이 작품은 CBER / FDA-NIAID / NIH 부처 간 계약 YI-AI-6153-01, FDA / CBER 교내 자금 및 FDA 의료 대책 이니셔티브에 의해 지원되었다. TCT는, MNB는 VPM은, LMS, 그리고 KDK는 미국 에너지 Departmen과 미국 사이의 부처 간 계약을 통해 과학 교육의 오크 리지 연구소에 의해 관리 생물 의약품 평가 연구 센터의 연구 참여 프로그램에 대한 약속에 의해 지원되었다 식품 의약품 안전청.

기본 시리얼 희석 1. 준비 (그림 3A) 참고 : PR / 납 세트 대상 시퀀스를 포함 선형화 플라스미드의 직렬 희석 시리즈 QRT-PCR 분석을위한 양적 기준으로 사용됩니다. IFN 서브 타입에 대한 각각의 표준 용액을 희석 세트는 90 분석 판을 실행하기에 충분한 볼륨이 포함되어 있습니다. 검사에 사용 된 희석 표준 곡선의 네 점은 20-32 (표 3)의 범위의 값 CT를 커버하도록 선택된다. <ol><li> 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 표준 (50 PM)와 연어 정자 DNA (ssDNA를, 10 ㎎ / ㎖) 원액을 원심 분리기. </li><li> 물 20.3 ㎖로 ssDNA를 51 μl를 혼합하여 17 표준 희석 세트의 ssDNA를 / 물 믹스를 준비합니다. </li><li> 표준 희석 세트에 대해 하나의 8 관 PCR 스트립 레이블. 참고 : 주식 솔루션의 표준 희석액의 제조 2 ~ 3 시간이 소요됩니다. </li><li> F에 ssDNA를 / 물 혼합 190 μl를 분배IRST의 스트립 튜브와 나머지 5 개의 튜브에 ssDNA를 / 물 혼합 180 μL. </li><li> 믹스 ssDNA를 / 물 190 μL와 튜브에 50 μM의 표준 재고에서 10 μl를 전송하여 1:20 희석을 수행; 와류 신속하고 PCR 스트립 원심 분리. </li><li> 시리즈의 다음 튜브에 가장 최근에 희석 된 튜브에서 20 μl를 전송하여 1:10의 희석을 수행; 와류 신속하고 PCR 스트립 원심 분리. </li><li> 희석 시리즈의 마지막 튜브까지 단계를 반복 1.6 표준을 받았다. </li><li> 반복 각 표준에 대해 1.3 ~ 1.7 단계를 반복합니다. </li></ol> 아래 표 3 참조 프라이머 / 프로브 (잠 / PB)과 없음 템플릿 제어 2. 준비 (NTC) 근무하는 믹스 (그림 3B) 참고 : 각 1.7 ml의 PR / 납 재고 30 분석 플레이트를 만들 것입니다 재고 믹스 작업 128.6 μL 없음 템플릿 컨트롤 (NTC)를 작업 세트. <ol><li> 홍보 / PB가 근무하는 믹스를 설정 준비합니다. 하지E : PR / 납 세트의 준비 및 NTC 근무하는 2 ~ 3 시간 소요됩니다 주식 솔루션에서 혼합합니다. <ol><li> 스톡 용액의 제조에 대하여 초순수 100 μM의 프라이머 및 프로브를 재현 탁. </li><li> 열일곱 2 ml의 튜브까지 레이블; 분석에 포함 된 각 PR / 납 세트 하나. </li><li> 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 프라이머 (100 μM), 프로브 (100 μM) 및 ssDNA를 (10 ㎎ / ㎖) 원액을 원심 분리기. </li><li> 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 관에 ssDNA를 2 μl를 추가합니다. 해당 정방향 프라이머를 추가 리버스 프라이머, 각 PR / 납 재고 튜브를 작업 세트에 프로브. 붉은 털 원숭이 PR / 납 세트 인간의 IFN 서브 타입과 표 2를 대상으로 홍보 / PB 세트 표 1을 참조하십시오. 각 홍보의 볼륨을 일정하게 물을 추가 / PB 200 μL에게 주식 튜브를 작업 세트. 주 : 추가의 프라이머, 프로브의 양 및 물 PR / 납의 필요한 최종 반응 농도에 의존설정합니다. </li></ol></li><li> NTC 근무하는 믹스를 준비합니다. <ol><li> NTC 작업 주식에 대한 라벨이 5 튜브 PCR 스트립은 혼합합니다. </li><li> 각 홍보 / PB의 14.3 μL 적절한 NTC 근무하는 혼합 튜브로 설정 전송합니다. NTC 우물에 대한 PR / 납 세트 조합은 표 4를 참조하십시오. NTC 근무하는 각각의 물을 추가 128.6 μL에 최종 볼륨을 가지고 혼합합니다. </li><li> 소용돌이 짧게 원심 분리기, 얼음 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 배치합니다. </li></ol></li></ol> 아래 표 4 참조 <ol start="3"><li> 홍보 / PB가 작동 주식을 설정 희석. <ol><li> 각 홍보 / PB의 최종 볼륨을 가지고 물 1.5 ml의 추가, NTC 근무하는 믹스에 필요한 PR / 납 세트의 분취의 제거를 수행하면 1.7 ml의 재고 튜브를 작업 세트. </li><li> 소용돌이 짧게 원심 분리기, 얼음 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 배치합니다. </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 개 웰 분석 플레이트의 제조 <ol><li> 384 웰 분석 플레이트, 분취에 대한 PR / 납 세트와 NTC 믹스의 96 웰 소스 판을 준비합니다. 참고 : PR / 납 동작 스톡 믹스에서 소스 판의 준비 미만 1 시간이 소요됩니다. 각각의 96- 웰 플레이트 소스 여섯 384- 웰 분석 플레이트 (도 3C)를 만들기에 충분하다. <ol><li> 간단히 소용돌이 및 홍보 / PB가 작동 주식과 NTC 근무하는 믹스를 설정 원심 분리기. </li><li> 냉장 96 웰 냉각 블록에서 새로운 96 웰 플레이트를 놓고 각 PR / 납 세트의 우물을 지정 또는 NTC는 우물 (그림 2 참조)가 나타납니다 섞는다. </li><li> 250 μL 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 물을 추가 모든 홍보에 물을 66 μl를 분배 / PB는 (대상 17 4 우물 제외)도 설정합니다. 4 대상 17 우물에 물 82.5 μl를 분배. 물론 모든 NTC 믹스에 물 27.5 μl를 분배. </리&gt; <li> 올바른 PR / (PB)은 96 웰 플레이트의 지정 우물에 주식을 작업 세트 추가 올바른 PR / 납 54 μL가 (대상 17 4 우물 제외) 지정된 PR / 납 세트 우물에 주식을 작업 집합 분배. 대상 (17) 홍보 / PB의 67.5 μl를 분배하면 지정된 대상 17 PR / 납 세트 우물에 주식을 작업 집합. 지정된 우물에 올바른 NTC 근무하는 믹스의 22.5 μl를 추가합니다. </li><li> 콘텐츠 웰의 바닥에 적용되기 위해서는 700 XG에서 1 분 동안 접착 씰 플레이트와 원심 분리기 96- 웰 플레이트 봉쇄. </li><li> 96- 웰 플레이트 어댑터를 사용 볼텍스 믹서에서 96 웰 플레이트를 넣고 1000 rpm에서 1 분 동안 혼합한다. 원심 분리기 700 x g에서 5 분 동안 96 웰 플레이트. </li><li> 같은 날에 사용하는 경우, 그렇지 않으면 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장, 4 ° C에서 어둠 속에서 96 - 웰 소스 판을 보관하십시오. </li></ol></li><li> 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 설정하는 PR / 납을 추가하여 384 웰 분석 플레이트를 준비합니다. 참고 : 96 - 웰 소스 플레이트로부터 6 분석 플레이트의 제조 3 ~ 4 시간이 소요됩니다. <ol><li> 판을 만들기에 앞서, 4 ° C로 냉각 둥지를 사전 차리고 분당 20~25리터 (LPM) 사이에 불고 공기가 80 ° C에 125 ° C에 판 증발기 하단 열 블록을 미리 가열한다. </li><li> 자동화 된 멀티 채널 피펫에 스위치를 두 번 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 IFN 분석 판을 만들기위한 프로토콜을 엽니 다. </li><li> 플랫폼을 설정하려면, 플랫폼 위치 1에서 완전히 전체 피펫 팁 상자를 배치, 위치 4의 96 웰 소스 판, 위치 (6)의 새로운 384 웰 플레이트는 재생 버튼을 눌러 실행을 시작합니다. 참고 : 실행이 완료되면, 각이 잘 홍보 / PB 믹스의 5 μl를 포함합니다. 참고 : ssDNA를의 최종 금액은 384 웰 분석 플레이트의 웰 당 추가 0.025 μg의입니다. </li><li> 부드럽게 웰의 바닥에있는 유체를 보장하는 평평한 표면 384- 웰 분석 플레이트를 누르고 접착제를 적용판 인감. </li><li> 원심 분리기 700 x g에서 1 분 동안 접시입니다. 판 드라이어로 384 웰 분석 플레이트를 배치, 접착제 플레이트 씰을 제거하고 우​​물 바로 위에 384 웰 매니 폴드를 놓습니다. </li><li> 384 웰 분석 플레이트의 내용 건조, 새로운 접착제 플레이트 씰을 적용 할 때, 사용할 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 호일, 레이블 및 저장소에 포장. 주 : 후판 6 개월 이상 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 반복 단계는 3.2.3-3.2.6 6 × 때까지 384 웰 분석 플레이트는 준비 또는 96 웰 소스 판의 액체가 거의 소모된다. </li><li> 냉각 둥지를 끄고 소프트웨어를 닫고, 자동화 된 멀티 채널 피펫을 끕니다. 판 건조기의 전원을 끄십시오. </li></ol></li></ol> 4.로드 및 384 웰 분석 플레이트를 실행 <ol><li> 잘 HKG, ssDNA를, PCR 마스터 믹스, 물에 대한 PR / 납 세트로 구성 믹스를 두 개의 하우스 키핑 유전자 (HKG)를 준비, (건조 된 384 웰 분석 플레이트에 추가 할 <strong&gt; 그림 3D). 참고 : 믹스의 준비 및 분석 플레이트를로드하는 것은 1 ~ 2 시간이 소요됩니다. 분석 플레이트를 실행하면보다 2 시간이 소요됩니다. <ol><li> 각 HKG 믹스 1.5 ML 튜브 레이블. </li><li> 84.9 μL 물 ssDNA를 (10 ㎎ / ㎖)의 2 μl를 희석. 희석 된 ssDNA를 2 μL, 물 11.8 μL, 마스터 믹스 23 μL 및 HKG 홍보 / PR 각 튜브, 소용돌이, 간단히 원심 분리기로 설정 올바른 20 배의 9.2 μl를 추가합니다. </li><li> 인간의 분석에 대한 HKG로 글리 세르 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH)과 유비퀴틴 C (UBC)를 사용 (재료 표 참조). 붉은 털 분석에 대한 HKG로 GAPDH와 18S 리보솜 RNA를 사용합니다. 주 : 상기 분석을 수행하는 데 사용되는 HKG 유연하고 세포 유형에 적합한 유전자를 반영해야 테스트중인 GAPDH, UBC 및 18S는 일반적으로 사용되는 HKG의 예이다. 다른 HKG 더 적합 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 샘플 및 positi 준비잘 샘플 또는 양성 대조군의 cDNA, 마스터 믹스, 물 구성 믹스를 제어했습니다, 건조 된 384 웰 분석 플레이트에 추가 할 수 있습니다. 샘플을 준비하고 충분한 양의 양성 대조군 믹스 21 판 우물 (그림 3D)에 분배 할 수 있습니다. <ol><li> cDNA 합성에 앞서, DNase의 소화 단계 RNA 샘플을 준비하는 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 제조업체의 지침을 다음의 RNase H (각 시료 24 μL의 최종 부피)으로 처리하여 RNA의 적어도 500 NG의 cDNA 합성에서 사전에 샘플 및 양성 대조군을 준비합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 제조 된 cDNA를 저장합니다. 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 샘플의 cDNA를 원심 분리기. </li><li> 마스터 믹스의 78.8 ㎕를 각 24 μL 샘플 및 양성 대조군 튜브에 물 54.8 μl를 추가합니다. </li><li> 간단히 와동 및 원심 분리 튜브. </li></ol></li><li> 표준을 준비하고 NTC는 물론, 죄수를 혼합마스터 믹스 및 물 sisting은 건조 384- 웰 분석 플레이트 (도 3d)에 첨가한다. 기준을 잘 섞는다를 들어, 1.5 ML 튜브에 마스터 믹스 275 μL에 물 165 μl를 추가합니다. NTC는 잘 섞는다를 들어, 1.5 ML 튜브에 마스터 믹스의 52.5 μL 물 52.5 μl를 추가합니다. 간단히 와동 및 원심 분리 튜브. </li><li> 믹스 및 샘플 로딩 건조 된 384 웰 분석 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 700 x g에서 1 분간 건조 된 384 웰 분석 4 ° C 접시와 원심 분리기를 제거합니다. </li><li> , 냉장 384 웰 냉각 블록에 접시를 놓고 접착제 플레이트 씰을 제거하고 다양한 믹스 및 샘플 (그림 1) 피펫 될 위치를 지정하는 판의 우물을 설명합니다. </li></ol></li><li> 표준 잘 믹스, 표준 384 웰 분석 플레이트를로드, NTC는 물론, 샘플, 긍정적 인 제어, HKG 믹스 (그림 3E)을 섞는다. 소용돌이 짧게 원심 분리기 모든 솔루션 플레이트에 분배하기 전에. <ol><li> 표준의 6 μL 잘 30 μL 전자 멀티 채널 피펫 각 표준에 잘 혼합 분배. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫과 잘 지정에 올바른 표준 용액을 희석의 1.5 μl를 분배. </li><li> NTC의 7.5 μL 잘 30 μL 전자 멀티 채널 피펫과 잘 각각 NTC에 혼합 분배. 30 μL 전자 멀티 채널 피펫으로 지정된 우물에 샘플의 7.5 μl를 분배. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫으로 지정된 우물에 혼합 HKG 홍보 / PB의 2.5 μl를 분배. </li><li> 30 μL 전자 멀티 채널 피펫 남은 물과 마스터 믹스 혼합물의 7.5 μL와 빈 우물을 채우기; 물 7.5 ㎕를 단독으로도 작동합니다. </li><li> 700 × g으로 1 분간 광 접착 필름과 함께 원심 384- 웰 분석 플레이트 봉쇄. 2,600 rpm에서 2 분간 볼텍스 믹서에 밀봉 384- 웰 플레이트 와동및 X g 700에서 5 분 동안 원심 분리. </li><li> , QRT-PCR 기계에 밀봉 된 384 웰 분석 플레이트를 놓고 분석 레이아웃 템플릿을 열고 실행을 시작합니다. 참고 : 결과는 스프레드 시트 또는 분석을 위해 텍스트 파일로 내보낼 수 있습니다. </li><li> 분석을 위해 다음과 같은 최적의 유전자 증폭기 반응 조건을 사용하여 : ⅰ) 50 ℃ 2 분, ⅱ) 95 ° C 10 분 동안, III)을 25 초 동안 95 ° C, ⅳ) 1 분 동안 59 ° C. 반복은 40 사이클 III 및 IV 단계를 반복합니다. </li><li> 스프레드 시트 응용 프로그램 소프트웨어에 QRT-PCR 플랫폼에서 원시 데이터를 내 보냅니다. 선형성을 관찰하기위한 표준 곡선으로 설정 한 각 4 점 기준을 그린다. ΔCq을 계산하여 또는 네 개의 점 표준 곡선 (27)에 따라 복사 번호 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 아래 그림 3 참조

<ol>
	<li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+antiviral+immunity.">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li><li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons,+interferon-like+cytokines,+and+their+receptors.">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li><li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses:+cellular+receptors+and+their+substrates.">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex.">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li><li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes.">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1,+STAT2,+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage.">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li><li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+genes:+a+complex+web+of+host+defenses.">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li><li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses.">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li><li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+soluble+alpha/beta+interferon+(IFN)+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN.">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus.">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li><li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape.">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li><li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+autoimmunity:+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases.">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li><li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy.">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li><li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis.">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li><li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon.">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li><li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+hepatitis+C.">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li><li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li><li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia.">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li><li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia.">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27:+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure.">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha+Acts+on+the+S/G2/M+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line.">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li><li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+(pDCs)+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes:+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production.">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li><li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming.">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li><li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons.">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li><li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons.">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li><li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genomic+data+in+the+discovery,+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family.">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933 (2009).</li><li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent.">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li><li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I,+II,+and+III+interferon+and+their+subtypes.">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li><li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid.">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li><li>Little, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-refractory+mutation+system+(ARMS)+analysis+of+point+mutations.">Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.</a> Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

이 보고서는 설계, 배치 생산 및 연구 실험실 설정에서 매우 유사한 유전자의 집합의 전사를 측정하기위한 분석의 분석을 향해 접근 방법을 설명합니다. 여기에보고 높은 처리량 QRT-PCR 분석은 IFN-γ 및 측정 - 높은 특이 λ 하위 유형. 이 방법은 두 가지 주요 측면, 상동 유전자 가족의 구성원 및 홍보 / PB 세트가 미리로드 안정적이고 일관성있는 384 웰 분석 판의 제작을위한 생산 플랫폼의 개발을 구별 PR / 납 세트의 디자인을 포함한다. QRT-PCR 프로브는 자신의 특이성 (29)을 강화쪽으로 구조 (MB) 또는 화학 물질 (LNA) 접근 방식을 통합합니다. 서스 분석 (표 2)의 프라이머 세트의 두 들어, 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS)은 상기 특이성을 향상 30 프라이머 서열 내로 통합되었다. 그것은 enha에 엑손 - 엑​​손 접합을 대상으로 가장 좋습니다 동안유형 I 유전자는 인트론이 부족 IFN 때문에 QRT-PCR 반응의 후부 특이성이 가능하였습니다. 따라서, 게놈 DNA를 PCR 반응에서 증폭 할 것이고, 이후에 RNA 추출의 DNase 처리에 의해 분해되어야한다. PR / 납 세트의 타깃 영역은 각각의 IFN에 대한 성숙 펩티드의 코딩 영역으로 제한되었다. 때문에 IFN-α 아형, 특히 성숙 펩타이드 지역 중 높은 서열의 유사성, 그것은 특이성을 확인하기 위해 감도를 손상 때때로 필요했다. 특히 다른 IFN-α 서브 타입에 비해 성숙한 펩타이드 성적은 네 개의 고유 한 염기가 IFN-α17와 사건이었다. 대상 IFN-α17 프로브 특이성을 제한하는 여러 아형의 성적 증명서를 결합하는 프라이머를 요구했다. 그 결과, PCR 반응시켜 PCR 시약 및 loweri의 상당한 부분을 차지하는만큼, IFN-α17 이외 아형을 증폭 할IFN-α17 대한 특이 적 프로브의 형광 신호의 진폭 겨. 이러한 IFN으로 매우 유사한 유전자 민감하고 특정 PR / 납 세트를 디자인으로 추가 과제는의 GenBank 데이터베이스에 주석 시퀀스는 디자인시 전체 또는 명시되지 않은 다른 항목이있을 수도 있다는 가능성이다. 다시이 새로 주석 서열 완벽 설계시에 데이터베이스의 시퀀스의 버전과 정렬되지 않은에서 IFN-α17위한 도전이었다. 잠을 설계 할 때 따라서 / (PB)은 예의 검토되지 않은 유전자 세트, 주기적으로 표적 유전자의 최신 주석 서열을 확인하는 것이 현명하다. 마지막으로, PR / 납 셋이 전사되지만 번역되지 될 수 가유를 증폭하지 않도록 할 필요가있다. PR / 납 세트를 설계 한 후, 다음 과제는 17 개국 홍보 / PB의 PCR 조건을 최적화하는 것은 하나의 384 웰 플레이트에 설정합니다. 성적 표준 impor의 아르홍보 / PB 세트의 특이성을 테스트하고 수많은 다른 PCR 반응의 QRT-PCR 조건의 조화를 위해 필수적이 될에 TANT. 성적 기준에 대해 홍보 / PB 세트를 테스트하는 것은 효율성과 감도를 설정; 매우 유사한 발현 유전자를 발현하는 플라스미드 설정 PR / 납 선택적 기능 유전자의 전사를 측정하는 것을 보장 할 필요가있다. 전 사체 수준은 하우스 키핑 유전자 (ΔCq) 내지 반 정량 분석​​ 상대적인 이외에 정량적 분석 수단 (전 사체의 수)를 제공한다. 다중 384- 웰 분석 플레이트로 96 웰 플레이트에서 소스 로봇 멀티 채널 피펫은 정밀도와 플레이트 간 결과의 일관성을 개선한다. 수행이 플레이트에 분주 시약으로 건조 연어 정자 DNA (ssDNA를)를 안정화시키고 장기 기억 PR / 납 세트를 유지 담체로서 사용된다. 플레이트를 건조시켜 또한 반응의 볼륨이 작아결과적으로 귀중한 샘플을 보존하고 비싼 시약의 사용을 감소 재현 가능한 결과, 필요한. 이 단계를 통해, 판의 배치는 6 개월 이상 정밀도와 일관성을 제공하는 조립된다. 판 준비에 따라, 품질 관리 대책은 판의 배치의 일관성을 확인하는 것이 중요하다. 이를 위해, 표준의 추가로 네 세트 접시에 실행됩니다. &quot;5 배 표준&quot;판 성능을 추적하고 개인 판의 표준이 비교되는 데이터 세트를 생성합니다. 각 표준의 열 10 배 희석은 분석 설계시 사용되지만, 공간 고려 네 점은 각각의 분석 플레이트에 표준 곡선에 사용하고, 5 배 표준 플레이트에 대한 것을 요구한다. 또한, 양성 대조군은 플레이트의 무결성을 보장하기 위해 각 플레이트에 포함되어야한다. 일반적으로, 그것은 홍보 / PB의 하나에서 여섯 분석 플레이트를 준비하기 위해 3 ~ 4 시간 소요ource 판; 이 연구 실험실에서 하루에 열두 판을 준비 가능하다. 각 인간 IFN 하위 유형 분석 플레이트 열일곱 PR / 납 세트를 검사하고 다섯 실험 샘플을 수용 할 수 있기 때문에, 어셈블리의 어느 날 3060 실험 데이터 포인트를 생성 할 수있는 능력과 판의 배치를 생산하고 있습니다. QRT-PCR 플랫폼 원시 데이터가 처리 및 자동 분석 미리 디자인 템플릿을 채우기 위해 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어에서 프로그램 스크립트를 사용하여 조립 될 수있다. 이 방법은 손에 데이터를 입력함으로써 방지 복사 오류를 최소화하고 조사 데이터 분석이 아닌 데이터 어셈블리에 초점을 맞출 수 있습니다. 여기에 설명 된 바와 같이, 높은 처리량이 QRT-PCR 분석은 인간 또는 붉은 털 원숭이 샘플 인터페론 아형의 발현을 측정하는 데 적용 할 수있는 다른 화학 종 또는 상동 유전자 세트를 사용하도록 구성 될 수있다. 플레이트 레이아웃의 유연성은 사용자가 프라이머를 변경할 수 있습니다 / 프로브의 유전자를 맞게 설정특정 세포 유형 또는 모델 시스템을 향한 관심. 이 분석은 면역 반응에 관여하는 신호 전달 메커니즘을 해명 병원체를 연구 세포 배양 모델에서 또는 질병 모델의 컨텍스트의 환자 샘플에서 IFN 식 서명을 측정하기 위해 적용될 수있다.

유형 I과 III 인터페론 (IFN)는 모든 척추 동물 1 바이러스 및 기타 병원성 자극와 현재에 대한 면역 반응에 중요하다. 면역 및 비 면역 세포가 응답, IFN이뿐만 아니라, 표현하고 분비한다. 이러한 수신자 같은 수용체 (TLR), 스팅, 그리고 RIG-I 등의 선천성 면역 센서는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP) 3,4 탐지시 타입 I과 III IFN 발현을 유도한다. 인간에서, 내가 IFN 유형은 2,5 복잡한 IFNAR-1 / IFNAR2 수용체에 IFN-β, -ω, -κ 및 IFN-α의 12 하위 유형 및 바인딩을 포함한다. 유형 III IFN은 IFN-λ1, -λ2 및 -λ3을 포함하고 IL10RB / IL28RA 수용체 복합체 (2)에 결합한다. 클래식, 유형 I과 III IFN 다음 STAT1 / STAT2 이종를 모집하고 인터페론 자극 유전자 (ISG) 6의 전사를 시작 각각의 수용체 복합체에 결합한다. ISG 항 바이러스 및 항에서, 함수의 다양한 범위에 관여적응 면역 반응 (7)의 활성화에 증식 활동. 병원체가 회피 파괴 및 IFN 시그널링 경로의 요소를 하이재킹 진화 수많은 메카니즘은 선천성 면역 반응 8 IFN의 중요성을 보여준다. 예를 들어, 우두 바이러스는 야바 같은 질병 바이러스가 I과 III IFN 단백질 (10)를 입력 억제하는 당 단백질을 분비하는 동안 9 IFN 입력 담즙산이 IFNAR-동성와 미끼 수용체를 표현한다. 숙주 방어에서의 역할 외에, IFN 또한 암 감시 및 자동 염증성 질환의 숫자에 연루 유방암 세포에서 IFN의 발현을 사일런 싱 immunosurveillance (11)을 제한, IFN-α의 과잉 생산은 전신의 개발기구는 홍 반성 루푸스 (12), 및 STING의 잘못된 활성화 STING 관련 혈관에 IFN 과도한 양으로 인한 전신 염증에 이르게(13). 치료 적, IFN이 다발성 경화증 (14)을 치료하는 데 사용되며, 이러한 털 세포 백혈병 (18)과 만성 골수성 백혈병 (19) 등의 HBV (15)와 HCV 16, 17, 및 암과 같은 만성 바이러스 성 감염. 특정 생리 학적 과정에서 IFN의 관련성에 대한 질문은 지속적으로이 사이토 카인 가족의 유비쿼터스 특성을 알 수있다. 특히 IFN-α 아형, 종종 하나의 엔티티 20-23로보다는 밀접하게 관련 그룹,하지만 서로 다른 단백질로 간주됩니다 I IFN을 입력합니다. 척추 동물의 진화 (24)에 걸쳐 존재와 IFN-α 서브 타입을 포함하여 여러 IFN 종의 지속성, 이러한 서브 타입의 적어도 일부는 특정 또는 고유 기능을 가지고 있음을 시사한다. 이는 IFN 발현의 패턴 형성 및 해독 아형 (17)의 하나 이상의 특정 기능을 특성화하는 것이 도움이 될 수있다. t 공부의 도전그는 자신의 공유 시퀀스 정체성을 기반으로 I과 III IFN 하위 유형을 입력 : 열두 IFN-α 아형이&gt; 50 % (25)을 공유하고 IFN-λ 아형 자신의 아미노산 서열의 81~96% (26)를 공유 할 수 있습니다. 설명 QRT-PCR 분석에서, 분자 표지 (MB) 및 잠금 핵산 (LNA) 형광 프로브는 매우 유사한 IFN 하위 유형 시퀀스 사이의 단일 염기 쌍의 차이를 구별하고, IFN 식 서명의 특성을 허용. 분석의 384 웰 플레이트 형식은 각각 성적 증명서 사본 번호와 ΔCq에 의한 분석을 가능하게 정량 (전사 기준) 및 반 정량적 (하우스 키핑 유전자 (HKG)) 조치가 모두 포함됩니다. 프라이머 / 프로브 (PR / 납)를 통해 건조 가능한 자동화 된 멀티 채널 피펫 팅하고, 장기 보존에 의해 용이하게 배치 조립체는, 분석의 재현성, 유틸리티, 실용성을 강화 플레이트 상에 설정한다. 이 프로토콜은 프로세스를 설명합니다384 잘 QRT-PCR 분석 플레이트 인간 IFN 서브 타입 (표 1)을 대상으로 최대 17 개국 PR / 납 세트와 (그림 1)의 제조. PR / Pb와 콘텐츠 소스 플레이트 (도 2) 로봇 멀티 채널 피펫을 사용하여 자동화 될 수있는 프로세스에서 여러 분석 384- 웰 플레이트를 제조하기 위해 사용되는 작업 세트. 초기 포커스 인간 IFN 식 서명을 연구하기위한 프로토콜을 만드는 동안,이 방법은 물론 붉은 털 원숭이에 적용되어왔다. 플레이트 레이아웃이 다소 상이하고, PR / 납 세트 (표 2)는 별개이지만, 인간의 붉은 털 플레이트를 만들기위한 전반적인 제조 방법은 동일하다. 프로토콜의 최소의 변경으로, 상기 방법은 밀접하게 관련된 유전자의 다른 그룹을 연구하는 분석법의 개발을 허용하기 위해 수행 될 수있다. 참조 그림 1과 아래 2 표 1 및 표 2를 참조 벨오우

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

QRT-PCR 분석은 세포 유형 및 다양한 상황에서 타입 I IFN 및 III의 발현 패턴을 분석하도록 구현 될 수있는 바와. 예를 들어, 인간의 타입 I IFN 및 III 식 서명 6 공여체 TLR 리간드 자극 된 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 분석 하였다; 폴리 I : C (25 ㎍ / ㎖), LPS (10 NG / ㎖), 이미 퀴 모드 (10 μM)과의 CpG 올리고 뉴클레오티드 (1 μM) (도 4). 데이터는 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어를 사용하여 분석 및 단백질 서열 (27)의 계통에 따라 시계 방향으로 배열 된 IFN-α 아형과 레이더 차트로 제시 하였다. 인간 IFN 발현의 레이더 차트 세이 디자인에 혼입 분석의 두 가지 방법을 사용하여 계산 로그 스케일로 표시된다 : HKG (ΔCq)로 정규화 절대 된 CQ 값, 총 RNA의 마이크로 그램 (μg의) 당 템플릿의 수를 복사 . 카피 수의 값은 O 결과로부터 산출되는<html> FA 성적표의 표준 곡선. 데이터는 TLR 작용제에 의해 유발되는 인간 IFN 발현 서명 특정 리간드 것을 보여준다. 아래 그림 4 참조 인간 IFN 발현 서명을 알 수 있듯이, 유형의 발현 서명은 붉은 털 원숭이의 I과 III IFN은 특정 TLR 리간드했다. 3 시간 (도 5)을위한 C (50 ㎍ / ㎖), LPS (10 ㎍ / ㎖), 및 이미 퀴 모드 (10 ㎍ / ㎖) : 3 공여자 PBMC 폴리 I로 자극 하였다. 기준에 자극되지 않은 세포에서 IFN 아형 발현은 낮았다. C : IFN-γ 아형의 수에는 제한 LPS 및 폴리 I에 대한 응답으로 표현되었다. 대조적으로, 이미 퀴 모드에 응답하여 IFN 발현 높고 하위 표현식 넓은이었다. 세 TLR (28) 작용제 IFN-β와 IFN-λ1의 발현이 향상되었다. 아래 그림 5 참조 항상 &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> 그림 1 :. 열일곱 PR / 납 세트와 384 웰 분석 플레이트의 레이아웃 대상 수는 PR / 납 집합을 의미한다. 네 점 표준 곡선 (어두운 회색 삼각형) 열 1-5에 추가됩니다. HKG PR / 납 세트 (흰색 배경), 컬럼 6, 7 나머지 컬럼에 8-24을 추가 열일곱 PR / 납 세트 중 하나에 특이된다. 샘플은 열 6-24 (검은 색 화살표)에서, 행 AP에 추가됩니다. 열 다섯의 맨 아래에있는 두 개의 우물 (O5, P5 참조)은 물과 마스터 믹스를받을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> 그림 2. 열일곱 PR / 납 집합과 96- 웰 플레이트 소스 레이아웃 대상 번호 PR / Pb를 지칭설정합니다. 홍보 / PB 세트가 여러 우물에 추가 할 때 검은 색 화살표가 나타냅니다. NTC 믹스 지정된 우물 (어두운 회색 배경)에 추가됩니다. 대각선으로 두 개의 우물 (F3, G3)이 사용되지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> 그림 3 : QRT-PCR 분석 프로토콜의 특정 단계의 회로도 AE 다이어그램 프로토콜의 부분을 선택합니다.. (A) 단계 1 : 표준 희석액의 제조. (B) 2 단계 : PR / 납 및 NTC 근무하는 믹스의 준비. (C) 단계 3.1 : PR / 납 세트와 NTC 믹스의 96 잘 작동 주식 판의 준비. (D) 단계 4.1-3 : 384 웰 분석 플레이트를로드하는 믹스의 준비. (E) 세인트EP 4.5 : 384 웰 분석 플레이트로드. 다이어그램은 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 읽습니다. 인터페론 (IFN) 분석 용 시약은 -20 ℃로 저장되고, 왼쪽 칸에 표시됩니다; 프로토콜의 행 별도의 조치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> 도 4 :. 말초 혈 단핵 세포에서 인간 IFN 식 서명 (PBMC)는 TLR 리간드로 자극시키고, RNA는 QRT-PCR 분석을 위해 수확 하였다 자극 PBMC에 사용 TLR 리간드에 대한 응답으로 다르다. 피크 응답의 기하학적 수단은 I를 폴리 : C (25 ㎍ / ㎖) 8 시간 (적색 사각형), LPS (10 NG / ㎖)으로 4 시간 (녹색 삼각형), 이미 퀴 모드 (10 μM)로 16 시간을 연속적으로 ( 자주색 다이아몬드) 소비재 (1 μM)에서16 시간 (검은 색 원), 16 시간에서 비자극 제어 (파란색 원) 6 기증자 (왼쪽) HKG UBC ΔCq의 표현의 함수로 로그 (10) 규모에 표시되거나 RNA의 μg의 당 카피 수로 (오른쪽) . IFN-α 아형 아미노산 서열 유사성의 계통 플롯에 따라 정렬된다. 이 그림은 원래 면역학 및 세포 생물학 (27)에 게재되었다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> 그림 5 :. 말초 혈액 단핵 세포에서 붉은 털 원숭이 IFN 식 서명 (PBMC)를 (사각형, 다이아몬드, 그리고 삼각형으로 지정) 세 개의 붉은 털 원숭이에서 자극 PBMC에 사용되는 TLR 리간드에 대한 응답으로 다른 전혈에서 분리하고, C (50 ㎍ / ㎖) 또는 이미 퀴 모드 (10 ㎍ / ㎖) : 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (10 ㎍ / ㎖), 폴리 I로 자극. 세포는 OPE (0 시간에 수확N 모양) 또는 IFN 발현을 측정하는 TLR 자극 (폐쇄 모양의 3 시간) 후. 유형 I, II 및 III IFN의 성적 수준 (왼쪽) HKG GAPDH ΔCq의 표현의 기능 또는 사본 번호 / μg의 RNA를 (오른쪽)로 로그 (10) 규모에 표시됩니다. 이 그림은 원래 인터페론의 저널과 사이토 카인 연구 28 년에 출판되었다. <img alt="표 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> 표 1. 인간 IFN 프라이머 / 프로브 세트 시퀀스 및 반응 정보 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> 표 2 :. 히말라야 원숭이 IFN 프라이머 / 프로브 세트 시퀀스 및 반응 정보 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> 플라스미드 농도 (FM) </td></tr><tr><td></td><td> </td><td> B </td><td> C </td><td> 디 </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2,500 </td><td> (250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> (250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> (250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> (250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> (250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>(250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> (250) </td><td> (25) </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 표준 희석 세트 농도 정보를 제공합니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN PR / 납 세트 추가 </td><td> 물 볼륨 추가 (ML) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC (5) </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC (6) </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC (7) </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC (8) </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC (9) </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC (10) </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> 표 4 : NTC 근무하는 정보를 혼합합니다.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes at JoVE.com

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K 조회수.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

비디오: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

연구

면역학 및 감염병학

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

라벨-무료 3 차원 양적 위상 이미징 사용 하 여 림프 구의 식별 및 기계 학습

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

호스트-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 고처리량 전사 분석

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...