Name: leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
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This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

NOTA: Todos os presentes experimentos foram realizados de acordo com procedimentos de ética de animais locais da Universidade de Queensland (aprovados pela Universidade de Queensland, Comitê de Ética Biociências anatômica). 1. Isolamento Islet <ol><li> Preparação de reagentes <ol><li> Mistura de enzimas <ol><li> Para a digestão pancreática, utilizar uma mistura de Liberase e colagenase tipo IV. Diluir TL Liberase (termolisina baixo) 1 frasco de 5 mg com 26 ml de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium). </li><li> Prepare a colagenase de tipo IV, em tampão de Hank com uma concentração de 0,5 mg / mL, suplementada com 5mM de HEPES, 0,5 mM de CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNase e 1 mg / ml de albumina de soro bovino. </li><li> Misturar o TL Liberase e soluções de colagenase em uma proporção de 4: 1 (em volume), ou seja, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenase. Alíquota da mistura de enzimas para cada 2,5 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: Os tempos de incubação tecido vary um pouco entre os lotes de enzima (30 s a 1 min diferença). Portanto, um lote de ensaio pode ser necessária. </li></ol></li><li> RPMI Isolamento de mídia <ol><li> Dissolve-se um frasco de meio RPMI 1640 em pó em 1 litro de água à temperatura ambiente e completar com 2 g de NaHCO3, 4,02 g de HEPES. </li><li> Combinar a meios de isolamento RPMI num grande frasco cónico, misture com agitador magnético, ajustar o pH a 7,4 com NaOH, filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Meios de Cultura </li><li> Utilizar o meio de cultura RPMI, com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (isto é, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 ug / ml). </li></ol></li><li> A cultura e isolamento de ilhotas <ol><li> Sacrifício de Animais <ol><li> Sacrifique ratos por deslocamento cervical ou asfixia com CO2 de acordo com procedimentos de ética da instituição local. Pulverizar o corpo do rato cuidadosamente com etanol a 70%. </li></ol></li><li> Perfusão pâncreas <ol><li> VOCÊse duas longas cortes lateralmente através da pele abdominal e do peritoneu para fazer uma aba em forma de V. Puxe a aba da pele até descobrir toda a cavidade abdominal, pôr de lado o intestino e manter o fígado no lugar por um lenço de papel dobrado para revelar o ducto biliar comum (Figuras 1 e 2). Coloque o animal de modo que a cabeça na direção do cirurgião e da cauda longe do cirurgião. </li><li> Aplicar uma pinça vascular na ampola na parede do duodeno para bloquear as enzimas injectados de entrar no duodeno (Figura 1). NOTA: Este é um passo importante, pois determina se as enzimas injetadas vai para o ducto pancreático e perfundir o pâncreas ou refluxo no local da injecção (mais de pinça) ou ir para o duodeno (sob braçadeira). </li><li> Canular do ducto biliar comum com uma agulha G 31 perto da junção do ducto hepático comum e ducto cístico (Figura 1) e deixar espaço para uma segunda injecção se the pâncreas não para perfundir a primeira vez. Lentamente (mais de ~ 10 seg) injetar cerca de 2 ml de mistura de enzimas frio para o rato do ducto biliar comum. NOTA: Os pâncreas perfundido será rapidamente se a braçadeira está na posição direita. </li><li> Ajuste a posição da braçadeira se a agulha está dentro do ducto biliar comum, mas não pode perfundir o pâncreas (ie., Mover para cima a braçadeira um pouco longe do fígado se sobre apertada ou movê-lo um pouco para baixo para o fígado se sob apertada). NOTA: A agulha, por vezes, vai para dentro da cápsula, em vez de em torno do lúmen da conduta. Um sinal útil para verificar se a agulha está dentro do ducto biliar comum é a dilatação do duto, aquando da injecção. Se falhar o pâncreas para perfundir, uma alternativa é a mistura de enzimas pode ser injectado para múltiplos sítios do pâncreas com menor rendimento esperado. A perfusão do local esquerda do pâncreas (lóbulo esplénica) é importante para a maximização do rendimento da ilhota. </li><li> Depois do pâncreas é perfused, remover rapidamente o pâncreas, colocá-lo em um frasco (~ 20 ml, vidro) e incubar durante ~ 19 min num banho de água a 37 ° C. NOTA: O tempo de incubação pode variar um pouco dependendo da estirpe do mouse e idade. </li><li> Após o tempo de incubação, parar o processo de digestão por adição de ~ 20 mL de meio de isolamento frio. Agitar suavemente o frasco para interromper o pâncreas e derramá-lo através de um peneiro normal chá (diâmetro de poro de 1 mm) em um tubo estéril de 50 ml. Encher o tubo com meios de isolamento e centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora. </li><li> Dissolve-se o sedimento no meio de isolamento e transferir novamente para dois tubos de 15 ml, em seguida, centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora. Após a aspiração do sobrenadante, misturar as duas pelotas bem com 6 ml de meio de separação celular gradiente de densidade (Histopaque 1077 solução) por tubo em vórtice ou pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicionar suavemente ~ 6 ml do meio de isolamento para o lado do tubo na parte superior deos meios de separação por gradiente de densidade e centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C com freio fora. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante no (meio de isolamento) superior, média e inferior (densidade meios de separação de células gradiente) camada em três pratos separados. Handpick as ilhotas nestes três pratos, com uma pipeta sob um microscópio de dissecação. NOTA: A camada do meio contém a maioria dos ilhéus. As ilhotas são reconhecidos como estruturas compactas de ~ 50 a 500 um de tamanho (Figura 3). Obtemos ~ 200 ilhotas em camundongos WT e entre 300 e &lt;100 ilhotas em ratinhos db / db. </li></ol></li><li> A cultura ilhéu <ol><li> Para ajudar as ilhotas recuperar a partir da digestão enzimática, grupos de cultura de 40 ilhéus em 25 cm de placa de Petri com 6 ml de RPMI meio de cultura (10 mM de glucose) a 37 ° C, 5% / 95% de CO2 / O2 durante 2 dias antes vivo -cell imaging dois fótons. Alterar o meio de cultura diária. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Vivo celular 2-Photon Imagens <ol><li> Preparação do Reagente <ol><li> Tampão extracelular <ol><li> Preparar o tampão de sódio extracelular rico para o ensaio de 2-fótons com 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de NaHCO3 e 10 mM de HEPES. </li></ol></li><li> Extracelular Dye <ol><li> Para o ensaio de 2-fótons, preparar estoque SRB 8 mM em tampão extracelular, alíquota em pequenos tubos e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a SRB estoque 1:10 em tampão extracelular fresco para obter uma concentração de trabalho de 0,8 mM. </li></ol></li></ol></li><li> Photon Imagens <ol><li> Em primeiro lugar, pré-incubar 2 dias em cultura ilhotas em tampão extracelular de glucose 3 mM durante 30 min. NOTA: Nós usamos ilhotas entre 2 e 5 dias de cultura. </li><li> Em seguida, colocar uma lâmina de vidro para a câmara de controlo térmico montado na platina do microscópio. Use massa para evitar o vazamento de uma solução. </li><li> Cubra a câmara com 500 mL de extracelulartampão ular contendo 0,8 mM SRB com diferentes concentrações de glicose (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mM de glicose). </li><li> Em seguida, colocar a ilhota pré-incubados no meio da câmara, e se concentrar em 3-4 camadas de células na ilhota onde, nas ilhotas de roedores, a imunocoloração para a insulina mostra que a maioria das células são células beta. NOTA: O SRB vai delinear toda a membrana da célula da ilhota rapidamente e a ilhota está pronto para a imagem. </li><li> Usar um microscópio 2-fótons com uma objectiva 60X de imersão em óleo (1,42 NA) e software de imagem (por exemplo., Scanimage 11). A Figura 4 ilustra uma disposição típica de microscopia. Imagem eventos exocíticas usando SRB como uma membrana extracelular marcador fluorescente impermeant excitados por pulsos de laser de femtossegundos a 880 nm, com fluorescência detectada em 550-650 nm. Grave as respostas à estimulação de ilhotas. </li><li> Identificar eventos exocíticas único pela súbita aparição de uma pequena mancha fluorescente (resolução de 10 pixels /1; m) e confirme a fase de rápido crescimento do sinal fluorescente sobre uma região de interesse (~ 0,78 mm 2). </li></ol></li></ol>

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	<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li><li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell:+The+last+ten+years.">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li><li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperglycemia,+independent+of+plasma+lipid+levels,+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db/db+mouse+model+of+diabetes.">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li><li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models.">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li><li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+a+new+mutation+in+mouse.">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+deficit+in+islets+from+db/db+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells.">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell.">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

O factor mais importante no isolamento de ilhotas é a perfusão inicial do pâncreas; sob um pâncreas perfundido resultados com um rendimento de ilhotas consideravelmente inferior. Outros factores também afectam a qualidade de isolamento, tais como o tempo de digestão e o nível de agitação que pode compensar parcialmente o nível de perfusão. Por exemplo, um pâncreas perfundido totalmente terá de ser incubadas a 37 ° C durante ~ 18 min 30 seg, agitando suavemente, em contraste sob uma digerido pâncreas pode ...

O papel da disfunção da célula beta em doenças tem sido amplamente reconhecida 3,4. As linhas celulares tais como o MIN6 e INS-1 são ferramentas úteis para compreender a biologia do comportamento das células beta. No entanto, o controlo fisiológico da secreção de insulina tem lugar dentro das ilhotas de Langerhans. Estas ilhotas conter milhares de células beta embaladas apertadamente, assim como os vasos sanguíneos e outros tipos de células endócrinas. Este ambiente dentro do ilhéu influencia a secreção de insulina e é provável que seja importante na diabetes. Portanto, para compreender o controlo fisiológico da secreção de insulina, e a patofisiologia da doença, que é essencial para estudar ilhotas intactas. Isolamento de ilhotas Ilhotas humanos vivos e, em particular, ilhotas humanas de pacientes com diabetes tipo 2 são difíceis de obter. Além disso, ilhotas humanos têm possibilidades limitadas de manipulação molecular experimental. Os investigadores têm, por conseguinte, é empreguepermite que a partir de animais e em modelos animais de diabetes do tipo 2. Um modelo de doença, tais é o rato db / db. Esta é uma mutação espontânea que os modelos de diabetes tipo 2 com uma progressão fenótipo que se aproxima bastante doença humana 5,6. O protocolo apresentado aqui para isolamento de ilhotas de ratos db / db diabéticos tem muitas etapas em comum com outros grupos com alguns refinamentos para melhor rendimento, purificação e aumento da sobrevida das ilhotas. Imaging dois fótons A célula de ensaio directo de 2-fótons descrito aqui permite aos investigadores para quantificar o número e avaliar as características de grânulos individuais contendo insulina a partir de células de muitos diabéticos do tipo selvagem e 7 ilhotas 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>to prepare isolation media</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>to prepare cultured media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>to dilute the liberase</td></tr><tr><td>Metamorph program</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>to analyze the 2-photon images</td></tr></tbody></table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

A diabetes tipo 2 é uma doença crónica que afecta 382 milhões de pessoas em 2013, e espera-se aumentar para 592 milhões até 2035 1. Durante as últimas duas décadas, o papel da disfunção da célula beta em diabetes tipo 2 tem sido claramente estabelecida 2. O progresso da pesquisa tem necessários métodos para o isolamento de ilhéus pancreáticos. O protocolo de isolamento de ilhotas apresentado aqui compartilha muitos passos comuns com protocolos de outros grupos, com algumas modificações para melhorar o rendimento e qualidade de ilhotas isoladas, tanto do tipo selvagem e db Lepr diabético (db / db) camundongos. Uma célula-vivo método de imagem 2-fótons é então apresentado que possa ser usado para investigar o controlo da secreção de insulina dentro de ilhotas.

Islet rendimento e purificação Para um rato normal de tipo selvagem, são esperados cerca de 200 ilhotas. Ilhotas saudáveis ​​olhar brilhante, em forma redonda e tem uma borda lisa. Um lote de isolamento over-digerido tem geralmente pequenas e difusas ilhotas enquanto um lote digerido-under tem menos ilhotas e ilhéus celulares ligados acinares (Figura 3). Para ratinhos db / db diabéticos, o rendimento da ilhota e aparência depende da progressão da doença com melh...

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.4K visualizações.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Vídeo: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

Perto Tomografia Projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em Pesquisa do Diabetes

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

Medicina

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Imunologia e Infecção

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocal da imagem latente do Neuropeptide Y-pHluorin: uma técnica para visualizar a exocitose de grânulo de insulina em ilhotas murino e humanas intactas

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www.jove.com/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

Enxertia de ilhotas pancreáticas: um método para implantar ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho do camundongo para imagens in vivo

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa do câncer

Câncer Pancreático

Técnicas e ensaios

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Source: Park, I. and Kim, P. <a href="https://www.jove.com/v/62538">Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

Source: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital ...

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