי לתקנן ולהתרבות בין בדיקות מרובות. גודל, צורה ועומק של הפצע משתנים בין מחקרים ובכך לפגוע באיכות של נתוני מחקר. השימוש בליזר לפציעת עור מוגדר יכול להיות סטנדרטי בקלות יחסית, אך מוביל למצב מחקה פצעי כוויות. חום מיושם על ידי לייזר יכול לגרום denaturation החלבון, צבירת טסיות דם או כלי התכווצות, מה שעלול להוביל לרקמות נמקית. בגישה חלופית, שפיתחנו מכשיר אוטומטי פציעה (AWD), אשר מאפשר לנו ליצור פצעי cutaneous מוגדרים ומדויקים בתנאים סטריליים. פרמטרים פצעו, כמו עומק ומהירות של חדירה, כמו גם מהפכות של ראש המקדח יכולים להיות מוסדרים. במחקר זה, אנחנו בשילוב עם AWD שווה עור בעובי מלא בבית פיתח (ftSE) שניתן להשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי et al Gangatirkar. 8 שכבת הדרמיס של העור שווה הערך מורכב מfibroblasts האנושי עורי (HDF), ששובצו בקולגן אני הידרוג&#39;ל. בשכבת הדרמיס, קרטינוציטים אדם אפידרמיס (HEK) הם זורעים. בתוך שבועיים בממשק האוויר הנוזלי HEK לבנות את האפידרמיס מורכב מכמה שכבות תאים חיוניות ושכבה קרנית. חוץ מזה הדור של מודל זה, מחקר זה מציג את השימוש של AWD כדי ליצור פצעים מוגדרים ומדויקים בFTSE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS&#160;</td>
			<td style="width:135px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-003</td>
			<td align="right">0.05%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)</td>
			<td style="width:135px;">Produced in house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fibronectin Human Protein, Plasma (50 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Inserts</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">140627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">6 well plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">24 well plate</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:135px;">R. Langenbrinck</td>
			<td style="width:119px;">03-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fibroblasts culturing (500 ml):</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">DMEM, high glucose</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>89% (445 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Bio &#38; Sell</td>
			<td style="width:119px;">FCS.ADD.0500</td>
			<td>10% (50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinozyten culture medium (500 ml):&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-20111</td>
			<td>89% (445 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-39011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Gel neutralization solution (250 ml):</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine</td>
			<td style="width:135px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">G0001,3010</td>
			<td>93% (232,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4384-1g</td>
			<td>1% (2,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Bio &#38; Sell</td>
			<td style="width:119px;">FCS.ADD.0500</td>
			<td>3% (7,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">HEPES</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H3375-1kg</td>
			<td>3% (7,5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin model submers medium (500ml):&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-20111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-39011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:135px;">Bio &#38; Sell</td>
			<td style="width:119px;">FCS.ADD.0500</td>
			<td>5%-2% (25 ml-10 ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin model air-liquid interface medium (500 ml):&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack</td>
			<td style="width:135px;">Promocell&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-39011</td>
			<td>adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>1% (5 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:329px;">CaCl2 (300 mM)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C7902-500g</td>
			<td>&#160;0,62% (3,1 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Histology:</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td style="width:135px;">DCS</td>
			<td style="width:119px;">PD000KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Vimentin antibody</td>
			<td style="width:135px;">Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CK14 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td>HPA023040-100&#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CK10 antibody</td>
			<td style="width:135px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Filaggrin antibody</td>
			<td style="width:135px;">Abcam</td>
			<td>ab81468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">H&#38;E staining</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Mayer&#180;s Haemalaun</td>
			<td style="width:135px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0884,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>296325-4X2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>32205-4X2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">HCl</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Eosin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2-Propanolol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M1289-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

HDF המבודד וHEK שונה הן במורפולוגיה ובביטוי של סמנים אופייניים. HDF הראה מורפולוגיה ציר בצורה אופיינית, ואילו מורפולוגיה של HEK יכולה להיות מתוארת על ידי מורפולוגיה מרוצפת. התאים התאפיינו במכתים immunohistochemical (איור 1) לפני השימוש בהם לFTSE. HDF הם חיובי עבור vimentin (איו...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding at JoVE.com

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.5K Views.  University Hospital Würzburg. The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility. 

Video: Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic experimentation is a stable fluid handling system capable of accurately providing an inlet flow rate or inlet pressure. Here, we have developed a syringe pump system capable of controlling and regulating the inlet fluid pressure delivered to a microfluidic device. This system was designed using low-cost materials and additive manufacturing principles, leveraging three-dimensional (3D) printing of thermoplastic materials and off-the-shelf components whenever possible. This system is composed of three main components: a syringe pump, a pressure transducer, and a programmable microcontroller. Within this paper, we detail a set of protocols for fabricating, assembling, and programming this syringe pump system. Furthermore, we have included representative results that demonstrate high-fidelity, feedback control of inlet pressure using this system. We expect this protocol will allow researchers to fabricate low-cost syringe pump systems, lowering the entry barrier for the use of microfluidics in biomedical, chemical, and materials research.

Here we present a protocol to construct a pressure-controlled syringe pump to be used in microfluidic applications. This syringe pump is made from an&#160;additively manufactured body, off-the-shelf hardware, and open-source electronics. The resulting system is low-cost, straightforward to build, and delivers well-regulated fluid flow to enable rapid microfluidic research.

תלת מימדי הדפסה של חומרים תרמופלסטיים כדי ליצור אוטומטית משאבות מזרק עם בקרת משוב עבור יישומים Microfluidic

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

דור של שווה ערך לעור אנושי בהרכבה עצמית

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.