עבודה זו נתמכה על ידי CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency הסכם YI-AI-6153-01, קרנות ביצוע עצמיות FDA ​​/ CBER, וה- FDA הנגד רפואי היוזמה. TCT, MNB, VPM, LMS, וKDK נתמכו על-ידי מינוי לתכנית להשתתפות במחקר במרכז להערכת ביולוגיה ולמחקר מנוהל על ידי Oak Ridge המכון לחינוך מדעי באמצעות הסכם Interagency בין departmen אנרגיה של ארה&quot;ב ובארה&quot;ב מנהל מזון ותרופות.

1. הכנת דילולי סדרה רגיל (איור 3 א) הערה: סדרת דילול סידורי של פלסמידים לינארית המכילים הרצפים ממוקדים על ידי מערכת Pr / Pb משמשות כסטנדרטים כמותיים לassay qRT-PCR. כל סט דילול סדרתי סטנדרטי לתת IFN מכיל נפח מספיק כדי לרוץ 90 צלחות assay. ארבע נקודות של עקומת הדילול הסטנדרטי המשמשת לassay נבחרו כדי לכסות ערכי ה- CT ממגוון של 20 עד 32 (טבלה 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה סטנדרטית (50 בצהריים) ו- DNA זרע סלמון (ssDNA, 10 מ&quot;ג / מיליליטר) פתרונות מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת ssDNA / מים לדילול 17 סטים סטנדרטיים על ידי ערבוב 51 μl של ssDNA עם 20.3 מיליליטר של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית רצועת PCR 8-צינור אחד עבור קבוצת דילול סטנדרטית. הערה: הכנת דילולים הסידוריים סטנדרטיים מפתרוני המניות תיקח 2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 190 μl של תמהיל ssDNA / מים לfצינור irst ברצועה ו -180 μl של ssDNA תערובת / מים לחמישה צינורות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול 01:20 על ידי העברת 10 μl מהמניות רגילות 50 בערב ועד הצינור עם 190 μl של ssDNA / המים, לערבב; מערבולת ובמהירות צנטריפוגות רצועת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול 1:10 על ידי העברת 20 μl מהצינור ביותר בדילול לאחרונה לצינור הבא בסדרה; מערבולת ובמהירות צנטריפוגות רצועת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.6 עד הצינור האחרון בסדרת הדילול קיבל הסטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.3-1.7 עבור כל תקן. </li></ol> ראה טבלה 3 להלן 2. הכנת פריימר / Probe (Pr / Pb) ואין תבנית הבקרה (NTC) עבודה בורסת תערובות (איור 3) הערה: כל 1.7 מיליליטר Pr / Pb להגדיר עובד מניות ו128.6 μl אין תבנית בקרה (NTC) עובד תמהיל המניה תעשה 30 צלחות assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Pr / Pb להגדיר תערובות המניה עובדות. לאE: הכנת סט Pr / Pb ומנייה עובדת NTC מתערבבת מפתרוני המניות תיקח 2-3 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פריימרים ובדיקות בבית 100 מיקרומטר עם מים טהורים להכנת פתרונות מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית עד שבע עשרה 2 צינורות מיליליטר; אחד עבור כל קבוצת Pr / Pb הכלול בassay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה פריימרים (100 מיקרומטר), בדיקות (100 מיקרומטר), וssDNA (10 מ&quot;ג / מיליליטר) פתרונות מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של ssDNA לכל צינור באמצעות פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. הוסף את פריימר קדימה המתאים, לאחור תחל, ולחקור לכל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה. ראה בטבלת 1 סטי Pr / Pb מיקוד תת IFN אדם וטבלה 2 למקוק רזוס סטי Pr / Pb. מוסיפים מים כדי להביא את עוצמת הקול של כל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה ל -200 μl. הערה: הנפח של פריימרים, בדיקה, ומים להוסיף תלויה בריכוז התגובה הסופי המבוקש לPr / Pbלהגדיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובות המניה NTC עובד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי רצועות PCR 5-הצינור לייבל למניות פועלות NTC מתערבבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 14.3 μl של כל Pr / Pb מוגדר צינור תערובת המניה עובדת המתאים NTC. ראה טבלה 4 לשילובי סט Pr / Pb לבארות NTC. מוסיף מים לכל אחד מהמנייה עובדת NTC מתערבב להביא את הנפח הסופי 128.6 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, צנטריפוגה בקצרה, ולמקם את הצינורות בחושך על קרח או ב -20 ° C לאחסון ארוך טווח. </li></ol></li></ol> ראה טבלה 4 להלן <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את Pr / Pb להגדיר מניות עובדות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרת aliquot של סטי Pr / Pb נדרשים לתערובות המניה עובדת NTC, להוסיף 1.5 מיליליטר של מים כדי להביא את הנפח הסופי של כל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה לרמה של 1.7 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, צנטריפוגה בקצרה, ולמקם את הצינורות בחושך על קרח או ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך יותר. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת לוחות assay 384 גם באמצעות pipettor רב-ערוצי האוטומטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מקור 96-היטב של סטי Pr / Pb ותערובות של NTC לaliquoting 384-גם צלחות assay. הערה: הכנת צלחת המקור מתערובות מניית פעולת Pr / Pb תיקח פחות משעה 1. כל צלחת מקור 96-גם היא מספיק כדי להפוך את שש צלחות 384 גם assay (איור 3 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בקצרה צנטריפוגות Pr / Pb להגדיר מניות פועלות ותערובות של המניה עובדת NTC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת 96-היטב חדשה בבלוק 96-היטב קירור מקורר ולייעד את הבארות עבור כל קבוצת Pr / Pb או NTC לערבב הבארות לקבל (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים עד לצלחת 96-היטב בעזרת פיפטה רבה 250 μl אלקטרונית: לוותר 66 μl מים לכל Pr / Pb להגדיר היטב (למעט 4 הבארות ליעד 17). לוותר 82.5 μl מים ל4 יעד 17 הבארות. לוותר 27.5 μl מים לכל תערובת NTC כן. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את Pr / Pb הנכון להגדיר עובד המניה לבארות המיועדות של הצלחת 96-היטב: לוותר 54 μl של Pr / Pb הנכון להגדיר עובד המניה לבארות המיועדות Pr / Pb הסט (למעט 4 הבארות ליעד 17). לוותר 67.5 μl של היעד 17 Pr / Pb להגדיר עובד המניה ליעד 17 בארות סט Pr / Pb המיועדים. להוסיף 22.5 μl של התמהיל הנכון NTC עובד המניה לבארות המיועדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 96-היטב עם חותם צלחת דבק ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 XG כדי להבטיח שהתוכן בחלק התחתון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת 96-היטב במיקסר המערבולת באמצעות מתאם צלחת 96-היטב ולערבב 1 דקות ב 1000 סל&quot;ד. צנטריפוגה הצלחת 96-היטב במשך 5 דקות ב 700 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צלחת מקור 96-גם בחושך על 4 מעלות צלזיוס אם באמצעות באותו היום, אחרת לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות assay 384 גם על ידי הוספת Pr / Pb מגדיר באמצעות pipettor רב-ערוצי האוטומטיים. הערה: הכנה של שש צלחות assay מצלחת המקור 96-גם תיקח 3-4 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע צלחות, מראש לצנן את קן הקירור עד 4 מעלות צלזיוס וחימום מוקדם של מאייד הצלחת 125 ° C וגוש החום התחתון עד 80 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר נושבת בין 20-25 ליטר לדקה (LPM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את pipettor רב-ערוצי האוטומטיים ולפתוח את הפרוטוקול להכנת לוחות assay IFN על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקנת הפלטפורמה, למקם את תיבת קצה pipet מלאה לחלוטין בעמדת פלטפורמת 1, 96-גם צלחת המקור בעמדת 4, וצלחת 384 גם חדשה בעמדה 6. בגין הריצה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. הערה: בסיומה של ריצה, כל טוב יכיל 5 μl של תמהיל Pr / Pb. הערה: הסכום הסופי של ssDNA הוסיף לכל טוב של צלחת assay 384 גם היא 0.025 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את צלחת assay 384 גם על משטח שטוח כדי להבטיח נוזלים נמצאים בתחתית של הבארות וליישם דבקחותם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחת 1 דקות ב 700 x גרם. הסר את חותם צלחת הדבק, למקם את צלחת 384 גם assay לתוך מייבש הצלחת ולמקם את סעפת 384 גם ישירות מעל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התוכן של הצלחת 384 גם assay יבש, להחיל חותם צלחת דבק חדש, לעטוף בנייר כסף, תווית, וחנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הערה: ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים 3.2.3-3.2.6 עד 6 x 384 גם צלחות assay מוכנים או הנוזלי בצלחת מקור 96-גם מרוקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את קן הקירור, סגור את התוכנה, ולכבות את pipettor רב-ערוצי האוטומטיים. כבה את מייבש הצלחת. </li></ol></li></ol> 4. טעינה והפעלה פלייט 384 גם Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני גן המשק (HKG) גם תערובות, אשר מורכבת של קבוצת Pr / Pb לHKG, ssDNA, תערובת אמן PCR, ומים, שיש להוסיף לצלחת 384 גם assay מיובש ( <strong&gt; איור 3D). הערה: הכנת תערובות וטעינת צלחת assay תיקח 1-2 שעות. ריצת צלחת assay תיקח פחות משעה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית צינור 1.5 מיליליטר לכל תערובת HKG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 2 μl של ssDNA (10 מ&quot;ג / מיליליטר) עם 84.9 מים μl. הוסף 2 μl של ssDNA המדולל, 11.8 μl מים, 23 μl של תערובת אב, ו -9.2 μl של 20x הנכון HKG Pr / Pr להגדיר על צינור אחד, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש dehydrogenase glyceraldehyde-3-פוספט (GAPDH) ו- C יוביקוויטין (UBC) כHKG עבור assay האדם (ראה לוח חומרים). השתמש GAPDH וRNA ריבוזומלי 18S כHKG עבור assay רזוס. הערה: HKG משמש לביצוע assay גמיש וצריך לשקף את הגנים מתאימים לסוג התא שנבדקה GAPDH, UBC, ו18S הם דוגמאות לHKG נפוץ;. HKG האחר עשוי להיות מתאים יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם וpositive לשלוט גם תערובות, אשר מורכבת של המדגם או cDNA שליטה החיובי, תערובת אמן, ומים, שיש להוסיף לצלחת 384 גם assay מיובש. הכן את המדגם ותערובות שליטה החיוביות במספיק כמות לוותר עד 21 בארות צלחת (איור 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סינתזת cDNA, בצע את הוראות היצרן כדי להכין את דגימות RNA בצעד עיכול DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות ובקרה חיובית מראש מסינתזת cDNA של לפחות 500 ננוגרם של RNA ואחריו טיפול עם RNase H (נפח סופי של 24 μl עבור כל דגימה) הבאים הוראות היצרן. אחסן את cDNA מוכן ב -20 ° C עד לשימוש. הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה cDNA המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 78.8 μl של תערובת אמן ו54.8 μl מים לכל דגימה 24 μl וצינור ביקורת חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בקצרה צנטריפוגות הצינורות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסטנדרטים וNTC גם מתערבב, consisting של תערובת אמן ומים, שיש להוסיף לצלחת assay 384 גם מיובש (איור 3D). לסטנדרטים גם לערבב, להוסיף 165 μl מים עד 275 μl של תערובת שני בצינור 1.5 מיליליטר. לNTC גם לערבב, להוסיף 52.5 μl מים ל52.5 μl של תערובת שני בצינור 1.5 מיליליטר. מערבולת בקצרה צנטריפוגות הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת assay 384 גם מיובשת לטעינה של תערובות ודוגמאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחת מיובשת 384 גם assay מ4 ° C ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על בלוק 384 גם קירור מקורר, להסיר את חותם צלחת הדבק ולהתוות את הבארות של הצלחת לייעד בי תערובות ודוגמאות השונות יהיו pipetted (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת assay 384 גם עם תערובת היטב סטנדרטית, סטנדרטים, NTC גם לערבב, דגימות, בקרה חיובית, ותמהיל HKG (איור 3E). כל הפתרונות וורטקס ו צנטריפוגות לזמן קצר לפני הניפוק לצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 6 μl של הסטנדרטים ולערבב היטב כל אחד סטנדרטי עם פיפטה הרבה האלקטרונית 30 μl. לוותר 1.5 μl של דילול סדרתי הסטנדרטי הנכון למיועד גם עם פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 7.5 μl של NTC גם לערבב לכל NTC היטב עם פיפטה הרבה האלקטרונית 30 μl. לוותר 7.5 μl של המדגם לבארות המיועדות עם פיפטה רבה 30 μl האלקטרונית. לוותר 2.5 μl של HKG Pr / Pb תערובות לבארות המיועדות עם פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את כל בארות ריקות עם 7.5 μl של תערובת מים ותערובת אמן שאריות עם פיפטה הרבה אלקטרוני 30 μl; 7.5 μl מים לבד יעבוד גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 384 גם assay עם סרט הדבק האופטי ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 x גרם. מערבולת הצלחת 384 גם האטום במיקסר המערבולת 2 דקות ב2,600 סל&quot;דוצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 700 x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת assay 384 גם האטום במכונה qRT-PCR, לפתוח את התבנית לפריסת assay ולהתחיל לרוץ. תוצאות ניתן לייצא כגיליון אלקטרוני או כקובץ טקסט לניתוח: הערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתנאים התרמיים אופטימליים הבאים תגובת Cycler עבור assay: i) 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ii) 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, iii) 95 מעלות צלזיוס למשך 25 s, iv) 59 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. חזור על השלבים III ו- IV במשך 40 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים הגולמיים מפלטפורמת qRT-PCR ליישום תוכנת גיליון אלקטרוני. עלילה כל תקן שנקבע כעקומה סטנדרטית להתבונן ליניאריות 4 נקודות. ביצוע ניתוח על ידי חישוב ΔCq או על ידי עותק מספר מבוסס על העקומות סטנדרטי ארבע נקודת 27. </li></ol></li></ol> ראה איור 3 להלן

<ol>
	<li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+antiviral+immunity.">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li><li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons,+interferon-like+cytokines,+and+their+receptors.">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li><li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses:+cellular+receptors+and+their+substrates.">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex.">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li><li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes.">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1,+STAT2,+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage.">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li><li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+genes:+a+complex+web+of+host+defenses.">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li><li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses.">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li><li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+soluble+alpha/beta+interferon+(IFN)+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN.">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus.">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li><li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape.">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li><li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+autoimmunity:+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases.">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li><li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy.">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li><li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis.">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li><li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon.">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li><li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+hepatitis+C.">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li><li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li><li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia.">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li><li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia.">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27:+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure.">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha+Acts+on+the+S/G2/M+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line.">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li><li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+(pDCs)+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes:+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production.">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li><li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming.">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li><li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons.">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li><li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons.">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li><li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genomic+data+in+the+discovery,+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family.">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933 (2009).</li><li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent.">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li><li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I,+II,+and+III+interferon+and+their+subtypes.">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li><li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid.">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li><li>Little, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-refractory+mutation+system+(ARMS)+analysis+of+point+mutations.">Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.</a> Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

דו&quot;ח זה מתאר עיצוב, ייצור אצווה, וגישה כלפי ניתוח של assay למדוד שעתוק של קבוצה של גנים דומים מאוד בהגדרת מעבדת מחקר. Assay qRT-PCR תפוקה הגבוהה דיווח כאן מודד את IFN- ו-- תת λ עם סגוליות גבוהות. שיטה זו כרוכה שני היבטים מרכזיים, העיצוב של סטי Pr / Pb שמפלים בין בני משפחת גן הומולוגי והפיתוח של פלטפורמת הפקה ליצירת צלחות assay אמינות ועקביות 384 גם מראש עם סטי Pr / Pb. בדיקות qRT-PCR לשלב או כימי גישה מבנית (MB) (LNA) לקראת שיפור הסגוליות שלהם 29. לשתיים מקבוצות פריימר בassay רזוס (הטבלה 2), מערכת ההגברה-עקשן מוטציה (נשק) שולבה ברצפי פריימר כדי לשפר את הספציפיות 30 נוסף. בזמן שהוא בדרך כלל הטוב ביותר כדי למקד את צמתים אקסון-אקסון לenhaהספציפיות פליטות של תגובת qRT-PCR, זה לא היה אפשרי בגלל הסוג אני IFN גנים אין אינטרונים. לכן, הדנ&quot;א הגנומי יהיה מוגבר בתגובת PCR, והוא חייב להיות מושפל על ידי טיפול DNase לאחר מיצוי RNA. אזור היעד לסטי Pr / Pb הוגבל לאזורי הקידוד של פפטיד הבוגר לכל IFN. בגלל דמיון רצף הגבוה בקרב תת IFN-α, במיוחד באזור פפטיד הבוגר, זה היה לפעמים יש צורך להתפשר רגישות כדי להבטיח סגוליות. זה היה במיוחד המקרה עם IFN-α17, שבו יש לו את תמליל פפטיד הבוגר רק ארבעה בסיסים ייחודיים בהשוואה נגד תת IFN-α האחר. IFN-α17 מיקוד הנדרש פריימרים המחייבים את התמלילים של תת מרובים, הגבלה ספציפי לבדיקה. כתוצאה מכך, תגובת PCR תגביר סוגים אחרים מאשר IFN-α17, ובכך לצרוך אחוז ניכר של חומרים כימיים PCR וlowering את המשרעת של אות הקרינה מהבדיקה הספציפית לIFN-α17. אתגר נוסף לעיצוב סטי Pr / Pb רגישים וספציפיים לגנים דומים מאוד כגון IFN הוא האפשרות שהרצפים באתר GenBank המבואר לא יכולים להיות מלאים או מקיפים בזמן של עיצוב. שוב, זה היה אתגר עבור IFN-α17, שבו רצפים מבואר חדש לא ליישר באופן מושלם עם הגרסה של הרצף באתר בעת העיצוב. לכן, בעת תכנון Pr / Pb מציב לגנים שלא נחקרו באופן אינטנסיבי, זה חכם כדי לבדוק את הרצף המבואר האחרון של גן יעד מעת לעת. לבסוף, יש צורך להבטיח שקבוצות Pr / Pb לא להגביר פסוידו-שניתן עיבד אבל לא תורגם. לאחר עיצוב סטי Pr / Pb, האתגר הבא הוא אופטימיזציה תנאי PCR של שבע עשרה Pr / Pb שונה קובע בצלחת אחת 384 גם. סטנדרטים תמליל הם important בבדיקת הספציפי של קבוצת Pr / Pb ולהיות חיוניים להרמונית תנאי qRT-PCR של PCR התגובות השונות ומשונות. בדיקת סט Pr / Pb נגד הסטנדרטים התמליל קובעת את היעילות והרגישות שלה; פלסמידים המבטאים פסוידו-דומה מאוד עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי Pr / Pb להגדיר באופן סלקטיבי מודד שעתוק של הגן הפונקציונלי. הסטנדרטים התמליל גם לספק אמצעים כמותיים של ניתוח (מספר התמלילים), בנוסף לחצי כמותית הניתוח יחסית לגן משק (ΔCq). pipetting רב-ערוצי רובוטית מצלחת מקור 96-היטב לתוך צלחות assay 384 גם מרובות משפר את הדיוק ועקביות של תוצאות בין-צלחת. DNA זרע סלמון (ssDNA) משמש כנשא שמייצב ומשמר את סטי Pr / Pb לאחסון ארוך טווח, כפי שעושה ייבוש ריאגנטים לוותר לתוך הצלחות. ייבוש הצלחות גם מקטין את הנפח של התגובההכרחי לתוצאות לשחזור, אשר בתורו שומרת דגימות יקרות ומפחיתה את השימוש בחומרים כימיים יקרים. באמצעות צעדים אלה, קבוצות של צלחות הם התאספו המספקות דיוק ועקביות במשך יותר משישה חודשים. בעקבות הכנת צלחת, אמצעי בקרת איכות הוא קריטי כדי לבדוק את העקביות של קבוצה של צלחות. לצורך כך, ארבע קבוצות נוספות של סטנדרטים מנוהלות על צלחת. הצלחת &quot;סטנדרטי 5x&quot; עוקבת אחר ביצועים ויוצרת מערך נתונים שהסטנדרטים של צלחת פרט בהשוואה. בעוד עשרה דילולים של פי 10 של כל תקן משמשים במהלך עיצוב assay, שיקולי החלל דורשים כי ארבע נקודות משמשות לעקומה סטנדרטית על כל צלחת assay, ולצלחת סטנדרטית 5x. בנוסף, בקרה חיובית צריכה להיות כלולה בכל צלחת כדי להבטיח את תוקפו של הצלחת. בדרך כלל, זה לוקח 3-4 שעות כדי להכין את שש צלחות assay מאחד Pr / Pb שלצלחת ource; זה אפשרי להכין שתים עשרה צלחות ביום אחד במעבדת מחקר. מאז כל צלחת assay תת אנושית IFN בוחנת שבע עשרה סטי Pr / Pb ויכולה להכיל חמישה עשר דגימות ניסוי, יום אחד של הרכבה מייצר קבוצה של צלחות עם היכולת לייצר עד 3,060 נקודות נתונים ניסיוניות. נתונים גולמיים מפלטפורמת qRT-PCR יכולים להיות מעובד ונאספו באמצעות תסריטי תכנות בתוכנת יישום גיליון אלקטרוני כדי למלא תבנית ניתוח מוגדרת מראש באופן אוטומטי. שיטה זו מקטינה את ידיים על הזנת נתונים, טעויות העתקה ובכך למנוע ומאפשרת לחוקר להתמקד בניתוח נתונים ולא הרכבה נתונים. כפי שתואר כאן, assay qRT-PCR תפוקה גבוה זה יכול להיות מיושם על מנת למדוד את הביטוי של תת אינטרפרון בדגימות מקוק רזוס אדם או ויכול להיות מותאם לשימוש עבור מינים אחרים או קבוצות גן הומולוגיות. הגמישות של פריסת הצלחת מאפשרת למשתמש לשנות את פריימר / בדיקה קובעת להתאים את הגנים שלריבית כלפי מערכת מודל סוג תא מסוים או. assay זה יכול להיות מיושם למדידת חתימות ביטוי IFN בדגמי תרבית תאים לומדים פתוגנים או בדגימות מטופל בהקשר של מודלים מחלה על מנת להבהיר את מנגנוני האיתות מעורבים בתגובה חיסונית.

סוגי I ו- III אינטרפרונים (IFN) הם קריטיים בתגובה החיסונית לוירוסים וגירויים פתוגניים אחרים ובהווה בכל החוליות 1. תאי מערכת חיסון ואינו חסינים להביע ולהפריש, כמו גם להגיב ל, IFN 2. חיישני חיסון מולדים, כגון קולטנים לחיוג כמו (TLR), סטינג, וRIG-אני, לגרום לי סוג וביטוי III IFN על זיהוי של דפוסי הפתוגן קשורים מולקולריים (PAMP) 3,4. בבני אדם, סוג אני IFN כולל IFN-β, -ω, -κ, ו -12 תת-סוגים של IFN-α, ונקשר לרצפטור IFNAR1 / IFNAR2 המורכב 2,5. סוג III IFN כולל IFN-λ1, -λ2, ו-λ3 ולהיקשר לקולטן המורכב IL10RB / IL28RA 2. קלסי, סוגי I ו- III IFN נקשרים לקולטן מתחמים המיוחסים להם שלאחר מכן לגייס STAT1 / heterodimers STAT2 וליזום שעתוק של גני אינטרפרון מגורה (ISG) 6. ISG מעורב במגוון הרחב של פונקציות, מנגיפים ואנטיפעילות שגשוג להפעלה של התגובה החיסונית אדפטיבית 7. מנגנונים הרבים פתוגנים התפתחו כדי להתחמק, ​​לערער, ​​ולחטוף את האלמנטים של מסלול איתות IFN להדגים את החשיבות של IFN בתגובה החיסונית המולדת 8. לדוגמא, וירוס vaccinia מבטא קולט דמה עם ההומולוגיה IFNAR1 שsequesters הקלד אני IFN 9 בעוד וירוס מחלה דמוי Yaba מפריש גליקופרוטאין שמעכב הקלד I ו- III IFN חלבונים 10. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, IFN גם מעורב במעקב הסרטן ומספר מחלות אוטו-דלקתי: השתקת ביטוי IFN בתאי סרטן השד מגבילה immunosurveillance 11, ייצור יתר של IFN-α הוא מנגנון בפיתוח מערכתי זאבת אדמנתית 12, והפעלה תועה של סטינג מובילים לדלקת מערכתית הנגרמת על ידי כמויות עודפות של IFN בvasculopathy הקשורים STING13. טיפולי, IFN משמש לטיפול בטרשת נפוצה 14, זיהומים נגיפיים כרוניים כגון 15 HBV ו- HCV 16,17, וסוגי סרטן כמו לוקמיה שעיר תא 18 ולוקמיה מיאלואידית כרונית 19. שאלות על הרלוונטיות של IFN בתהליך פיסיולוגי מסוים ברציפות לחשוף את הטבע בכל מקום של משפחת ציטוקינים זה. הקלד אני IFN, במיוחד תת IFN-α, נחשב לעתים קרובות כישות אחת 20-23, ולא כקבוצה קשורה באופן הדוק, אך ברורה, חלבונים. הקיום וההתמדה של מיני IFN המרובים כולל תת IFN-α, לאורך האבולוציה חוליות 24 מצביעים על כך שלפחות קבוצת משנה של תת אלה יש פונקציות ספציפיות או ייחודיות. ייתכן שדפוסי ביטוי IFN הגדרה יהיו לפענח ולעזור לאפיין את הפונקציות הספציפיות של אחד או יותר מתת 17. האתגר של לימוד tהוא מקליד תת I ו- III IFN מבוסס על זהות הרצף המשותפת שלהם: שנים עשר תתי הסוגים IFN-α לשתף&gt; 50% 25 ותת IFN-λ לשתף 81-96% 26 של רצפי חומצות אמינו שלהם. בassay qRT-PCR שתואר, משואה מולקולרית (MB) וחומצות גרעין נעולות (LNA) בדיקות ניאון להפלות הבדלי זוג בסיס יחידים בין הרצפים תת סוג IFN דומים מאוד ומאפשרים האפיון של חתימת ביטוי IFN. פורמט הצלחת 384 גם של assay כולל שני (סטנדרטים פרוטוקול) כמותי ו( גני משק הבית (HKG)) חצי כמותית אמצעים, המאפשר ניתוח על ידי עותק תמליל מספר וΔCq בהתאמה. הרכבה אצווה, בהנחייתם של pipetting אוטומטית רבת ערוצים, ואחסון לטווח ארוך, אפשרית באמצעות ייבוש פריימר / הבדיקה (Pr / Pb) קובעת על הצלחות, לשפר את שחזור, שירות, והמעשיות של assay. פרוטוקול זה מתאר את התהליךלהכנת 384 גם צלחות assay qRT-PCR (איור 1) עם עד שבעה עשר קבוצות שונות Pr / Pb מיקוד תת אנושי IFN (טבלת 1). Pr / Pb להגדיר עובד צלחות מקור המניה (איור 2) משמשות להכנה מרובה 384 גם צלחות assay בתהליך שיכול להיות אוטומטי באמצעות pipettor רב-ערוצי רובוטית. בעוד ההתמקדות הראשונית הייתה על יצירת פרוטוקול ללימוד חתימות ביטוי IFN אדם, שיטה זו יושמה על קופי רזוס, כמו גם. למרות צלחת הפריסות שונות במקצת וסטי Pr / Pb (טבלת 2) נבדלים, שיטת ההכנה כוללת ליצירת הצלחות האנושיות ורזוס היא זהה. עם שינויים מינימאליים של הפרוטוקול, השיטה יכולה להיות מוצאת להורג, כדי לאפשר פיתוח של מבחני ללמוד קבוצות אחרות של גנים הקשורים באופן הדוק. דמויות ראו 1 ו -2 להלן ראה לוחות 1 ו -2 Below

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

Assay qRT-PCR מתואר יכול להיות מיושם לנתח דפוסי ביטוי של סוגי I ו- III IFN במגוון רחב של סוגי תאים והקשרים. לדוגמא, אני סוג של אדם וחתימות ביטוי III IFN נותחו בתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMC) מ -6 תורמי מגורה עם ligands TLR; LPS C (25 מיקרוגרם / מיליליטר), (10 מיליליטר / ng), imiquimod (10 מיקרומטר), וoligonucleotides CPG (1 מיקרומטר) (איור 4): פולי אני. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת יישום גיליון אלקטרוני ומוצגים כתרשימי רדאר עם תת IFN-α מסודר בכיוון השעון לפי עץ פילוגנטי של רצף החלבון שלהם 27. תרשימי הרדאר של ביטוי IFN האנושי מוצגים בקנה מידת יומן מחושב באמצעות שתי שיטות שונות של ניתוח שולב בעיצוב assay: ערך CQ מוחלט המנורמל לHKG (ΔCq), ולהעתיק את מספר התבנית למיקרוגרם (מק&quot;ג) של רנ&quot;א הכל . ערכי מספר עותק מחושבים מo התוצאות<html> עקומת הסטנדרט של תמליל fa. הנתונים מראה כי חתימות ביטוי אנושיות IFN שהושרו על ידי אגוניסטים TLR הן יגנד ספציפיים. ראה איור 4 להלן כפי שהודגם לחתימות ביטוי IFN האנושיות, חתימות ביטוי של סוגי I ו- III IFN בקופי רזוס היו גם יגנד TLR הספציפי. PBMC מ 3 תורמים היו מגורה עם פולי אני: C (50 מיקרוגרם / מיליליטר), LPS (10 מיקרוגרם / מיליליטר), וimiquimod (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 3 שעות (איור 5). הביטוי תת סוג IFN בתאי unstimulated בתחילת המחקר היה נמוך. מספר מוגבל של IFN- תת באו לידי ביטוי בתגובה לLPS ופולי אני: C. בניגוד לכך, ביטוי IFN בתגובה לimiquimod היה גבוה והביטוי תת הסוג היה רחב. ביטוי של IFN-β וIFN-λ1 היה מוגבר על ידי כל שלושת TLR אגוניסטים 28. ראה תרשים 5 להלן תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> איור 1:. מספר הפריסה לצלחת 384 גם assay עם שבע עשרה סטי Pr / Pb יעד מתייחס לסט Pr / Pb. עקומות ארבע הנקודה סטנדרטית (המשולש אפור כהה) מתווספות לעמודי 1-5. סטי HKG Pr / Pb (הרקע לבן) מתווספים לעמודי 6 ו -7 עמודים שנותרו, 8-24, הם ספציפיים לאחד משבעת-העשרה סטי Pr / Pb. דוגמאות נוספות לשורות AP, מעמודים 6-24 (חיצים שחורים). שתי הבארות (O5, P5) בחלק התחתון של עמודה 5 מקבלות רק מים ותערובת אמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> איור 2:. הפריסה לצלחת מקור 96-היטב עם שבע עשרה סטי Pr / Pb מספר היעד מתייחס לPr / Pbלהגדיר. חיצים שחורים מייצגים כאשר סט Pr / Pb מתווסף בארות מרובות. תערובות NTC מתווספות לבארות המיועדות (הרקע אפור כהה). שתי הבארות (F3, G3) עם קווים אלכסוניים הן שאינן בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> איור 3: סכמטי של צעדים ספציפיים בפרוטוקול assay qRT-PCR תרשים AE לבחור חלקים מהפרוטוקול.. (א) שלב 1: הכנת דילולים סדרתי סטנדרטיים. הכנת תערובות המניה עובדת Pr / Pb וNTC: שלב 2 (ב). הכנה של צלחת מניות 96-גם עבודה של סטי Pr / Pb ותערובות של NTC: שלב 3.1 (C). שלב (D) 4.1-3: הכנת התערובות לטעינת צלחת 384 גם assay. (E) Step 4.5: טעינת צלחת 384 גם assay. תרשימים נקראים משמאל למעלה בפינה הימנית התחתונה. ריאגנטים לאינטרפרון assay (IFN) מאוחסנים ב -20 מעלות צלסיוס ושמותיהם מופיעים בעמודה השמאלית; פעולות נפרדות קווים בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> איור 4: החתימה האנושית ביטוי IFN בתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) שונה בתגובה לligands TLR משמש לגירוי PBMC היו מגורה עם ligands TLR וRNA היה לקצור לניתוח qRT-PCR.. האמצעים הגיאומטריים של תגובות השיא לפולי אני: C (25 מיקרוגרם / מיליליטר) בשעה 8 שעות (ריבועים אדומים), LPS (10 ng / ml) בשעה 4 שעות (משולשים ירוק), imiquimod (10 מיקרומטר) בשעה 16 שעות ( יהלומים סגולים), CPG (1 מיקרומטר) ב16 שעות (עיגולים שחורים), ושליטה unstimulated ב 16 שעות (עיגולים כחולים) מ -6 תורמים מוצגות ביומן 10 בקנה מידה כפונקציה של ביטוי של HKG UBC ΔCq (משמאל) או כעותק מספר לכל מיקרוגרם של RNA (מימין) . תת IFN-α מסודרים על פי עלילת פילוגנטי דמיון רצף חומצות האמיניות. נתון זה פורסם במקור באימונולוגיה והביולוגיה של תא 27. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> איור 5:. חתימת רזוס IFN מקוק הביטוי בתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) שונה בתגובה לligands TLR משמש לגירוי PBMC משלושה קופי רזוס (שנקבע על ידי רבוע, יהלומים, ומשולש) היו מבודד מכל דם ו מגורה עם lipopolysaccharide (LPS) (10 מיקרוגרם / מיליליטר), פולי אני: C (50 מיקרוגרם / מיליליטר) או imiquimod (10 מיקרוגרם / מיליליטר). תאים נקצרו ב0 שעה (אופn צורות) או אחרי 3 שעות של גירוי TLR (צורות סגורות) למדידת ביטוי IFN. רמות התמליל אני סוג, II ו- III IFN מוצגות ביומן 10 בקנה מידה כפונקציה של ביטוי של HKG GAPDH ΔCq (משמאל) או כRNA מספר / מיקרוגרם עותק (מימין). נתון זה פורסם במקור בכתב העת של אינטרפרון וציטוקין המחקר 28. <img alt="טבלת 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> טבלה 1:. רצפי סט פריימר / בדיקה IFN אדם ותגובת מידע <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> טבלה 2:. רצפי סט מקוק רזוס IFN פריימר / בדיקה ותגובת מידע <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> ריכוז פלסמיד (FM) </td></tr><tr><td></td><td> </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2,500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> לוח 3: מידע ריכוז סט דילול רגיל. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> סטי IFN Pr / Pb הוסיפו </td><td> נפח מים מוסף (מיליליטר) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> לוח 4: המניה עובדת NTC מתערבבת מידע.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes at JoVE.com

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Views.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

Video: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

חרוז מבוסס Assay מולטיפלקס לניתוח של פרופילים ציטוקין דמעה

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

ללא תווית זיהוי של לימפוציטים יחוברו באמצעות הדמיה תלת פאזה כמותית, מכונת למידה

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...