Name: leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets at JoVE.com

This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

הערה: כל הניסויים הנוכחיים בוצעו על פי נהלים המקומיים אתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת קווינסלנד (שאושרו על ידי אוניברסיטת קווינסלנד, ועדת האתיקה Biosciences אנטומי). 1. בידוד איילט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת של אנזימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיכול הלבלב, להשתמש בתערובת של הסוג IV liberase וcollagenase. לדלל TL liberase (thermolysin הנמוך) בקבוקון 1 של 5 מ&quot;ג עם 26 מיליליטר של DMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סוג IV collagenase במאגר של האנק בריכוז של 0.5mg / מיליליטר, בתוספת 5 מ&quot;מ HEPES, 0.5mm CaCl 2, 0.1mg / מיליליטר DNAse ו1mg / אלבומין בסרום שור מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את TL liberase ופתרונות collagenase ביחס של 4: 1 (לפי נפח), כלומר, 4 מיליליטר liberase collagenase מיליליטר TL + 1. Aliquot התערובת של אנזימים ל2.5ml כל חנות ב -20 ° C. הערה: הפעמים הדגירה רקמת vארי קצת בין קבוצות של אנזים (הבדל דק &#39;30 שניות ל1). לכן, ייתכן שתידרש בדיקה אצווה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה בידוד RPMI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר בקבוקון אחד של אבקת RPMI 1640 ב1 ליטר של מים בRT ולהשלים עם 2 גרם NaHCO 3, 4.02 HEPES ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תקשורת בידוד RPMI בבקבוק חרוטי גדול, לערבב עם בוחש מגנטי, להסתגל לpH 7.4 עם NaOH, המסנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI תרבות מדיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקשורת תרבות RPMI, עם 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה 1% (כלומר, פניצילין 100 U / ml, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד וCulturing איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורבן של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברי נקע בצוואר רחם או מחנק CO 2 על פי נהלי האתיקה של המוסד המקומי. לרסס את גוף העכבר ביסודיות עם אתנול 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף לבלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uקיצוצי se 2 ארוכים רוחבי דרך העור וצפק הבטן לעשות דש בצורת V. משוך את הדש של העור עד כדי לחשוף את חלל הבטן כולו, לשים בצד את המעי ולשמור על הכבד במקום על ידי נייר טישו מקופל כדי לחשוף את צינור מרה המשותף (איורים 1 ו -2). שים את בעלי החיים, כך שהראש כלפי המנתח והזנב מהמנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהדק כלי דם בampulla על קיר תריסריון לחסום אנזימים המוזרקים מלהיכנס לתריסריון (איור 1). הערה: זהו צעד חשוב כפי שקובע אם האנזימים הזריקו ייכנסו לצינור הלבלב וינקבו הלבלב או רפלוקס לאתר ההזרקה (מעל מהדק) או ללכת לתריסריון (תחת מהדק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate צינור מרה המשותף עם מחט G 31 בסמוך לצומת של צינור הכבד הנפוץ וצינור פיברוזיס (איור 1) ולהשאיר מקום לזריקה שנייה, אם הלבלב הדואר אינו ינקב בפעם הראשונה. לאט לאט (מעל ~ 10 שניות) להזריק כ -2 מיליליטר של תערובת אנזים קרה לתוך צינור המרה משותפת העכבר. הערה: הלבלב יהיה perfused במהירות אם המהדק נמצא במצב תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את מיקום המהדק אם המחט נמצאת בתוך צינור המרה המשותף, אבל לא יכולה perfuse הלבלב (כלומר., להעביר את המהדק קצת מהכבד אם על מהודק או להעביר אותו קצת בכבד אם תחת מהודק). הערה: המחט לפעמים הולכת לכמוסה המקיפה במקום לומן של הצינור. סימן שימושי כדי לבדוק אם המחט נמצאת בתוך צינור המרה המשותף היא ההתרחבות של הצינור כאשר הזרקה. אם הלבלב אינו ינקב, אלטרנטיבה היא תערובת האנזים יכולה להיות מוזרקת לאתרים מרובים של הלבלב עם תשואה נמוכה הצפויה. טפטוף של אתר השמאל של הלבלב (אונת הטחול) הוא חשוב למקסום תשואת איון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הלבלב הוא perfused, להסיר במהירות את הלבלב, הכניס אותו לתוך בקבוקון (~ 20 מיליליטר, זכוכית) ודגירה ~ 19 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות קצת בהתאם לזן העכבר וגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן הדגירה, לעצור את תהליך העיכול על ידי הוספה ~ 20 מיליליטר של תקשורת בידוד הקרה. לנער את הבקבוקון בעדינות כדי לשבש את הלבלב ולשפוך אותו דרך מסננת רגיל תה (קוטר נקבובית של 1 מ&quot;מ) לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי. למעלה למעלה הצינור עם תקשורת בידוד וצנטריפוגות ב 400 XG דקות 1 ב 4 ° C עם בלם משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה בתקשורת הבידוד שוב ולהעביר לשני צינורות 15 מיליליטר, אז צנטריפוגות ב 400 XG דקות 1 ב 4 ° C עם בלם משם. לאחר שאיפת supernatant, לערבב את שני כדורים היטב עם 6 מיליליטר של תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות (פתרון Histopaque 1,077) לכל צינור על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה. ואז בעדינות להוסיף ~ 6 מיליליטר של תקשורת הבידוד לצד של הצינור על גביתקשורת שיפוע צפיפות ההפרדה וצנטריפוגות בבמשך 15 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס עם בלם משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant ב( תקשורת בידוד) העליונה, שכבה (תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות) אמצע והנמוך ב 3 מנות נפרדות. בוחר ידני את האיים ב 3 מנות אלה, באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ לנתח. הערה: השכבה האמצעית מכילה את רוב האיים. איים מוכרים כמבנים קומפקטיים של ~ 50 ל 500 מיקרומטר בגודל (איור 3). אנו משיגים ~ 200 איים בעכברי WT ו300 &lt;100 בעכברי db / db איים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Culturing איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעזור לאיים להתאושש מעיכול האנזים, קבוצות התרבות של 40 איים בצלחת פטרי 25 סנטימטר עם 6ml תקשורת תרבות RPMI (גלוקוז 10 מ&quot;מ) על 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 / O 2 עבור 2 ימים לפני שידור חי -cell הדמיה 2-פוטון. לשנות את התקשורת והתרבות יומית. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. תא חי 2-פוטון הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ תאי נתרן עשיר עבור assay 2-הפוטון עם 140 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 5 מ&quot;מ NaHCO 3 ו -10 מ&quot;מ HEPES. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay 2-הפוטון, להכין SRB המניה 8 מ&quot;מ במאגר תאי, aliquot לתוך צינורות קטנים וחנות ב -20 ° C. לדלל את מניות SRB 1:10 ב חיץ תאי טרי כדי לקבל ריכוז עבודה של 0.8 מ&quot;מ. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה פוטון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לפני דגירה איים תרבותיים 2 ימים במאגר תאי גלוקוז 3 מ&quot;מ למשך 30 דקות. הערה: אנו משתמשים באיים בין 2 ל 5 ימים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, במקום שקופיות זכוכית על התא תרמו-שליטה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. השתמש גריז כדי למנוע הדליפה של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החדר עם 500 μl של extracellמאגר ular המכיל 0.8 מ&quot;מ SRB עם ריכוזים שונים של גלוקוז (3 מ&quot;מ, 6 מ&quot;מ, 15 מ&quot;מ ו -20 מ&quot;מ גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, למקם את איון מראש מודגרות לאמצע החדר ולהתמקד ב 3-4 שכבות תאים לאיון בי, באיי מכרסמים, immunostaining לאינסולין מראה כי רוב התאים בטא תאים. הערה: SRB מתאר את כל קרום התא של איון במהירות ובאיון מוכן תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ 2-פוטון עם מטרת 60x טבילת שמן (NA 1.42) ותוכנת הדמיה (למשל., ScanImage 11). איור 4 ממחישים הסדר מיקרוסקופיה טיפוסי. אירועי תמונה exocytic באמצעות SRB כקרום סמן תאי ניאון impermeant הנרגש פעימות לייזר פמטו-שניות ב880 ננומטר, עם הקרינה שזוהו ב550-650 ננומטר. רשום את תגובות איון לגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות אירועי exocytic אחת על ידי הופעתו הפתאומית של נקודת ניאון קטנה (רזולוציה של 10 פיקסלים /1; מ &#39;) ולאשר על ידי השלב המהיר העולה של אות הניאון מעל אזור של עניין (~ 0.78 מיקרומטר 2). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li><li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell:+The+last+ten+years.">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li><li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperglycemia,+independent+of+plasma+lipid+levels,+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db/db+mouse+model+of+diabetes.">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li><li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models.">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li><li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+a+new+mutation+in+mouse.">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+deficit+in+islets+from+db/db+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells.">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell.">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

<html> הגורם הקריטי ביותר בבידוד איון הוא זלוף הראשוני של הלבלב; תחת perfused תוצאות לבלב בתשואת איון נמוך משמעותי. גורמים אחרים משפיעים גם על איכות הבידוד כגון זמן העיכול והרמה של טלטול שיכול לפצות באופן חלקי לרמה של זלוף. לדוגמא, לבלב perfused באופן מלא יהיה צורך טופח על 37 מעלו?...

התפקיד של תפקוד לקוי של בטא-תא במחלה הוכר נרחב 3,4. שורות תאים כגון MIN6 ואח&quot;י-1 הן כלים שימושיים כדי להבין את הביולוגיה של תאי הבטא התנהגות. עם זאת, השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין מתרחשת בתוך האיים לנגרהנס. איים אלה מכילים אלפי תאי הבטא צפופים, כמו גם כלי דם וסוגי תאים אנדוקריניות אחרים. סביבה זו באיון משפיעה הפרשת אינסולין ועשויה להיות חשוב בסוכרת. לכן, כדי להבין את השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין, והפתופיזיולוגיה של מחלה, חשוב ללמוד איים שלמים. בידוד איון איים חיים אדם ו, באיים מסוימים, אדם מחולי סוכרת מסוג 2 הם קשים להשגה. בנוסף, יש לי איים אנושיים אפשרויות מוגבלות למניפולציה מולקולרית ניסיונית. חוקרים לכן מועסקים הואמאפשר מבעלי חיים ומודלים של בעלי חיים של סוכרת מהסוג 2. מודל מחלה אחת כזו הוא עכבר db / db. זוהי מוטציה ספונטנית שמודלי סוכרת מסוג 2 עם התקדמות הפנוטיפ שמקבילה מחלה אנושית 5,6 מקרוב. יש הפרוטוקול המובא כאן לבידוד איון מעכברי db / db סוכרת שלבים רבים במשותף עם קבוצות אחרות עם כמה חידודים לתשואה טובה יותר, טיהור והישרדות איון משופרת. הדמיה 2 פוטון Assay 2-הפוטון לחיות התאים המתוארים כאן מאפשר לחוקרים לכמת את המספר ולהעריך את המאפיינים של גרגרים המכיל אינסולין אחת מהתאים רבים של 7 סוכרת והסוג בר על האיים קטנטנים 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>to prepare isolation media</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>to prepare cultured media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>to dilute the liberase</td></tr><tr><td>Metamorph program</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>to analyze the 2-photon images</td></tr></tbody></table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

סוכרת מסוג 2 היא מחלה כרונית המשפיעה על 382 מיליון אנשים בשנת 2013, והוא צפוי לעלות ל 592 מיליון על ידי 2035 1. במהלך 2 העשורים האחרונים, את התפקיד של בעיות בתפקוד התא בטא בסוכרת מהסוג 2 כבר נקבע 2 באופן ברור. התקדמות מחקר נדרשת שיטות לבידוד של איי לבלב. הפרוטוקול של בידוד איון מוצג כאן מניות רבות צעדים משותפים עם פרוטוקולים מקבוצות אחרות, עם כמה שינויים כדי לשפר את התפוקה ואיכות של איים מבודדים משני הסוג בר וdb Lepr סוכרת עכברים (DB / DB). שיטת הדמיה 2-פוטון לחיות תאים מכן הציגה שיכול לשמש כדי לחקור את השליטה בהפרשת אינסולין באיים.

תשואה וטיהור איון לעכבר נורמלי סוג בר, כ -200 איים צפויים. איים בריאים נראים בהירים, בצורה עגולה ויש לי גבול חלק. אצווה בידוד מתעכל-על בדרך כלל יש איים קטנים ומטושטשים בזמן שיש אצווה-מתעכל תחת פחות איים ואיוני acinar תא מצורף (איור 3)...

Watch this Scientific Journal Video about Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets at JoVE.com

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.4K Views.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Video: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

קרוב אינפרא האדומה האופטית טומוגרפיה תחזית להערכות של חלוקת מסת β-תאים בחקר הסוכרת

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biology

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunology and Infection

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

שיטת השתלת איון כדי Omentum העכבר

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www.jove.com/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

השתלת איי לבלב: שיטה להשתלת איי לבלב לתוך החדר הקדמי של עין העכבר להדמיית In Vivo

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Pancreatic Cancer

Assays & techniques

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Source: Park, I. and Kim, P. <a href="https://www.jove.com/v/62538">Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

הדמיה תוך-חיונית: שיטה לתצפית ברמה התאית על לבלב העכבר דרך חלון הדמיה מיוצב

Source: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital ...

Lepr

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video