עבודה זו נתמכה בחלקה NIH מענקים R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, No1-HHSN26600500032C (ל SM). אנו מודים לחברי המעבדה שלנו לעזרה דיון טכני, טינה הייל לבדיקה ביקורתית של כתב היד. אנו רוצים להודות דוד בינה, מילווקי מחלקת הבריאות המעבדה התרבות נגיף ו-PCR.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

ההתפרצות האחרונה של מגפת שפעת העופות בדרום מזרח אסיה הפחד העולמי של מגיפת שפעת החזירים להטיל חששות עצומים לבריאות ובטיחות הציבור. מוקד קריטי הוקדשו לייצר חיסונים עבור זנים קיימים יותר של נגיף השפעת. הזמינות של תפוקה גבוהה טכנולוגיות מהירות לגילוי מדויק מדויק חישובים titer ויראלי יהיה מאוד לשפר את הטיפול. הטכניקות הנפוצות ביותר המועסקים לחשב כייל הנגיף כוללים להרכיב שפעת פלאק מבחני hemagglutination. Assay פלאק ויוצרים פותח לראשונה להעריך titers bacteriophage ואומצה על ידי רנאטו Dulbecco לחשב titers נגיפי בעלי חיים 4. כדי לבצע assay, של פי 10 דילולים של המניה שפעת או דגימות מן החי כמו נוזל BAL ערוכים 0.1 aliquots מ&quot;ל הם מחוסן על monolayer של תאים MDCK ב 6 גם הצלחות. וירוס מותר לספוג אל התאים MDCK ואחריו למודעהdition של המדיום מאוזנת של מזון agarose. במהלך הדגירה, התאים הנגועים המקוריים לשחרר את הצאצאים ויראלי שהתפשט רק על תאים שכנים. אפקט cytopathogenic של זיהום נגיפי שפעת מייצרת אזור מעגלי של תאים נגועים בשם פלאק. רובד זה הוא נוצר ככל הנראה לאחר ההדבקה של תא יחיד עם חלקיק וירוס אחד ואחריו שכפול הנגיף. הניגוד בין תאים חיים לבין פלאק ניתן לשלב צבעים כגון: סגול קריסטל. החיסרון העיקרי של assay זה חוסר שחזור ווריאציות ענק בתוך ניסויים. עוד assay לקביעת כייל שפעת נגיפית היא assay hemagglutination. כיום חלבון hemagglutinin על פני השטח של נגיף השפעת ביעילות נקשר N-acetylneuraminic חומצה המכילים חלבונים על יונקים העופות כדוריות דם אדומות 1. זו האינטראקציה בין נגיף השפעת לבין אריתרוציטים מוביל הצטמדות בצורה של סריג. אניאיול של הצטמדות משמש לאמוד את כייל של וירוס שפעת דגימות הבדיקה. Assay הצטמדות כדורית אדומה משמש רק כדי לקבוע את טיטרציה של וירוס ידוע ולא ניתן להשתמש בו למטרות זיהוי זן. מאז assay זה אין הבדל בין חיים לבין וירוסים מתים, קשה לקבל חישוב מדויק של titers ויראלי. אבחנות קליניות נוכחיות של דלקות שפעת מבוססים על בדיקה סרולוגית, תגובת שרשרת פולימרז, immunofluorescence הדגימה ישיר תרבית תאים 1,6. השיטה החדשה המתוארת כאן יש גם פוטנציאל אבחון קליני במעבדה. גילוי שפעת ערכות Directigen שפעת (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) ו BinaxNow (Binax, Inc, Scarborough, ME) immunochromatography assay להשתמש כדי לזהות אנטיגן ויראלי כגון nucleoprotein 7. באמצעות ערכות אלו, זיהוי של וירוס יכולה להיות מושגת בתוך 15 דקות, עם זאת, כל הדוגמאות השליליות צריך להיות של עודcreened בשיטת תרבית תאים. מחקרים שונים דיווחו גם רגישות נמוכה של ערכות אלה, במיוחד, כאשר הזיהום היתה קלה או נמוכה 8. בשיטה שלנו, אנחנו באופן עקבי לזהות נמוך כמו 100 PFU של הנגיף. הדבר מצביע על הטכניקה שלנו היא שימושית באיתור הנגיף H1N1 בדגימות קליניות, גם אם הזיהום הוא קל. שיטת הקרינה מבוסס לזהות אנטיגנים נגיפיים דווחה, שם בין אם דגימות aspirate האף והלוע נותחו באופן ישיר או היו מחוסן על monolayer של תאים רגישים לכפל וירוס ניתוחים שלאחר מכן 9. עם זאת, שיטות אלו מוגבלים למטרות אבחון אינם מתאימים חישובים כייל הנגיף. Q-PCR מסייעת לזהות את נוכחותו של RNA ויראלי ולא מעריכים infectivity של וירוסים חיים. לעומת אלה מבחני, IR צבע מערכת מבוססת assay יסייע באיתור ספירה כייל הנגיף בדגימות קליניות במעבדה. במקרה של התפרצות שפעת, זהקריטי לאבחן אלפי דגימות בפרק זמן קצר. השיטה שלנו מבוססת על מגש של כסף 384, גם וסורק IR יכול לסרוק 6 לוחיות בכל פעם (&gt; 2,000 דגימות), ולכן מציע יתרון גדול על פני שיטות אחרות ניאון ישירות. הכדאיות של עיבוד מהיר של אלפי דגימות קליניות יכול להפחית השתנות הבדיקה, משך הזמן assay ועלויות. השימוש נוגדן ספציפי M2 מציעה את היתרון של להיות עצמאית של הבדלים המתח חלבונים H ו N. חלבון M2-נשמרת יחסית זני שפעת רוב מדביק בני אדם. אם נוגדנים ספציפיים כתמים במחזור משולבים עם המערכת שלנו ניתן למדוד הן את כייל הנגיף ולזהות את המתח. עם זאת, מאז M2 הוא יעד עבור Amantadine כמו סמים, יכול להיווצר מוטציות שעשויות לשנות את אתר הקישור של MAB משמש כאן. זה מהווה מגבלה פוטנציאל מערכת זו אצל אנשים מטופלים על ידי תרופות אלו. מרובהמבחני משמשים למנות titers שפעת בדגימות הבדיקה. כדי לחשב titer וירוס, 50% תרביות רקמה מנה זיהומיות (TCID 50) וביצה allantoic נוזל על בסיס מבחני נמצאים בשימוש נרחב 1,10. עם זאת, דרישות של מספר ימים לבצע שיטות אלו פחות אמינים. יתר על כן, שיטות אלה חישובים המבוססים על שינוי של 50% במספר לוחות לספק titrations ויראלי תיאורטיים, אבל לא מדויק. רובד להרכיב מבחני יכול להתבצע בתוך 96 שעות, אולם חוסר שחזור היא הדאגה העיקרית בחישובים titer ויראלי. הטכניקה הנוכחי המתואר כאן יש מספר יתרונות בולטים. ראשית, היא טכניקה לשחזור ביותר עם תוצאות עקביות. שנית, החישובים titer ויראלי מבוססים על כימות פשוט של עוצמות הקרינה, כי הן בהשוואה מול עקומות סטנדרטיות מוגדרות. שלישית, שניים או יותר נוגדנים ראשוניים ניתן לאבחן קפסיד מספר במדגם נתון. כמו כן, IR צבען מצומדות נוגדנים יש מיניםאל autofluorescence ו שימשו במשך תא הדמיה 11. UV או חזותי (300-600 ננומטר) הקרינה גורמת autofluorescence הסלולר גבוהה בשל נוכחותם של גבוהים fluorophores הקוונטים אנדוגניים מניבים. אלה כוללים חומצות אמינו ארומטיות, השאיבה למוצרי פיגמנטים, נוקליאוטידים pyridinic (NADPH), אלסטין, קולגן ו coenzymes לפלבין. מאפיין מהותי של התאים מקשה לנצל את מקורות קרינה כמו בדיקות לכמת את הביטוי של חלבונים ספציפיים. לעומת זאת, כמעט אינפרא אדום צבעים לרגש פולטים בין 670-1000 ננומטר. מולקולות רבות המארחות הסלולר ופחמימנים polyaromatic לא מרגשת באורך גל זה, עקב פיזור אור מופחת, פולטים הקרינה רקע נמוך ביותר. יתר על כן, חלון בין הרקע זיהוי ספציפי הוא השתפר בהרבה בשל מקדם הכחדה גבוהה של קרוב אינפרא אדום fluorophores. Photostability, יחס מעולה האות לרעש, רלוונטי מאוד כימות של titers ויראלי. השימוש microflחדרי uidic יהיה להפוך את תהליך המיון באמצעות הבקרה רובוטיות, ויכול לאפשר לנו לבחון דגימות קליניות מדבק מאוד בקלות. לפיכך, ניצול כמעט אינפרא אדום צבעים בשיטות אלה הוא אידיאלי ואמין מאוד למנות titers נגיפיים בדגימות רקמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 וירוס </td><td></td><td></td><td> מאת ד&quot;ר תומס מורן M </td></tr><tr><td> עיזים נגד העכבר IRDye @ 800 </td><td> LI-COR מדעי החיים </td><td> 926-32210 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> LI-COR אודיסיאה IR סורק </td><td> LI-COR-מדעי החיים </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 בארות קרקעית שטוחה צלחת </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-בארות קרקעית שטוחה צלחת </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM בינוני </td><td> Invitrעוגן </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI בינוני </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 נוגדן </td><td></td><td></td><td> מאת ד&quot;ר תומס מורן M </td></tr><tr><td> Anti-NP MAB </td><td> ה-CDC </td><td> V2S2208 </td><td> שהושגו עם MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

נגיף השפעת הוא פתוגן הנשימה הגורמת רמה גבוהה של כל שנה תחלואה ותמותה בחלקים רבים של העולם. לכן, לאבחון המדויק של זן הדבקה ההקרנה המהירה תפוקה גבוהה של מספר רב של דוגמאות קליניות הוא בעל חשיבות עליונה כדי לשלוט על התפשטות זיהומים מגיפה. אבחנות קליניות נוכחיות של דלקות שפעת מבוססים על בדיקה סרולוגית, תגובת שרשרת פולימרז, immunofluorescence הדגימה ישירה ותרבות 1,2 התא. כאן אנו מדווחים על פיתוח של טכניקה אבחון חדשנית המשמשים לאיתור נגיפי שפעת חיים. השתמשנו העכבר מותאם האדם A/PR/8/34 (PR8, H1N1) וירוס 3 כדי לבחון את היעילות של טכניקה זו באמצעות תאים MDCK 4. תאים MDCK (10 4 או 5 X 10 3 לכל טוב) היה מתורבת 96 - או 384 צלחות טוב, נגועים PR8 וחלבונים נגיפיים התגלו באמצעות אנטי M2 ואחריו IR צבען מצומדות שניותondary נוגדנים. M2 5 ו hemagglutinin 1 הם שני חלבונים סמן העיקריים המשמשים רבים מבחני אבחון שונים. המעסיקים IR-צבען מצומדות נוגדנים משניים ממוזער autofluorescence קשור צבעי ניאון אחרים. השימוש נוגדן אנטי-M2 אפשרה לנו להשתמש בעוצמה אנטיגן ספציפי הקרינה כמו מדד ישירה של כמות ויראלי. למנות את עוצמת הקרינה, השתמשנו LI-COR אודיסיאה מבוסס סורק אינפרא אדום. מערכת זו עושה שימוש בשני לייזר מבוססי ערוץ לתגליות אינפרא אדום כדי לזהות fluorophores ולהבחין בינם לבין רעשי רקע. ערוץ 1 מרגש ב 680 ננומטר ופולט ב -700 ננומטר לסייע לכמת את הרקע. ערוץ 2 מגלה fluorophores שמרגשים ב 780 ננומטר פולטים ב 800 ננומטר. סריקה של PR8 נגועים בתאי MDCK בתוך סורק אינפרא אדום עולה הקרינה ויראלי כייל תלויים בהיר. מתאם חיובי של עוצמת הקרינה על כייל הנגיף החל מ -10 10 2 5 PFU יכול להיות קוןצפו sistently. חיוב מינימלי אך לגילוי לראות באופן עקבי עם 10 -10 2 3 PFU PR8 titers ויראלי הוכיח רגישות גבוהה של קרוב אינפרא אדום צבעים. יחס אות לרעש נקבע על ידי השוואת מעושה נגועים או isotype נוגדנים שטופלו בתאים MDCK. שימוש בעוצמות הקרינה מ 96 - או תבניות צלחת 384 טוב, בנינו עקומות טיטרציה סטנדרטיים. בחישובים אלה, המשתנה הראשון הוא כייל הנגיף תוך המשתנה השני הוא עוצמת הקרינה. לכן, השתמשנו את ההתפלגות המעריכית כדי ליצור עקומת-לנכון לקבוע את הקשר בין פולינום titers ויראלי ועוצמות הקרינה. ביחד, אנו מגיעים למסקנה כי IR צבע המבוסס על מערכת זיהוי חלבון יכול לעזור לאבחן הדבקה של זנים נגיפיים דווקא למנות titer מגורמי המחלה מדביק.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K Views.  Blood Research Institute. שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש 

Video: High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...