This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب الحالية وفقا للإجراءات الأخلاق الحيوانية المحلية من جامعة كوينزلاند (التي وافقت عليها جامعة كوينزلاند، تشريحي جنة الأخلاقيات العلوم البيولوجية). 1. جزيرة العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الإنزيمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهضم البنكرياس، واستخدام خليط من liberase وكولاجيناز النوع الرابع. تمييع TL liberase (منخفض thermolysin) 1 قنينة من 5 ملغ مع 26 مل من DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كولاجيناز النوع الرابع في المخزن هانك بتركيز 0.5mg / مل، على أن تستكمل مع 5MM HEPES، 0.5MM CaCl 2، 0.1mg / مل الدناز و1mg / مل ألبومين المصل البقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط TL liberase والحلول كولاجيناز في نسبة 4: 1 (من حيث الحجم)، أي 4 مل liberase TL + 1 مل كولاجيناز. قسامة مزيج من الأنزيمات ل2.5ML كل وتخزينها في -20 ° C. ملاحظة: حضانة مرات الأنسجة الخامسآرى قليلا بين دفعات من انزيم (30 ثانية إلى 1 دقيقة الفرق). لذلك، قد تكون هناك حاجة إلى اختبار دفعة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI عزل وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل قنينة واحدة من RPMI 1640 المسحوق في 1 لتر من الماء في RT وتكملة مع 2 غرام NaHCO 3، 4.02 غرام HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين وسائل الإعلام العزلة RPMI في قارورة مخروطية كبيرة، مع مزيج النمام المغناطيسي، والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI الثقافة وسائل الإعلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام RPMI سائل الإعلام والثقافة، مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ المضادات الحيوية (مثل البنسلين 100 U / مل، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل جزيرة والتثقيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم أو CO 2 الخنق وفقا للإجراءات أخلاقيات المؤسسة المحلية. رش جسم الفأر تماما مع الايثانول 70٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإرواء البنكرياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> USE 2 التخفيضات طويلة أفقيا من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق لجعل رفرف على شكل حرف V. سحب رفرف من الجلد حتى كشف تجويف البطن بأكمله، وضعت جانبا الأمعاء والحفاظ على الكبد في مكان من المناديل الورقية المطوية للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة (الشكلان 1 و 2). وضع الحيوان بحيث اتجه نحو الجراح والذيل بعيدا عن الجراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق المشبك الأوعية الدموية في أمبولة على الحائط الاثني عشر لمنع الانزيمات حقن من دخول العفج (الشكل 1). ملاحظة: هذه خطوة مهمة لأنها تحدد ما إذا كانت الإنزيمات حقن سيذهب إلى القناة البنكرياسية ويروي البنكرياس أو الجزر إلى موقع الحقن (أكثر من الشبك) أو الخوض في الاثني عشر (تحت المشبك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة مع G إبرة 31 بالقرب من تقاطع القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية (الشكل 1)، وتترك مجالا لحقن الثاني إذا عشرفشل البريد البنكرياس ليروي للمرة الأولى. ببطء (أكثر من ~ 10 ثانية) ضخ حوالي 2 مل من خليط انزيم البارد في الماوس القناة الصفراوية المشتركة. ملاحظة: سيتم perfused لالبنكرياس بسرعة إذا المشبك هو في المكان المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف المشبك إذا كانت إبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة ولكن لا يمكن أن يروي البنكرياس (أي، نقل ما يصل المشبك قليلا بعيدا عن الكبد إذا كان أكثر من فرضت أو تحريكه لأسفل قليلا إلى الكبد إذا فرضت تحت). ملاحظة: إبرة يذهب في بعض الأحيان إلى الكبسولة المحيطة بدلا من تجويف القناة. وهناك علامة مفيدة للتحقق ما إذا كانت الإبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة هو تمدد القناة عند حقن. إذا فشل البنكرياس ليروي، والبديل هو يمكن حقن خليط انزيم إلى مواقع متعددة من البنكرياس مع انخفاض العائد المتوقع. نضح الموقع الأيسر من البنكرياس (الفص الطحال) مهم لتعظيم العائد جزيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد البنكرياس صerfused، بسرعة إزالة البنكرياس، ووضعها في قارورة (~ 20 مل، والزجاج)، واحتضان ل~ 19 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: فترة حضانة يمكن أن تختلف قليلا اعتمادا على سلالة الماوس والعمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة، إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة ~ 20 مل من وسائل الإعلام العزلة الباردة. هزة القارورة بلطف لتعطيل البنكرياس وتصب عليه من خلال غربال الشاي العادي (قطر المسام من 1 ملم) في أنبوب معقم 50 مل. ملأ الأنبوب مع وسائل الإعلام العزل والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيليه في وسائل الإعلام العزلة مرة أخرى، ونقل إلى اثنين من 15 مل أنابيب، ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. بعد تطلع طاف، مزج الكريات اثنين بشكل جيد مع 6 مل من وسائل الإعلام كثافة الفصل المتدرج الخلية (Histopaque 1077 الحل) في أنبوب من قبل vortexing أو pipetting صعودا وهبوطا. ثم إضافة بلطف ~ 6 مل من وسائل الإعلام العزلة إلى جانب أنبوب على رأسوسائل الاعلام فصل التدرج الكثافة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف في الأعلى (وسائل الإعلام العزلة)، الوسطى والدنيا (كثافة الخلية التدرج وسائل الاعلام فصل) طبقة في 3 أطباق منفصلة. انتقاء الجزر في هذه الأطباق 3، وذلك باستخدام ماصة تحت المجهر تشريح. ملاحظة: الطبقة الوسطى يحتوي على معظم الجزر. يتم الاعتراف الجزر عن الهياكل المدمجة من ~ 50-500 ميكرون في الحجم (الشكل 3). نحصل ~ 200 الجزر في الفئران WT و300- 100 &lt;الجزر في الفئران ديسيبل / ديسيبل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جزيرة التثقيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمساعدة الجزر على التعافي من انزيم الهضم والجماعات ثقافة 40 الجزر في 25 سم طبق بتري مع 6ML RPMI سائل الإعلام والثقافة (10MM الجلوكوز) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ / 95٪ CO 2 / O 2 ل2 قبل أيام من العيش -cell 2 الفوتون التصوير. تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوميا. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. يعيش الخلية 2 فوتون التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج الخلية العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصوديوم خارج الخلية غنية عازلة للمقايسة 2 الفوتون مع 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2.5 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 5 ملي NaHCO 3 و 10 ملي HEPES. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج الخلية صبغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمقايسة 2 الفوتون، وإعداد الأوراق المالية SRB 8 ملم في المخزن خارج الخلية، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في -20 ° C. تمييع SRB الأسهم 01:10 العازلة في الخلية الطازجة للحصول على تركيز العمل من 0.8 ملم. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير الفوتون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، قبل احتضان الجزر مثقف 2 يوما في 3 ملي العازلة خارج الخلية الجلوكوز لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: نحن نستخدم الجزر بين 2 و 5 أيام في الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، ضع شريحة زجاجية على غرفة التحكم الحرارية التي شنت على المسرح المجهر. استخدام الشحوم لمنع تسريب حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية غرفة مع 500 ميكرولتر من extracellجزيئية العازلة التي تحتوي على 0.8 ملي SRB مع تركيزات الجلوكوز مختلفة (3 ملم، 6 ملم، 15 ملم و 20 ملم الجلوكوز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، وضع جزيرة قبل المحتضنة في منتصف الغرفة والتركيز على 3-4 طبقات الخلايا في جزيرة حيث، في الجزر القوارض، المناعية للأنسولين يدل على أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا. ملاحظة: سيتم SRB الخطوط العريضة عن غشاء الخلية للجزيرة بسرعة وجزيرة جاهز للصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر 2 الفوتون مع الهدف 60X الغمر النفط (NA 1.42) وبرامج التصوير (على سبيل المثال، ScanImage 11). الشكل 4 يوضح ترتيب المجهر نموذجي. صورة أحداث exocytic باستخدام SRB كما غشاء impermeant علامة خارج الخلية الفلورسنت متحمس بواسطة نبضات ليزر الفيمتو ثانية في 880 نانومتر، مع مضان الكشف على 550-650 نانومتر. تسجيل استجابات جزيرة لتحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأحداث exocytic واحدة من قبل الظهور المفاجئ لبقعة صغيرة الفلورسنت (القرار 10 بكسل /1؛ م) وتأكيد من قبل مرحلة ارتفاع سريع للإشارة الفلورسنت على المنطقة ذات الاهتمام (~ 0.78 ميكرون 2). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li><li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell:+The+last+ten+years.">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li><li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperglycemia,+independent+of+plasma+lipid+levels,+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db/db+mouse+model+of+diabetes.">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li><li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models.">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li><li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+a+new+mutation+in+mouse.">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+deficit+in+islets+from+db/db+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells.">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell.">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

<html> العامل الأكثر أهمية في عزلة جزيرة هو نضح الأولي من البنكرياس. وتحت perfused لنتائج البنكرياس في أقل من ذلك بكثير العائد جزيرة. عوامل أخرى تؤثر أيضا على جودة العزل مثل الوقت الهضم ومستوى الهز الذي يمكن أن يعوض جزئيا عن مستوى التروية. على سبيل المثال، سوف تحتاج إلى البنك...

دور ضعف خلايا بيتا في المرض وقد تم الاعتراف على نطاق واسع 3،4. خطوط الخلايا مثل MIN6 وINS-1 هي أدوات مفيدة لفهم بيولوجيا السلوك خلايا بيتا. ومع ذلك، التحكم الفسيولوجية لإفراز الأنسولين تجري داخل جزر لانجرهانز. هذه الجزر تحتوي على الآلاف من خلايا بيتا معبأة بإحكام، وكذلك الأوعية الدموية وغيرها من أنواع الخلايا في الغدد الصماء. هذه البيئة داخل جزيرة يؤثر إفراز الأنسولين، ومن المرجح أن تكون مهمة في مرض السكري. لذلك، لفهم السيطرة الفسيولوجية لإفراز الأنسولين، والفيزيولوجيا المرضية للمرض، فمن الضروري لدراسة الجزر سليمة. جزيرة العزلة الجزر الإنسان الحي و، ولا سيما الجزر الإنسان من مرضى داء السكري من النوع 2 ويصعب الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك، الجزر البشرية لديها إمكانيات محدودة للتلاعب الجزيئية التجريبية. لذا استخدم الباحثون هويتيح من الحيوانات والنماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2. نموذج واحد من هذا القبيل هو مرض الماوس ديسيبل / ديسيبل. هذا هو طفرة تلقائية أن النماذج داء السكري من النوع 2 مع تطور النمط الظاهري الذي يوازي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر 5،6. بروتوكول المعروضة هنا للجزيرة بمعزل عن السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل لديه العديد من الخطوات المشتركة مع المجموعات الأخرى مع بعض التحسينات لأفضل عائد وتنقية وتعزيز بقاء الجزيرة. التصوير 2 الفوتون الخلية الحية فحص 2 الفوتون هو موضح هنا تمكن الباحثين من تحديد عدد وتقييم خصائص الحبيبات التي تحتوي على الانسولين واحدة من العديد من الخلايا من السكري 7 والنوع البري الجزر 8،9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liberase TL 5mg</td>
			<td style="width:173px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">-5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase type IV-1g</td>
			<td style="width:173px;">Gibco-Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histopaque 1077 500ml</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 Medium (10X) 1L</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R1383</td>
			<td>to prepare isolation media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 (1X) 500ml</td>
			<td style="width:173px;">Gibco-Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td>to prepare cultured media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin 100ml</td>
			<td style="width:173px;">Gibco-Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>to prepare cultured media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum 500ml</td>
			<td style="width:173px;">Gibco-Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td>to prepare cultured media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:173px;">Gibco-Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11966-025</td>
			<td>to dilute the liberase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metamorph program</td>
			<td style="width:173px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>to analyze the 2-photon images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

داء السكري من النوع 2 هو مرض مزمن يؤثر على 382 مليون شخص في عام 2013، ومن المتوقع أن يرتفع إلى 592،000،000 بحلول عام 2035 1. وخلال العقود الماضية 2، ودور ضعف خلايا بيتا في داء السكري من النوع 2 تم تأسيس بوضوح 2. وقد تطلب تقدم البحوث طرق لعزل الجزر البنكرياسية. بروتوكول للعزلة جزيرة قدم هنا أسهم العديد من الخطوات المشتركة مع البروتوكولات من المجموعات الأخرى، مع بعض التعديلات لتحسين المحصول وجودة من الجزر المعزولة من كل من النوع البري والسكري ديسيبل Lepr (ديسيبل / ديسيبل) الفئران. ثم ويرد الخلية الحية 2-الفوتون طريقة التصوير التي يمكن استخدامها لتحقيق السيطرة على إفراز الأنسولين داخل الجزر.

العائد جزيرة وتنقية لالعادي النوع البري الماوس، ومن المتوقع حوالي 200 الجزر. الجزر صحية تبدو مشرقة، على شكل دائري ولها حدود على نحو سلس. دفعة العزلة على هضم عادة الجزر الصغيرة وغامض في حين أن دفعة هضمها تحت ديها عدد أقل من الجزر وال...

Watch this Scientific Journal Video about Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets at JoVE.com

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.3K Views.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Video: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the major therapy, because islet transplantation has been limited by donor availability and by the need for long-term immunosuppression. Induced islet neogenesis by gene transfer of Neuogenin3 (Ngn3), the islet lineage-defining specific transcription factor and Betacellulin (Btc), an islet growth factor has the potential to cure type 1 diabetes.
Adenoviral vectors (Ads) are highly efficient gene transfer vector; however, early generation Ads have several disadvantages for in vivo use. Helper-dependent Ads (HDAds) are the most advanced Ads that were developed to improve the safety profile of early generation of Ads and to prolong transgene expression1. They lack chronic toxicity because they lack viral coding sequences2-5 and retain only Ad cis elements necessary for vector replication and packaging. This allows cloning of up to 36 kb genes.
In this protocol, we describe the method to generate HDAd-Ngn3 and HDAd-Btc and to deliver these vectors into STZ-induced diabetic mice. Our results show that co-injection of HDAd-Ngn3 and HDAd-Btc induces 'neo islets' in the liver and reverses hyperglycemia in diabetic mice.

We describe hepatic neo-islet formation in STZ (streptozotocin)-induced diabetic mice by gene transfer of Neurogenin3 (Ngn3) and Betacellulin (Btc) using helper-dependent adenoviral vector (HDAd) and the reversal of hyperglycemia. Our method takes advantages of helper-dependent adenoviral vectors with their highly efficient in vivo transduction and the long lasting gene expression.

الجدد في جزيرة تشكيل الكبد من الفئران من السكري من مساعد التي تعتمد على الغدانية نقل الجينات بوساطة ناقلات

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

التباين الديناميكي المحسن التصوير بالرنين المغناطيسي لنموذج مثلي سرطان البنكرياس ماوس

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

الإصابات الجراحية للماوس البنكرياس من خلال من ربط والبنكرياس القناة نموذجا للالغدد الصماء وخارجية الإفراز إعادة برمجة وانتشار

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

إينترابورتال زرع جزيرات البنكرياس في طراز الماوس

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

الطولية في التصوير فيفو و الكم من تطعيم جزيرة البنكرياس الإنسان والخلايا المضيفة المساهمة في غرفة العين الأمامية

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...